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肾上腺皮质增生及腺瘤组织中NF-kB与iNOS基因表达水平研究
目的:探讨核转录因子kB(nuclear transcription factor kB)与诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase)在人肾上腺皮质增生及腺瘤组织中的表达差异.方法:采用定量PCR法检测22例肾上腺皮质增生及14例肾上腺腺瘤组织标本中NF-kB与iNOS-mRNA的表达,以Ct值比较法计算NF-kB与iNOS基因相对表达水平,并进行统计学分析.结果:人肾上腺皮质增生及腺瘤组织中NF-kB与iNOS的mRNA水平明显高于正常组(P均<0.01);增生组及腺瘤组之间NF-kB与iNOS的mRNA表达无明显差异(P>0.01),NF-kB与iNOSmRNA之间的表达呈正相关(r=0.536 P<0.01).结论:人肾上腺增生及腺瘤组织中,高表达的NF-kB和iNOS与其发生发展密切相关;在肾上腺增生及腺瘤组织间,NF-kB与iNOS表达无明显差异,提示肾上腺增生及腺瘤可能为同一疾病的不同发展过程;而NF-kB的活化与iNOS的表达,在发病过程中相互作用、相互制约.
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临床分子生物学技术与应用
临床分子生物学技术成长的过程,就是分子生物学应用于人类疾病的诊断、治疗、疗效观察,及转归、监控过程等方面的一个发展历程.临床分子生物学技术在感染性疾病、肿瘤、遗传疾病等方面均有广泛应用,随着临床分子生物学技术不断完善和发展,分子生物学技术将有更广阔的发展前景.
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膀胱癌患者尿脱落细胞中人巨细胞病毒的定量分析
[目的]初步探讨人巨细胞病毒感染与膀胱癌的关系。[方法]采用一种新的PCR产物定量测定技术，对12例膀胱癌病人，24例健康人的尿脱落细胞病理标本进行人巨细胞病毒(HCMV)的定量检测，并结合临床资料，探讨膀胱癌与HCMV感染的关系。[结果] 12例膀胱癌病人中有8例阳性，24例对照人群中无阳性发现，表明膀胱癌细胞内存在有HCMV基因的DNA。[结论]膀胱癌病人中有较高的HCMV感染，并可能在膀胱癌的发生和发展中起着重要作用。
关键词： 膀胱癌 人巨细胞病毒(HCMV) 定量PCR 脱落细胞 -
超抗原SEA和SEB对正常人TCRVβ基因的限制性取用
金黄色葡萄球菌肠毒素(SE)作为一种超抗原,以MHC非限制性及TCR Vβ特异性的方式激活T细胞.本文用定量PCR方法,分析SEA和SEB刺激的正常人外周血淋巴细胞T细胞抗原受体Vβ的取用格局.揭示在不同HLA遗传背景下,SEA刺激的淋巴细胞均选择性地取用Vβ3和Vβ6两种基因片段,而SEB刺激的淋巴细胞则优势表达Vβ2、Vβ8和Vβ9.通过比较分析,Sigma产的SEB刺激淋巴细胞后则优势表达Vβ3、Vβ4、Vβ16和Vβ20,提示外周血淋巴细胞在超抗原作用下发生寡克隆扩增.
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ATP/GTP结合蛋白1基因在胃癌及食管癌组织中高表达
目的:应用荧光mRNA差异显示技术(DD-PCR),筛选胃癌及食管癌相关基因的异常表达.方法:收集-临床胃癌组织样本,通过荧光差异显示技术(DD-PCR)获得胃癌样品中差异的片段,对这些片段进行克隆和测序.通过在GenBank中同源性检索,查找与差异片段相对应的同源基因.利用半定量PCR及定量PCR方法检验该基因在胃癌及食管癌组织中与其对应正常组织之间表达的差异.结果:通过DD-PCR获得的一个差异表达片段的序列对应于ATP/GTP结合蛋白1基因(A/GTPBPl).半定量PCR及荧光定量PCR技术检测结果表明,A/GTPBPl基因在胃癌及食管癌组织中的表达量高于其对应的正常组织(胃癌,P＜0.01;食管癌,P＜0.01).该基因包含25个外显子,读码框长3561 bp,编码1186个氨基酸,蛋白质相似性分析表明该蛋白为G蛋白家族成员.结论:A/GTPBPl在胃癌组织中异常表达,可能在胃癌发生过程中起调节作用.
关键词： 荧光差异显示 胃癌 食管癌 ATP/GTP结合蛋白1 定量PCR -
乙型肝炎病毒核酸两种PCR定量方法的比较
目的选用PCR-杂交酶免疫法和荧光能量转换PCR法,对它们在乙型肝炎病毒(HBV)DNA定量分析中的灵敏度、特异性及稳定性进行比较研究,以便寻求一种较为精确的定量PCR法.方法分别用上述两种方法测定20份正常人和30份慢性乙型肝炎病人血清中HBV DNA的含量,在检测过程中,用罗氏Amplicor法作为阳性参照,衡量实验体系的稳定性.结果1灵敏度:两种方法的灵敏度很接近,PCR-杂交酶免疫法为4×103拷贝/ml,而荧光能量转换PCR法为3×103拷贝/ml.2.特异性:所有HBsAg、HBeAg、抗-HBs和抗-HBc均为阴性的血清,用两种PCR方法比较,结果相同,血清中HBV DNA均为阴性.3.稳定性:重复实验结果表明,PCR-杂交酶免疫法优于荧光能量转换PCR法,它们的变异系数分别为31.33%和52 06%,两种PCR方法均显示出良好的线性关系.结论PCR-杂交酶免疫法是一种较为精确的定量PCR方法,可用于检测病毒DNA的复制情况,并对评价药物的疗效和疾病的转归,均有一定的帮助.
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定量PCR比较病毒性心肌炎血和心肌肠道病毒RNA含量及其与心肌病变的关系
目的研究小鼠柯萨奇病毒性心肌炎模型血、心肌柯萨奇病毒RNA含量的关系;外周血中肠道病毒RNA含量与心肌病理积分的关系.方法利用定量PCR方法检测病毒性心肌炎小鼠模型急性期外周血、心肌肠道病毒RNA含量.结果 CVB3感染所致心肌炎小鼠外周血、心肌中肠道病毒RNA含量显著正相关(r=0.94,P＜0.01).外周血及心肌中肠道病毒RNA含量与心肌病理积分显著正相关(r=0.80,P＜0.01,r=0.85,P＜0.01).结论病毒性心肌炎急性期外周血中肠道病毒RNA含量可以反映心肌中的病毒RNA含量水平,且两者与心肌病理损害均有一致性改变.
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采用单碱基突变模板作为内对照对组织中mRNA水平进行PCR定量
用PCR方法对原始模板进行单碱基突变,在原始模板DNA的特定位点引入一个EcoR Ⅰ酶切位点.单碱基突变的DNA经PCR扩增后定量、稀释,作为内标加入到样品中与待测DNA同时进行PCR扩增,扩增产物经酶切后电泳,根据电泳结果中不同分子量DNA片段的含量,对样品中待测基因拷贝数进行定量分析.实验结果观察到:每1μg肝脏组织总RNA经逆转录后AVPV1受体cDNA拷贝数约1.25×10-20mol.
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新型静电场采样器采集流感病毒研究
目的:研究新型静电场采样装置采集空气中流感病毒的效率.方法:通过实验室模拟产生病毒气溶胶,使用新型静电场采样器采集并用QPCR方法检测收集液中病毒的浓度,与原液中病毒浓度比较.结果:静电场采样装置对流感病毒的采样效率可以达到26%.结论:新型的静电场器可以用于采集空气中病毒,并可以通过改进提高采集效率.
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DNA聚合酶适配子6-10提高定量PCR的特异性
目的 利用DNA聚合酶适配子6-10进行热启动定量PCR,提高定量PCR的检测灵敏度.方法 适配子6-10组、抗体对照组和非热启动对照组分别进行定量PCR,制作标准曲线,以复相关系数(r2)大于0.99为线性范围,比较其线性范围下限.结果 非热启动定量PCR对人死亡受体5(death receptor 5,DR5)的检测线性范围下限为105拷贝/μl,而适配子6-10(200nmoL/L)与抗DNA聚合酶抗体方法对DR5的检测线性范围下限为103拷贝/μl.熔解曲线分析表明,在扩增高浓度靶分子(105拷贝/μl)时,各种方法非特异扩增均不明显,没有形成非特异峰;在扩增低浓度靶分子(103拷贝/μl)时,非热启动对照组的非特异扩增明显,产生明显的非特异峰,而DNA聚合酶适配子6-10可以明显消除非特异扩增形成的非特异峰.结论 DNA聚合酶适配子6-10可以提高定量PCR的检测灵敏度.
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高转移肺癌细胞株95 D中特异表达的C3orf1基因分析
目的 进一步了解肺癌转移的分子机制,筛选高转移肺癌中差异表达的基因.方法 利用荧光差异显示技术(DD-PCR)获得差异片段,对这些片段进行克隆和序列分析.通过在GenBank中同源性检索,查找差异片段相对应的同源基因.利用定量PCR检测验证该基因表达的差异性,并对该基因的结构进行预测.结果 通过DD-PCR得到9个差异片段,其中一个片段对应于C3orf1基因.定量PCR验证的结果表明,C3orf1基因在高转移肺癌中的表达量显著高于其他被测试的5种肿瘤细胞.该基因的读码框长858 bp,编码285个氨基酸,分子量约32 200.蛋白质结构预测分析发现,该基因含有7个类似表皮生长信号区,N端有一含有24个氨基酸的信号肽,并且还可能有3个2S-2Fe铁氧化还原蛋白铁硫结合信号区,2个维持自身静态平衡的VWFC信号区和2个硫解酶活性区.结论 C3orf1基因在高转移肺癌中异常表达,可能是分泌型的生长因子类蛋白,刺激细胞的生长.
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慢性髓细胞白血病患者染色体分析及bcr/abl融合基因转录本定量的临床意义
目的探讨慢性髓细胞白血病(CML)患者染色体分析与bcr/abl融合基因定量的临床应用价值.方法17例CML患者采用骨髓细胞短期培养法制备染色体,应用G、R显带技术进行染色体分析,同时采用实时定量RT-PCR技术进行bcr/abl融合基因定量检测,并对其中的9例患者进行了跟踪观察.结果全部患者均检出Ph染色体及表达bcr/abl融合基因,阳性患者之间bcr/abl表达水平差异很大.常规药物治疗后稳定于慢性期的4例患者,bcr/abl表达水平轻度上升或下降,未发现新的染色体异常;进入急变期的3例患者bcr/abl表达平均上升了9.06倍,均出现新的附加染色体异常;2例异基因骨髓移植的患者bcr/abl表达水平随临床治疗而发生变化;bcr/abl变化趋势相同而细胞遗传学结果不同的患者,对药物治疗的反应不同,预后也不一样.结论染色体分析结合bcr/abl基因定量较为全面地反映了CML患者的生物学特性,与疾病进展密切相关,对CML的诊断、疗效评价、预后判断反映白血病细胞负荷有较大的临床价值.
关键词： 慢性髓细胞白血病 Ph染色体 Bcr/abl融合基因 定量PCR -
食管癌中高表达的钙结合蛋白1基因的序列分析及意义
目的:筛选食管癌中差异表达的基因,为进一步了解食管癌发生的分子机制奠定基础.方法: 利用荧光差异显示技术(DD-PCR)获得差异片段,对这些片段进行克隆和序列分析.通过在GenBank中同源性检索,查找差异片段相对应的同源基因.利用定量PCR检测验证该基因表达的差异性,并对该基因的结构进行预测和分析.结果:通过DD-PCR得到差异片段中的一个片段对应于人类钙结合蛋白1基因(Cabin1).荧光定量PCR技术检测结果表明钙结合蛋白1基因在食管癌组织中的表达量高于其对应的癌旁组织,在食管癌细胞株TE1中的表达量高于其他被测试的5种肿瘤细胞株.生物软件分析表明:该基因的读码框长6 663bp,编码2 220个氨基酸,至少有4种剪切方式.结论:Cabin1在食管癌组织及食管癌细胞中异常表达,可能在食管癌发生过程中起着重要的作用.
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类风湿关节炎患者外周血单个核细胞中糖酵解相关基因的表达
目的:探讨糖酵解相关基因在类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)中的表达及其意义.方法:选取活动期RA患者19例,稳定期RA患者23例,采用Ficoll法分离PBMC,定量PCR检测糖酵解相关基因表达水平,并与健康对照进行比较.结果:与健康对照相比,活动期RA患者PBMC中糖酵解相关基因丙糖磷酸异构酶(triosephosphate isomerase,TPI)、烯醇化酶(enolase,ENO)、M型丙酮酸激酶(pyruvate kinase muscle,PKM)、单羧酸转运蛋白(monocarboxylic acid transporter member,MCT)表达量均增加(P＜0.05),稳定期RA患者4种基因的表达略有升高,但差异无统计学意义.结论:RA患者存在糖酵解相关基因表达的改变.糖酵解反应有可能在RA疾病机制中具有重要的意义.
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信号传导与激活因子2基因在食管癌中的表达
目的:筛选食管癌中特异表达的基因,进一步了解食管癌发生的分子机制.方法:利用荧光差异显示技术(DD-PCR)获得差异表达的片段,对这些片段进行克隆和序列分析.通过在基因库中同源性检索,查找差异片段相对应的同源基因.利用实时荧光定量PCR技术在食管癌临床标本中进行验证.结果:通过DD-PCR获得的差异片段中有一个片段对应于信号传导与激活因子2(stat2)基因,该基因的读码框长2 556 bp,编码852个氨基酸,编码蛋白分子量约97.9 kD.应用实时荧光定量PCR方法进一步验证发现该基因在食管癌组织中的表达量高于其对应的癌旁组织(P<0.05,n=16).结论:stat2基因在食管癌组织中呈高表达,推测其可能在食管癌的发生发展中起一定的作用.
关键词： 荧光差异显示 定量PCR 食管癌 信号传导与激活因子2 基因表达 -
定量PCR检测类风湿关节炎患者外周血单个核细胞Notch基因表达
目的:探讨4种Notch受体基因在类风湿性关节炎(RA)患者外周血单个核中的表达及其意义.方法:采用免疫磁珠分离纯化RA患者外周血T,B及单核细胞,定量PCR检测4种Notch受体mRNA表达水平,并与正常人进行比较.结果:与正常人相比,RA患者T细胞Notch 2,Notch 3及Notch 4表达量增加(P＜0.01),其中Notch 3主要表达于活化的T细胞,而Notch 1水平在两者间未见明显差异.B细胞及单核细胞4种Notch受体表达均较低,且两者间亦未见显著差异.结论:RA患者存在Notch基因表达的改变,一群高表达Notch 3基因的活化T细胞可能在RA疾病机制中具有重要的意义.
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荧光定量PCR技术测定HBV-DNA与乙肝血清学标志分析比较
近的研究表明,利用荧光定量PCR技术[1]检测乙型肝炎病毒核酸含量是临床预测干扰素、拉米呋啶治疗是否有效的重要指标[2].也是乙肝病毒感染、复制、传染直接的证据.乙型肝炎病毒血清学标志物[3]是临床分析和判断患者病程和传染性的传统依据之一.为了进一步分析乙肝病毒核酸与标志物之间的关系,本文对181份血清进行了检测.现将结果报告如下.
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淡色库蚊抗药性相关基因--NYD-MLC2基因的克隆与分析
目的:获取淡色库蚊抗药性相关基因NYD-MLC2的cDNA全长序列并鉴定其在抗性品系和敏感品系中的表达差异.方法:根据抑制性差减杂交(SSH)结合cDNA芯片分离获得的淡色库蚊抗药性相关NYD-MLC2基因片段序列设计引物,采用快速扩增cDNA末端法(rapid amplification of cDNA ends,RACE)扩增NYD-MLC2基因3'、5'端,经对位拼接获得全长序列,并进行生物信息学分析;荧光定量PCR验证此基因在抗性和敏感品系的表达差异.结果:获得淡色库蚊NYD-MLC2 cDNA全长序列,开放阅读框为630·bp(GenBank/NCBI DQ140391),编码210个氨基酸.蛋白质序列分析显示,NYD-MLC2与冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)一个未知功能的蛋白同源性高,为91%;实时荧光定量PCR结果显示,NYD-MLC2在淡色库蚊溴氰菊酯抗性品系中的表达量是敏感品系的4.08倍.结论:获得淡色库蚊抗药性相关NYD-MLC2基因cDNA全长序列,并证实其在淡色库蚊溴氰菊酯抗性品系中高表达,提示NYD-MLC2与淡色库蚊溴氰菊酯抗药性相关,值得进一步研究.
关键词： 淡色库蚊 抗药性 NYD-MLC2基因 RACE 定量PCR -
淡色库蚊抗性相关基因--NYD-GBE基因的克隆与分析
目的:获取淡色库蚊抗药性相关NYD-GBE基因cDNA全长序列并验证其在抗性品系和敏感品系中的表达差异.方法:根据抑制性差减杂交(SSH)结合cDNA芯片分离获得的淡色库蚊抗性相关NYD-GBE基因片段设计引物,采用快速扩增cDNA末端法(rapid amplification of cDNA ends,RACE)扩增糖原分支酶基因5'、3'端,经对位拼接获得全长序列,并用相应的软件进行生物信息学分析.结果:获得淡色库蚊NYD-GBE cDNA全长序列,开放阅读框为2070 bp(GeneBank/NCBI DQ102 393),编码689个氨基酸.蛋白质序列分析显示,NYD-GBE与冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)和拟暗果蝇(Drosophila pseudoobscura)一个未知功能的蛋白同源性高,为82%和72%,与人糖原分支酶的基因同源性次之为60%.荧光定量PCR结果显示,NYD-GBE在淡色库蚊溴氰菊酯抗性品系中的表达量是敏感品系的19.7倍.结论:获得淡色库蚊抗药性相关NYD-GBE基因全长cDNA序列,并证实其在淡色库蚊溴氰菊酯抗性品系中高表达,提示NYD-GBE与淡色库蚊溴氰菊酯抗性相关,值得进一步研究.
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RPS15a基因在胃癌中高表达
目的：研究核糖体蛋白S15a（ribosomal protein S15a RPS15a）基因在胃癌及癌旁组织中表达差异，为进一步了解胃癌发生、发展的分子机制提供帮助。方法应用荧光定量PCR等方法进一步验证该基因在胃癌及癌旁组织中的表达差异，并在多种肿瘤细胞中的表达量进行比较。结果该基因在胃癌组织中的表达量高于其对应的癌旁组织，但在多种肿瘤细胞中的表达量无显著差异。结论 RPS15a基因在胃癌中呈高表达，说明其可能与细胞恶性生物学行为相关。在多种肿瘤细胞中表达量无显著差异，推测其可能在恶性肿瘤中的高表达具有普遍性。
关键词： 核糖体蛋白S15a基因 胃癌 定量PCR
