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基因芯片技术
基因芯片(又称DNA芯片、生物芯片)是随着人类基因计划的逐步实施和分子生物学的迅猛发展应运而生的.基因芯片技术综合了分子生物学、半导体微电子、激光、化学染料等领域的新科学技术[1],是当今世界高度交叉、高度综合的前沿科学与研究热点.
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Luminal亚型乳腺癌细胞与正常乳腺细胞的circRNA表达谱差异分析
目的 探讨环状RNA(circRNA)在Luminal亚型乳腺癌细胞与正常乳腺细胞中表达谱的差异.方法 分别提取Luminal亚型细胞MCF7和正常乳腺细胞MCF10A的总RNA;使用NanoDrop ND-1000对total RNA质量进行检测,用核糖核酸酶R分解total RNA以除去线性RNA并富集circRNA;利用随机引物法扩增富集的circRNA并转录成荧光cRNA;将荧光标记cRNA杂交到circRNA微阵列芯片上,扫描得到两种细胞的circRNA表达谱;在Agilent Feature Extraction软件中进行原始数据提取,并对采集到的阵列图像进行分位数归一化和后续数据处理,进行火山图和聚类热图分析;后,选取差异表达倍数较高的3条circRNA进行实时荧光定量PCR(qPCR)鉴定.结果 提取的MCF7和MCF 10A细胞总RNA纯度高、完整度较好;扫描微阵列芯片上标记的荧光信号,发现两种细胞的circRNA表达谱明显不同;与MCF 10A细胞相比,在MCF7细胞的全部12 910条circRNA表达归一化结果中,有5964条上调,81条表达水平一致,6865条下调;表达差异(Log fold change)在2倍以上的有343条,其中213条上调,130条下调;表达差异在5倍以上的有9条,其中8条上调,分别为:hsa_circRNA_061260 (6.02倍)、hsa_circRNA_103933(5.96倍)、hsa_circRNA_005239 (5.84倍)、hsa_circRNA_100689(5.69倍)、hsa_circRNA_004087(5.60倍)、hsa_circRNA_104420 (5.25倍)、hsa_circRNA_104421 (5.13倍)和hsa_circRNA_1 01222 (5.03倍),1条下调:hsa_circRNA_104864(5.09倍);经qPCR鉴定hsa_circRNA_ 100689、hsa_circRNA_005239和hsa_circRNA_ 104864的差异表达趋势与芯片结果相符.结论 Luminal亚型乳腺癌细胞与正常乳腺细胞的circRNA表达差异较大,其中表达上调或下调的circRNA有望成为Luminal亚型乳腺癌诊断的新靶标.
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差异基因表达谱分析颈动脉不稳定斑块相关基因及可能的信号通路
目的：探讨颈动脉不稳定斑块发生的分子机制。方法从ArrayExpress数据库下载基因表达谱数据E-MTAB-2055。该数据包含24例颈动脉不稳定斑块和24例稳定斑块组织，从中筛选差异基因，并通过富集分析获取与不稳定斑块有关的生物学过程和通路。同时，通过构建差异表达基因的生物网络来寻找与该疾病高度相关的风险模块，并用荧光定量PCR法检测五对不稳定斑块和斑块旁标本，验证风险模块中部分基因的差异表达。结果不稳定斑块中发生显著性差异表达变化的基因共有439个，其中上调基因为232个，下调基因为207个。涉及到的生物学过程和通路大部分与炎症和免疫应答有关。生物网络和模块分析提示CXCR4、VCL和TYROBP可能在不稳定斑块发生发展过程中发挥着重要作用。荧光定量PCR结果显示CXCR4和TYROBP基因表达情况与芯片数据分析结果一致。结论本研究比较完整地揭示了不稳定斑块差异表达谱特征和所涉及的生物学过程和信号通路，其中TYROBP可能是不稳定斑块发生发展进程中新的致病基因。
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白纹伊蚊嗅觉受体OR7的基因克隆、鉴定和功能分析
目的 克隆鉴定白纹伊蚊嗅觉受体基因OR7,并对其表达谱和功能进行分析.方法 提取成蚊总RNA,采用RT-PCR技术扩增白纹伊蚊嗅觉受体基因OR7的全长编码基因,并检测OR7在不同虫期和不同组织器官中的表达谱;将OR7基因克隆于真核表达载体pME18s中,转染HEK293细胞,利用钙成像技术初步分析其对气味分子刺激的钙调功能.结果 成功克隆出白纹伊蚊嗅觉受体基因OR7的全长编码基因,经测序得知其编码区序列长度为1395bp;表达谱分析显示,其在蚊幼虫、蛹、成蚊中都有表达,且在雌蚊嗅器中表达显著.钙成像结果显示OR7对气味分子刺激后的钙离子通道有一定的调节功能.结论 克隆出白纹伊蚊的嗅觉受体基因OR7,初步分析显示其在雌蚊中显著表达,并具有对气味分子的识别功能.
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白纹伊蚊miRNA的分离、鉴定及表达谱的初步分析
目的 通过Northern blotting方法验证白纹伊蚊microRNA的存在并分析其不同发育阶段的表达谱.方法 根据miRBase中冈比亚按蚊的已知miRNA序列设计合成6条特异的LNA反义寡核苷酸探针,并用地高辛标记.用mirVanaTM miRNA Isolation Kit分别提取白纹伊蚊卵、一二期幼虫、三四期幼虫、蛹、雄蚊、雌蚊等六个不同发育阶段的Total RNA,15%的尿素变性PAGE电泳分离小RNA,转膜、交联、杂交、检测.结果 共检测到5种miRNA的表达,其中包括3种保守的miRNA,2种蚊虫特异的miRNA,其表达方式既有组成型表达又有期特异性表达,如miR-184在各个阶段均有表达,let-7在幼虫后期才开始有表达,miR-9a主要在卵及幼虫阶段表达,miR-M1只在蚊虫卵期有表达,miR-1175在除卵期之外的其他阶段有表达而miR-1174未检测到有表达.结论 首次验证了白纹伊蚊中miRNA的存在,初步证明了miRNA在白纹伊蚊发育过程中的保守性和特异性,为白纹伊蚊胚胎生长、变态发育等生命进程的研究以及新的杀虫剂的研制提供了新的思路和方法.
关键词： 白纹伊蚊 miRNA Northern blotting 表达谱 -
血栓反应素hPWTSR与胃癌的关系
目的 研究人类血栓反应素hPWTSR的生物学功能,探讨hPWTSR在人类胃癌发生发展中的可能作用及作为诊断和干预位点的潜在价值.方法 以pLexA-hPWTSR作为诱饵,在pB42AD-胎脑cDNA文库中利用酵母双杂交检测其相互作用蛋白.揭示hPWTSR的功能与功能途径;利用RT-PCR技术检测胃癌细胞系和临床样本中hPWTSR的表达情况,评估hPWTSR作为胃癌诊断参考标记的潜在价值.结果 扫描107个独立克隆分离到57个hPWTSR的相互作用克隆.PCR在57个克隆获得扩增,随后的序列分析发现57个独立的阳性克隆代表12个基因产物.基于RT-PCR的表达谱分析发现.hPWTSR在胃癌细胞系和临床标本中的表达水平有不同程度的下降.结论 hPWTSR的相互作用蛋白谱提示其参与细胞黏附、信号传导等多种生物学过程,因而可能与肿瘤的发生具有一定的功能联系;hPWTSR在胃癌细胞系和胃癌样本中的表达水平不同程度下降提示其是一个潜在的胃癌标记物,但是在胃癌发生及发展过程中的分子作用机制及确切的临床价值有待进一步的功能研究和大样本的临床表达谱研究来证实.
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陈旧性心肌梗死患者外周血单核细胞相关基因的生物信息学分析
目的:应用生物信息学的方法对陈旧性心肌梗死(OMI)患者外周血单核细胞的相关基因进行分析.方法:下载基因芯片数据集GSE62646,利用GEO2R、DAVID及STRING等分析平台筛选差异表达基因,并进行基因本体(Go)分析、信号通路(KEGG)分析及蛋白-蛋白相互作用网络(PPI)分析.结果:与冠心病稳定期相比,OMI共筛选出9个上调基因和74个下调基因,下调基因主要富集于炎症反应、免疫应答、核糖体构成及mRNA分解代谢等生物学过程.结论:心肌梗死陈旧期相比冠心病稳定期及心肌梗死急性期的基因表达存在明显差异,其炎症基因表达较稳定期下降.
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miR-133a在结肠癌组织中的表达
目的 探讨miR-133a在结肠癌组织和癌旁正常组织中的表达差异,为研究其在结肠癌中的作用奠定基础.方法 采用miRNA芯片分析结肠癌组织和癌旁正常组织中miR-133a的表达水平,并运用实时荧光定量PCR验证其结果.结果 miRNA表达芯片发现miR-133a在结肠癌组织中较癌旁正常组织表达下调,并被实时荧光定量PCR所证实.结论 miR-133a在结肠癌组织中表达下调,提示其可能作为抑癌因子参与结肠癌的发生发展.
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循环miRNA在结直肠癌诊断中的应用价值
结直肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，早期症状不明显，且目前缺乏有效的敏感性诊断指标，早期诊断率较低。随着近年来分子生物学的飞速发展，发现一类微小RNA（miRNA）与大肠癌关系密切，且其在血液循环中稳定表达，显示出特异的 miRNA 表达谱。从而使外周血中miRNA有望成为诊断结直肠癌潜在的新型生物标志物。本文就循环miRNA在结直肠癌中的诊断筛查、预后监测方面的进展做一综述。
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miRNA在宫颈癌早期诊断中的应用及其价值探讨
宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,在世界女性癌症发病率中排第2位,病死率排第5位[1].宫颈癌的发生、发展和转归是一个极其复杂的多阶段、多基因调控异常的过程.研究[2]表明miRNA在细胞代谢、增殖、分化和凋亡等生物学过程中发挥着重要的调节作用,miRNA能够识别特定的目标mRNA,并在转录后水平通过促进靶mRNA的降解和(或)抑制翻译过程而负性调控基因表达的过程,发挥着类似癌基因或抑癌基因的作用,参与人类肿瘤的发生和发展.miRNA的表达谱亦存在组织特异性,其差异性表达谱的研究对于宫颈癌的早期诊断及其机制的阐明具有重要意义.
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miRNA 与肾小球疾病研究进展
肾小球疾病系指一组有相似临床表现(如蛋白尿、血尿、高血压等),但病因、发病机制、病理改变、病程和预后不尽相同,病变主要累及双肾肾小球的疾病,是我国慢性肾衰竭的主要原因。一般认为,免疫机制是肾小球疾病的主要机制之一。MicroRNA(miRNA)是近年来发现的非编码 RNA,与免疫调节有关,参与多种疾病的发生发展过程。研究表明 miRNA 与肾病综合征、IgA 肾病、糖尿病肾病、狼疮性肾炎等多种肾小球疾病有关。本文就 miRNA 在肾小球疾病中的作用进行综述。
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急性髓性白血病全基因组miRNA表达谱研究
目的：通过比较微小RNA（miRNA）在急性髓性白血病（AML）与对照组骨髓样本中的表达情况，发现在AML中异常表达的miRNA。方法提取骨髓样本总 RNA ，应用Illumina高通量测序技术对15例 AML患者（AML组）和10例骨髓象正常的贫血或发热原因待查患者（对照组）骨髓样本中的miRNA 表达水平进行检测，分析比较二者miRNA表达的差异。结果 AML 样本与对照样本间差异表达的 miRNA 共307种，其中232种miRNA在AML组呈表达上调，75种miRNA呈表达下调。结论多种miRNA 在AML患者的骨髓样本中异常表达，提示它们可能在AML发生和发展过程中起重要调控作用。
关键词： 急性髓性白血病 微小RNA Illumina测序 表达谱 -
应用寡核苷酸芯片对乙型肝炎病毒转染HepG2细胞基因表达谱的研究
HBV与肝细胞之间相互作用的分子机制还不清楚,对HBV蛋白调控宿主细胞基因表达情况也了解甚少.本实验选用基因芯片进行HBV基因表达谱改变的研究,筛选HBV感染应答基因,探讨HBV感染的分子致病机制,寻找预防和治疗HBV感染的靶点.
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核不均一核糖核蛋白AB与互作蛋白KRAB相关蛋白1在原发性肝细胞肝癌中的表达谱及其临床意义
目的 研究核不均一核糖核蛋白AB (hnRNPAB)在人肝癌细胞系中的互作蛋白谱,探讨hnRNPAB/KRAB相关蛋白1(Kap1)的共表达谱与肝癌患者临床病理特征之间的相关性及其在预测患者术后复发转移的临床价值. 方法 质谱分析与多肽比对确定与hnRNPAB蛋白结合的Kap1蛋白肽段,免疫共沉淀验证两者的蛋白相互作用;免疫组织化学染色方法检测,hnRNPAB和互作蛋白Kap1在组织芯片中的表达谱,分析其与临床病理特征及预后的关联性.计数资料比较采用x2或Fisher精确概率法;计量资料比较用两组间比较的t检验或wilcoxon符号秩检验;生存率的判定使用Kaplan-Meier方法,差异性使用Log-rank检验评估. 结果 免疫共沉淀联合质谱技术鉴定出Kap1是hnRNPAB蛋白在人肝癌细胞中的结合蛋白之一,两者之间存在蛋白相互作用.生存分析结果显示Kap1高表达组肝癌患者术后5年总体生存率为36％,显著低于Kap1低表达组患者的59％,差异有统计学意义(HR=1.67,P＜0.001);其累计复发率为72％,显著高于Kap1低表达组患者的54％(HR=1.66,P=0.001).单因素统计分析结果显示单独的hnRNP AB、Kap1以及两者联合均是肝癌患者术后生存和复发的独立预后影响因素,差异均有统计学意义(HR分别为1.35和1.28,P值均＜ 0.05);联合hnRNPAB和Kap1对术后生存和复发的预测价值高于单个指标,差异均有统计学意义(HR分别为1.24和1.27,P值均＜0.05). 结论 在人肝癌细胞中hnRNPAB与Kap1形成蛋白复合体;HnRNPAB联合Kap1是非常好的独立预后指标,能准确预测肝癌患者术后的预后不良.
关键词： 肝肿瘤 核不均一核糖核蛋白AB KRAB相关蛋白1 表达谱 预后 -
APP代谢通路关键基因在非洲爪蛙早期胚胎中的时空表达
目的:Aβ的沉积是形成老年斑的主要原因,同时是阿尔茨海默病的主要病理标志物.Aβ形成来源于该病的主要致病基因淀粉样前体蛋白APP(Amyloid beta precursor protein;XB-GENE-479158;NCBI:XI.8671),APP在非洲爪蛙早期胚胎时空表达图式目前还不清楚,之前的报道只在某些手术分离的组织中用RT-PCR的方法进行了研究,为进一步在爪蛙中研究这类基因在发育过程中的时空表达及可能的功能,展开了本研究.方法:本研究收集了第2期到第4期非洲爪蛙胚胎包括(卵裂期、囊胚期、原肠胚期、神经轴胚、尾牙期和蝌蚪期),通过整体胚胎原位杂交和半定量RT-PCR检测基因APP在胚胎发育不同时期的时空表达,用双荧光素酶报告基因系统检测APP启动子活性.结果:APP有2种主要的转录产物,短的693～694个氨基酸,长的有750～751个氨基酸,主要差别来自外显子7的可变剪切.其中短的剪切体是主要转录的产物,而长的一个剪切体则表现为持续的低表达.整胚的原位表达结果显示:在神经板阶段,APP主表达在孵化和黏液腺中.神经管闭合后,APP转录水平升高,在体细胞中胚层,前肾和背侧神经管中呈现高表达.在尾芽末期,APP在晶状体、端脑、松果体、间脑和背侧耳泡中表达.在蝌蚪期,APP主要在包括胰腺、胃和十二指肠在内的消化系统中高表达.结论:APP是一个母源性表达的基因,其时空表达分布的特异性预示其在相关部位发育过程中可能发挥重要作用,从而为研究阿尔茨海默病的关键致病基因在胚胎早期的所发挥的作用提供了新的路径.
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肝癌细胞对人未成熟树突状细胞基因表达谱的影响
目的:检测肝癌细胞微环境对人未成熟树突状细胞(immature dendritic cells,imDCs)基因表达谱的影响.方法:采用免疫磁珠阴性选择从人外周血分离CD14+单核细胞,在体外经粒-巨噬细胞采落刺激因子和白介素4诱导培养分化为imDCs,与Bel 7402肝癌细胞在Transwell中共培养48 h后,抽提imDCs的总RNA,利用人树突状细胞基因芯片检测其基因表达谱的变化.结果:与肝癌细胞共培养后,共有1 531个基因的表达发生改变(与对照组相比,变化表达倍数≥2),其中上调598个,下调933个,这些基因主要涉及信号转导、免疫应答、细胞黏附等功能.结论:肝癌细胞微环境能够影响imDCs多个基因的表达,这些基因的功能与imDCs的分化、成熟和功能有关,为进一步深入研究肝癌细胞对DCs免疫功能影响的分子机制奠定了基础.
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非阻塞性无精症患者血清miRNA表达谱分析研究
目的 分析非阻塞性无精症患者和正常捐精者血清miRNA的表达水平.方法 采用miRNA表达谱芯片分析非阻塞性无精症患者和正常捐精者血清miRNA,应用GenePix proV6.0软件进行数据处理与分析,寻找差异表达的miRNA,并采用实时定量PCR进行验证.确认的miRNA.通过生物信息学软件进行靶基因预测.结果 非阻塞性无精症患者和正常捐精者比较共有71个miRNAs表达有差异.血清中升高的miRNAs有47个,降低的miRNAs有24个.实时定量PCR验证了芯片的准确性,生物信息学软件靶基因预测表明,这些差异miRNA的潜在靶基因均参与精子发生.结论 非阻塞性无精症血清miRNA存在特异性miRNA,有助于精子发生的分子机制研究.
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肝细胞性肝癌相关miRNA的筛选和鉴定
目的 检测正常肝细胞与肝癌细胞中微小RNA (microRNA,miRNA)的表达差异,探讨其参与肝癌发病的可能机制.方法 首先利用miRNA微阵列试剂盒,以正常肝细胞株L02为对照,筛选出肝癌细胞株HepG2中差异表达的miRNA,然后采用定量RT-PCR以及另外1株肝癌细胞株Huh7对筛选结果进行验证,后选取肝癌细胞特异性的miRNA,运用生物信息学技术对其靶基因进行预测,并对其靶基因功能进行分类.结果 发现9种表达下调的miRNA,分别为let-7a、miR-10a、miR-107、miR-124a、miR-132、miR-133a、miR-154、miR-302c、miR-373.靶基因预测结果显示其主要参与了19种生物学事件,且大部分生物学事件与肿瘤的发病机制有关.结论 发现肝癌细胞中9种表达下调的miRNA,且其潜在靶基因参与的生物学事件中的大部分与肿瘤的发病机制有关.
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AK078438基因克隆表达、组织分布和亚细胞定位
目的 研究AK078438基因的克隆表达、组织分布和在不同肿瘤细胞中的表达及该蛋白的亚细胞定位.方法 应用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)方法扩增AK078438基因的全长开放阅读框(open reading frame,ORF),原核表达系统表达,亲和层析纯化该基因的融合蛋白,半定量RT-PCR方法在mRNA水平检测该基因在正常小鼠组织、肿瘤细胞以及间充质干细胞的分布.构建该绿色荧光融合蛋白的真核载体转染细胞,观察该蛋白在细胞中的定位.结果 AK078438基因全长ORF为1065 bp,编码355个氨基酸.mRNA水平上,该基因表达于小鼠的大脑、子宫、结肠、肾脏、睾丸和骨髓,在心脏、脾脏、肺、肝脏、胃中不表达.在小鼠结肠癌细胞株C26、黑色素瘤细胞株B16、小鼠Lewis肺癌LL/2,间充质干细胞中均有表达,在小鼠肝癌细胞系Hepa,小鼠骨髓细胞瘤NS-1中不表达.该蛋白定位于细胞质中.结论 对AK078438的蛋白表达、亚细胞定位、表达谱等分析为进一步研究该基因的功能奠定了基础.
关键词： AK078438基因 表达谱 亚细胞定位 连接条结构域 -
KIR在NK-92MI及K562细胞中的基因型及表达谱分析
细胞及NK-92MI细胞均携带KIR2DL1、 2DL2、 2DL3、 2DL4、 2DS2、 2DS4*003-006、 3DL1、 3DL2、 3DL3.NK-92MI细胞表达KIR受体, K562细胞不表达上述KIR, KIR呈细胞特异性表达.
关键词： 杀伤细胞免疫球蛋白样受体 基因型 表达谱
