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变形期非洲爪蛙嗅觉系统胶质原纤维酸性蛋白和波形蛋白的时空表达
目的研究非洲爪蛙(Xenopus laevis)在变形期(48～63期)嗅觉系统中胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和波形蛋白(vimentin)的时空表达与特点.方法取发育48期(stage)到63期不同阶段幼蛙及成年蛙嗅觉系统组织,常规制成冰冻切片,选每张切片上同时包含鼻、嗅神经、嗅球的切片进行GFAP、波形蛋白等抗体的免疫荧光化学染色,用荧光显微镜观察、记录结果.结果非洲爪蛙进入变形期(48期)后,嗅神经呈GFAP-IR强阳性反应,但在嗅球,仅嗅神经层为GFAP-IR阳性反应,嗅小球(glomeruli)呈GFAP-IR阴性反应;而波形蛋白-IR阳性细胞的分布与GFAP-IR阳性细胞相反,在嗅小球可见典型的波形蛋白-IR阳性的放射状胶质细胞,而嗅神经却是波形蛋白阴性.结论发育过程中GFAP与波形蛋白免疫反应阳性细胞呈互补的方式分布在蛙嗅觉系统中,即GFAP-IR阳性细胞主要分布在嗅觉系统的周围部分,而波形蛋白-IR阳性细胞则主要分布在嗅觉系统的中央部分.
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结蛋白对非洲爪蛙胚胎早期发育的影响
目的:探讨结蛋白对非洲爪蛙胚胎早期发育的影响.方法:利用实时定量RT-PCR和原位杂交方法检测结蛋白在胚胎发育各阶段的表达;通过显微注射特异性反义寡核苷酸进行敲降,利用原位杂交和实时定量RT-PCR方法检测各胚层标志基因表达的变化.结果:结蛋白低水平表达起始于囊胚期,自神经胚期起表达量增加,在随后的发育阶段持续高表达;结蛋白敲降导致胚孔闭合延迟,胚层相关标志基因的表达受抑制.结论:结蛋白自囊胚期起表达于非洲爪蛙胚胎发育各阶段,敲降结蛋白导致胚胎发育迟缓,胚层分化受抑.
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ETS1对非洲爪蛙早期胚胎发育的影响
目的:通过在非洲爪蛙胚胎中过表达ETS1探讨该基因对爪蛙胚胎早期发育的影响.方法:将克隆PCR获得的ETS1全长片段连接到质粒上,获得pCS2+-ETS1质粒;利用RT-PCR和Western blot检测ETS1 mRNA和蛋白在胚胎发育不同时期的表达情况;显微注射ETS1 mRNA入爪蛙胚胎,利用整胚原位杂交、定量PCR检测胚层标志性基因的表达;通过Western blot检测过表达ETS1对细胞凋亡和增殖的影响.结果:ETS1从受精卵时期即已开始表达,在器官形成期表达增强,过表达ETS1抑制了细胞分化以及神经胚期中胚层和外胚层标志基因表达,凋亡相关蛋白表达增加,增殖相关蛋白无明显变化.结论:ETS1表达于非洲爪蛙胚胎发育各阶段,过表达ETS1抑制了中胚层和外胚层发育,促进细胞凋亡但不影响细胞增殖.
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ETS1/2对非洲爪蛙胰腺发育的影响
目的:探讨ETS1/2对非洲爪蛙胚胎胰腺发育的影响.方法:设计并合成特异性抑制ETS1/2表达的反义吗啉代寡核苷酸(morpholino oligonueleitide,MO),通过显微注射的方法将MO转入爪蛙胚胎,利用整胚原位杂交和定量RT-PCR检测标志性基因的表达变化.结果:单独敲降ETS1或ETS2对爪蛙胚胎发育无明显影响,共同敲降ETS1/2后会使爪蛙胚胎发育异常,胰腺标志基因表达上升,肠道标志基因表达下降,肝脏和胃标志基因无明显变化;胰腺标志基因ngn3、igf1、foxa1的启动子区存在ETS1/2的结合位点.结论:单独敲降ETS1或ETS2对爪蛙胚胎发育无明显影响,敲降ETS1/2促进爪蛙胚胎胰腺发育,抑制肠道发育,对肝脏和胃的发育无明显影响.
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APP代谢通路关键基因在非洲爪蛙早期胚胎中的时空表达
目的:Aβ的沉积是形成老年斑的主要原因,同时是阿尔茨海默病的主要病理标志物.Aβ形成来源于该病的主要致病基因淀粉样前体蛋白APP(Amyloid beta precursor protein;XB-GENE-479158;NCBI:XI.8671),APP在非洲爪蛙早期胚胎时空表达图式目前还不清楚,之前的报道只在某些手术分离的组织中用RT-PCR的方法进行了研究,为进一步在爪蛙中研究这类基因在发育过程中的时空表达及可能的功能,展开了本研究.方法:本研究收集了第2期到第4期非洲爪蛙胚胎包括(卵裂期、囊胚期、原肠胚期、神经轴胚、尾牙期和蝌蚪期),通过整体胚胎原位杂交和半定量RT-PCR检测基因APP在胚胎发育不同时期的时空表达,用双荧光素酶报告基因系统检测APP启动子活性.结果:APP有2种主要的转录产物,短的693～694个氨基酸,长的有750～751个氨基酸,主要差别来自外显子7的可变剪切.其中短的剪切体是主要转录的产物,而长的一个剪切体则表现为持续的低表达.整胚的原位表达结果显示:在神经板阶段,APP主表达在孵化和黏液腺中.神经管闭合后,APP转录水平升高,在体细胞中胚层,前肾和背侧神经管中呈现高表达.在尾芽末期,APP在晶状体、端脑、松果体、间脑和背侧耳泡中表达.在蝌蚪期,APP主要在包括胰腺、胃和十二指肠在内的消化系统中高表达.结论:APP是一个母源性表达的基因,其时空表达分布的特异性预示其在相关部位发育过程中可能发挥重要作用,从而为研究阿尔茨海默病的关键致病基因在胚胎早期的所发挥的作用提供了新的路径.
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中间丝蛋白vimentin在非洲爪蛙嗅球发育过程中的表达及意义
中间丝蛋白vimentin在嗅球发育中作用还没有被阐明,本研究目的是探讨vimentin在嗅球发育中时空模式及其意义.选择23～63期幼年和成年非洲爪蛙,做包含嗅神经和嗅球的连续冰冻切片,切片厚20 μm,然后进行vimentin和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光染色,荧光显微镜观察.结果显示,vimentin在发育早期开始表达,一直维持整个变形期及成年.在49期以前,脑室前脚附近的放射性胶质细胞可见呈直的平行状的免疫反应.在变形前期和变形期,嗅球的每一层均可见到vimentin免疫反应,在嗅小球及僧帽细胞层vimentin阳性的放射胶质突起形态上呈丛状.在成年脑室附近的颗粒细胞层vimentin染色强度占优势,这反映了其在不同发育期的功能.结果提示,vimentin阳性的放射性胶质细胞,在早期及变形期可能为嗅神经元轴突的进入和嗅小球的形成提供适应的环境.而在成年,这种激活的胶质细胞可能与嗅球保持很强的再生能力有关.
