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藤黄酸对K562细胞的凋亡诱导及其作用机制研究
本研究探讨蘑黄酸(gambogic acid,GA)对K562细胞的抑制作用及机制.以不同浓度的藤黄酸处理K562和K562/A02细胞;用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测GA对细胞增殖的影响;碘化丙啶(PI)染色分析细胞周期;AnnexinV/PI双染法检测细胞的凋亡;JC-1染色法检测线粒体跨膜电位水平;流式细胞仪检测荧光素激活的caspase-3、caspase-8、caspase-9阳性细胞水平.结果显示:藤黄酸呈时间和浓度依赖性抑制K562细胞增殖.K562/A02细胞(GA＞2 μg/ml)比K562细胞(CA＞0.5 μg/nd)需要更高的蘼黄酸浓度才显示增殖抑制作用.蘑黄酸呈浓度依赖性诱导K562细胞凋亡.藤黄酸0、0.5、1.0、2.0 μg/ml浓度对K562细胞周期未显示明显影响.藤黄酸作用后的K562细胞的线粒体跨膜电位明显降低.藤黄酸2μg/ml作用24小时激活的caspase 3、caspase 8、caspase 9阳性细胞比例与对照相比分别上升2.19%、-1.95%、34.01%;作用48小时分别上升60.4%、71.3%、77.7%.结论:藤黄酸对K562细胞株有显著的抑制作用,该作用是通过诱导细胞凋亡实现的.藤黄酸不影响K562细胞的细胞周期.藤黄酸通过线粒体跨膜电位途径和胞浆激活途径诱导K526细胞的凋亡.
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大黄素对K562细胞抑制增殖和诱导凋亡的作用
本研究观察中药大黄素(emodin)对人慢性髓系白血病K562细胞株的增殖及凋亡影响,探讨P210融合蛋白和caspase-3激活在其中的作用.采用MTT法、集落形成试验观察大黄素对K562增殖的影响;Annexin V FITC/PI法、DNA倍体分析及DNA凝胶电泳法检测细胞凋亡;Western blot检测大黄素作用后不同时间段P210、磷酸化P210、caspase-3前体蛋白及PARP表达水平的变化.结果表明,大黄素能抑制K562细胞增殖,作用48小时的半数抑制浓度(IC50)为38.25 μmol/L;Annexin V FITC/PI法、亚二倍体峰(凋亡峰)及DNA片段化检测证实,大黄素能诱导K562细胞凋亡,并呈量效关系.大黄素作用K562细胞后P210、磷酸化P210、caspase-3前体蛋白表达水平均有不同程度下调,PARP的活性片段85 kD表达增加,这些变化呈时效关系.结论:大黄素能够有效抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡.P210磷酸化抑制,P210表达下调和caspase-3激活可能参与了该过程.
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CpG ODN 2216对白血病缓解期患者外周血单个核细胞的活化能力及活化的细胞对K562细胞的杀伤作用
本研究探讨CpG ODN 2216对白血病缓解期患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMNC)的活化能力以及CpG ODN 2216活化的PBMNC对白血病细胞K562的杀伤作用.取白血病缓解期患者外周血,以淋巴细胞分离液(Ficoll)分离PBMNC,用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液调整PBMNC浓度为2.0×106/ml.对照组加入生理盐水(NS),实验组加入CpG ODN 2216,培养1周,提取上清,用ELISA检测上清中IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-10的水平.取白血病缓解期患者外周血,分离PBMNC,对照组加入生理盐水,实验组加入CpG ODN2216,培养48小时,用流式细胞仪检测PBMNC中淋巴细胞的Th1/Th2,Tc1/Tc2细胞比例;流式细胞术检测活化的PBMNC对肿瘤细胞K562的杀伤能力.结果表明:实验组上清中IFN-γ、IL-12水平与对照组相比有显著差异(P<0.01);IL-4、IL-10水平与对照组相比无明显差异(P>0.05).CpG ODN 2216能刺激白血病缓解期患者PBMNC向Th1/Tcl转化,与对照组相比有显著差异(P<0.01),但对Th2/Tc2无明显的刺激作用(P>0.05).CpG ODN 2216活化的PBMNC对K562细胞的杀伤能力明显高于对照组(P<0.01).结论:CpG ODN 2216可在体外诱导白血病缓解期患者PBMNC分泌Th1型细胞因子,诱导PBMNC向Th1方向转化,并强烈地活化CD8+T细胞应答.CpGODN 2216活化的PBMNC对白血病细胞K562具有较强的杀伤作用.
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人类ERMAP-siRNA对Ara-C诱导K562细胞向红细胞系分化过程的影响
为探讨人类ERMAP基因在红细胞分化发育过程中的作用,本研究设计ERMAP-dsDNA,制备ERMAP-shRNA表达质粒,并建立稳定表达ERMAP-shRNA的K562细胞系(即ERMAP-shRNA/K562细胞系),观察Ara-C诱导ERMAP-shRNA/K562细胞向红细胞系分化过程中,细胞形态、联苯胺染色细胞阳性率和细胞表面标记等的变化,同时以FQ-PCR检测K562细胞人类ERMAP基因表达量的变化.结果发现:经Ara-C诱导72小时,ERMAP-shRNA/K562细胞与对照组比较,体积较大,胞浆量较少,着色大部分呈深蓝色或蓝紫色,部分细胞仍可见1-2个核仁;联苯胺染色阳性率由1.17%增加至2.04%(P＜0.05),但仍低于Ara-C诱导K562组(P＜0.05);CD36-/CD235a+细胞比例从8.83%增至11.28%,CD36+/CD235a+细胞比例从1.23%增至2.64%,CD36+/CD235a-细胞比例从0.59%增至1.47%,均明显低于Ara-C诱导K562细胞组;与此同时,ERMAP-shRNA/K562细胞ERMAP基因的表达量从诱导前的2.52×10-3缓慢增加至诱导72小时后的4.53×10-3,明显低于K562细胞组.结论:ERMAP-shRNA可抑制Ara-C诱导K562细胞向红系分化的过程,这进一步提示人类ERMAP基因与红细胞分化发育过程有关.
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Stathmin和CrkL蛋白在耐阿霉素的K562白血病细胞中表达上调
本研究应用蛋白质组学方法比较白血病K562细胞及其耐阿霉素的K562/A02细胞中蛋白质表达谱的差异,筛选新的耐药相关蛋白.利用荧光差异双向电泳(2D-DIGE)技术分离K562细胞及K562/A02细胞的总蛋白,用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱( MALDI-TOF/MS)对差异表达蛋白质点进行鉴定,搜索蛋白质数据库,获得差异蛋白质的信息,并用蛋白免疫印迹法和实时荧光定量PCR法在蛋白质水平和mRNA水平对差异蛋白质进行验证.结果显示,经过DIGE技术和质谱分析,鉴定出8个蛋白质在耐阿霉素的K562细胞中表达有差异,其中2个表达下调,6个表达上调,它们分别参与细胞能量代谢、细胞增殖、细胞凋亡、细胞信号转导和基因转录等.在表达上调的蛋白中挑选Stathmin和CrkL蛋白,在K562及其耐药细胞株中进行了蛋白免疫印迹实验,结果与双向电泳结果一致;实时荧光定量PCR显示,CrkL在mRNA水平变化与在蛋白质水平变化一致,而Stathmin在mRNA水平变化与蛋白质水平变化不完全一致.结论:白血病K562细胞及其耐阿霉素K562/A02细胞蛋白质表达谱有差异,Stathmin和CrkL蛋白可能与耐药有关,值得进一步探讨.
关键词： Stathmin蛋白 CrkL蛋白 阿霉素 多药耐药 K562细胞 K562/A02细胞 -
特异性抑制Aqp1基因对K562细胞生长的抑制作用
本研究探讨靶向aqpl(aquaporin 1)基因的siRNA对K562细胞生长的抑制作用.设计siRNA,转染K562细胞,在相差显微镜观察细胞形态变化;用MTT法观察aqpl-siRNA对K562细胞活力的影响;使用流式细胞仪、DNA片段化分析K562细胞凋亡;用RT-PCR半定量检测转染前后aqp1基因表达.结果表明:苏木素-伊红染色后,细胞呈现明显的凋亡形态;转染24小时后aqp1-siRNAs对K562细胞的活性有显著抑制作用;aqp1-siRNA转染K562细胞后可见明显的凋亡峰,24、48和72小时的细胞凋亡率持续上升,分别为24.2%、36.1%和42.9%;48小时后aqp1-siRNA组出现明显的DNA凋亡"梯形电泳带";aqp1基因的表达水平在aqp1-siRNA转染后24、48和72小时,分别减少了33%、46%和57%.结论:aqp1-siRNA能够抑制K562细胞的增殖.诱导其凋亡,可作为治疗恶性肿瘤的新靶点.
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IL-2和IL-15刺激脐血NK细胞对K562/Jurkat细胞的杀伤活性研究
本研究旨在探讨脐血(cord blood,CB)NK细胞的杀伤功能及细胞因子IL-2和IL-15对NK细胞杀伤K562/Jurkat细胞活性的影响.采用autoMACS及CD3阴选后CD56阳选两步免疫磁珠分选法从脐血单个核细胞纯化NK细胞,分选后NK细胞用流式细胞仪测定纯度,通过EL-2及IL-2和IL-15两种细胞因子组合培养3天,用LDH释放法检测培养前后脐血NK细胞对白血病细胞株K562和Jurkat的细胞毒活性(效靶比10:1),并记录不同细胞因子培养体系条件下NK细胞的生长状况.结果表明,CB-MNC中CD3-CD56+细胞含量为(14.88±9.2)%,分选后CD3-CD56+细胞含量为(92.39±0.8)%;培养3天后,EL-2组NK细胞形成集落数为148.60±13.0,IL-2复合IL-15组NK细胞形成集落数为831.80±23.0,两者比较,有显著性差异;以K562为靶细胞时,新鲜纯化CB-NK的杀伤活性为(27.76±8.8)%,IL-2组杀伤活性为(61.9±9.1)%,IL-2复合IL-15组杀伤活性为(87.62±3.7)%,差别有统计学意义;以Jurkat为靶细胞时,新鲜纯化CB-NK细胞的杀伤活性为(29.32±2.5)%,EL-2组杀伤活性为(69.43±4.4)%,IL-2复合IL-15组杀伤活性为(92.95±3.2)%,差别有统计学意义.结论:脐血新鲜纯化NK细胞对K562、Jurkat细胞有一定的杀伤作用,但自发细胞毒活性较低,IL-2/IL-15刺激后杀伤活性显著提高,IL-15复合IL-2对促进脐血NK细胞的生长和提高其细胞毒活性明显优于单用IL-2.
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稳定表达HLA-A*1101蛋白的K562细胞株的建立
本研究目的是建立稳定表达HLA-A*1101分子的K562细胞株,为研究慢性髓系白血病(CML)HLA-I限制性抗原特异T细胞的细胞毒作用提供靶细胞.利用RT-PCR从CML患者外周血单个细胞中扩增HLA-A*1101基因全长序列；利用重组PCR将2A肽连接子(D-V-E-X-N-P-G-P)基因连接到HLA-A+ 1101的3’端,并将其定向克隆入带有增强型绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pEGFP-N3,构成HLA-A+ 1101-T2A-EGFP转录盒的重组表达载体；利用电穿孔技术将pEGFP-N3或重组质粒转染入K562细胞,利用荧光显微镜监测绿色荧光蛋白的表达,通过G418筛选出有效转染pEGFP-N3或HLA-A* 1101 -T2A-EGFP载体的K 562细胞株；利用RT-PCR和流式细胞术检测HLA-A* 1101基因和蛋白的表述情况.结果表明,成功构建了以2A肽基因为连接子的HLA-A* 1101-T2A-EGFP真核表达载体；重组质粒转染的K562细胞经G418筛选2个月后,获得2株表达绿色荧光蛋白的K562稳定细胞株HLA-A* 1101 +K562和pEGFP-N3+ K562.RT-PCR检测证明,HLA-A* 1101+ K562细胞表达HLA-A* 1101基因,而pEGFP-N3+ K562细胞则不表达HLA-A*1101；流式细胞术分析显示,HLA-A* 1101和GFP蛋白双阳性HLA-A*1101+K562细胞占88.5％,明显高于pEGFP-N3+ K562细胞(0.698％).结论:建立了一个简单有效地筛选HLA-A+ 1101+ K562细胞株的方法,并成功地建立了膜稳定表达HLA-A*1101蛋白的K562细胞株,为进一步研究CML的特异性细胞免疫提供工具细胞.
关键词： 慢性髓系白血病 K562细胞 HLA-A*1101 基因克隆 基因转导 -
干扰素-α联合高三尖杉酯碱对K562细胞增殖及β-catenin基因表达的影响
本研究探讨干扰素-α(IFN-α)联合高三尖杉酯碱(HHT)对K562细胞增殖、凋亡、细胞周期及β-环联蛋白( β-catenin)基因表达的影响.用IFN-o、HHT单药或两药联合处理后,K562细胞的增殖、凋亡、细胞周期及β-catenin mRNA表达水平分别用MTT法,流式细胞术及RT-PCR方法检测.结果显示,单用HHT能明显抑制K562细胞增殖,诱导凋亡,使细胞阻滞在G0/G1期,β-catenin表达下调,呈时间和剂量依赖性,而IFN-α无此作用.HHT组的β-catenin表达水平为0.5576±0.0373,低于空白对照组(0.9369±0.0142).IFN-α联用HHT组β-cate-nin表达较单用HHT组下调更显著(0.3737±0.0529 vs 0.5576±0.0373,P＜0.05).HHT联合IFN-α对正常人骨髓单个核细胞未见明显毒性作用.结论:IFN-α联用HHT可明显增强后者的抗K562细胞作用,而β-catenin表达下调可能为其作用机制之一.
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金雀异黄素对氯化钴诱导的白血病K562细胞缺氧诱导因子-1α表达抑制作用的研究
为探讨金雀异黄素(genistein,gen)对氯化钴(CoCl2)诱导的人白血病细胞K562缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达的影响,本研究采用低氧模拟剂CoCl2模拟低氧环境.实验分为量-效关系组和时-效关系组,前者CoCl2取0、50、100及150 μmol/L4个浓度点,培养72小时进行检测;后者则在CoCl2取100μmol/L浓度的基础上,选取0、24、48和72小时4个时间点进行检测.gen干预实验分为:①正常对照组;②CoCl2 150 μmol/L组;③CoCl2 150 μmol/L加gen 50 μmol/L组;④CoCl2 150 μmol/L加gen 100 μmol/L;组⑤CoCl2 150 μmol/L加gen 200μmol/L组.培养72小时检测.采用RT-PCR及Western blot的方法分别检测HIF-1α mRNA及蛋白表达水平.结果发现:CoCl2诱导K562细胞HIF-1α蛋白的表达增加,并呈明显的浓度和时间依赖性关系(p＜0.01);而对HIF-1α mRNA的表达无显著影响(p＞0.05);gen呈明显浓度依赖性地抑制CoCl2诱导的K562细胞HIF-1α蛋白表达(p＜0.01).对K562细胞HIF-1α mRNA表达无显著影响(p＞0.05).结论:CoCl2呈浓度和时间依赖性诱导K562细胞HIF-1α蛋白的表达,无论常氧还是在CoCl2诱导下,HIF-1αmRNA呈组成型表达;gen可抑制CoCl2诱导的K562细胞HIF-1α的表达,这种抑制作用与mRNA水平无关,主要在蛋白水平.
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DLL4基因对白血病细胞株K562细胞中YY1和c-Myc蛋白表达及细胞增殖的影响
本研究旨在探讨Notch的配体DLL4基因在白血病细胞株K562中对转录因子YY1和原癌基因c-Myc蛋白表达及细胞生长的影响.实验分正常对照组、阴性对照组(转染质粒pBudCE4.1)和实验组(转染质粒pBudCE4.1-DLL4).转染后48小时,用免疫印迹法和免疫细胞化学法检测外源性DLL4瞬时转染表达水平及YY1和c-Myc蛋白的表达水平;用细胞计数试剂盒-8法检测各组细胞的增殖;转染后48小时用流式细胞仪检测各组细胞的周期分布和凋亡.结果表明,在各组K562细胞中均检测到DLL4、YY1和c-Myc蛋白的表达,实验组的DLL4、YY1和c-Myc蛋白表达量比两个对照组显著增多(p＜0.05);实验组K562细胞的生长速度明显低于对照组;实验组较对照组G0/G1期细胞增多(p＜0.001),凋亡率增加(p＜0.001).结论:DLL4基因能增加细胞转录因子YY1和原癌基因c-Myc蛋白的表达,诱导细胞生长速度减慢、细胞周期停滞于G0/G1期,并能增高凋亡率增加.
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汉防己甲素预防K562细胞获得性耐药机制的研究
本研究从MDR1基因转录调控和细胞凋亡两方面探讨汉防己甲素(TTD)预防K562细胞阿霉素(ADM)诱导性多药耐药(MDR)产生的作用机制.本实验分3组,第1组为K562细胞空白对照组;第2组用ADM作用K562细胞24小时诱导细胞耐药;第3组采用TTD预处理K562细胞24小时后,再用ADM诱导耐药.采用RT-PCR检测各组细胞转录因子c-Jun、YB-1及Survivin的mRNA表达水平;Western blot法检测c-Jun、YB-1的核内蛋白表达水平;流式细胞术检测细胞的凋亡程度.结果表明,0.6μg/ml阿霉素作用后K562细胞MDR1基因转录上调;与空白对照组(第1组)相比,ADM诱导的耐药细胞组(第2组)c-Jun mRNA和蛋白表达减低(p均＜0.05),YB-1 mRNA和蛋白表达明显上调(p均＜0.05);Survivin mRNA表达无明显差异(p＞0.05);细胞凋亡率(8.31%)比空白对照组(0.75%)稍有增加;TTD预处理后再用ADM诱导组(第3组)与ADM作用组相比,c-Jun mRNA和蛋白表达增加(p均＜0.05);YB-1 MRNA和蛋白表达下调(p均＜0.05);Survivin mRNA表达明显减少(P＜0.05),细胞凋亡率(97.2%)明显增加.结论:TTD预防白血病细胞耐药形成的机制可能与其下调YB-1基因和蛋白的表达、上调c-Jun基因和蛋白的表达,从而下调MDR1基因表达有关,另外,TTD与ADM联合作用还能抑制Survivin的表达,增加白血病细胞的凋亡.
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SiRNA干扰β-catenin对K562细胞在体内成瘤能力作用的研究
本研究旨在探讨β-联蛋白(β-catenin)对K562 细胞体内成瘤能力的影响.采用β-catenin序列特异的siRNA下调K562细胞中靶基因β-catenin的表达,将处理后的K562细胞植入BALB/c裸鼠皮下,现察其在裸鼠皮下成瘤率及成瘤曲线.同时用未处理的K562细胞及非特异序列siRNA处理的K562细胞作为对照.结果表明,未处理组(n=9)、对照组(无关序列干抚)(n=8)和试验组(β-catenin特异性干抚)(n=9)成瘤率分别为100%、87.5%和0%,试验组成瘤率与前两组比较有显著的统计学差异(p<0.001).未处理组瘤块体积增长略快于对照组,但2组的瘤块体积增长速度无统计学差异;在试验组未见成瘤.结论:特异性干扰下调β-catenin的表达,影响K562细胞体内成瘤.
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柚皮素对阿霉素损伤的正常血细胞的保护作用
本研究探讨柚皮素对化疗药阿霉素损伤的正常血细胞的保护作用.用MTT法测定柚皮素、阿霉素以及柚皮素联合阿霉素(Post 1小时组、Post 24小时组)应用对K562细胞和正常人外周血多形核白细胞(PMN)的增殖抑制作用,用分光光度法检测正常人外周血PMN和K562细胞裂解上清液中的活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)的水平、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-Px)活性.结果表明:两药联合实验组(Post 1小时组、Post 24小时组)中,柚皮素无明显降低阿霉素对K562细胞的增殖抑制作用.Post 1小时实验组与阿霉素组相比,PMN细胞裂解上清液中的活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)水平明显降低,超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-Px)活性则明显升高;而K562细胞裂解上清液中的氧化应激指标无明显变化.结论:柚皮素对阿霉素损伤的正常血细胞具有保护作用,其可能机制是柚皮素提高细胞内抗氧化物酶活性同时降低氧化产物含量.
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CHIP基因稳定转染人慢性髓系白血病K562细胞诱发有丝分裂异常
本研究旨在建立可稳定高效表达E3泛素连接酶CHIP(carboxyl terminus of Hsc70/Hsp70-interacting protein)的慢性髓系白血病细胞株K562细胞模型,以观察过表达CHIP对细胞生物学特性的影响.采用脂质体介导的方法,经G418筛选及有限稀释法成功建立了可稳定表达野生型CHIP及其TPR及U-box结构域缺失突变体的慢性髓系白血病K562细胞克隆.对过表达CHIP的K562细胞用MTT法检测体外增殖,流式细胞术检测细胞周期,Western blot法检测相关蛋白表达,瑞氏-姬姆萨染色进行细胞形态学观测.结果表明,过表达野生型CHIP对K562细胞体外增殖能力没有明显影响,细胞周期中G2/M期细胞比率增加,CHIP对BCR-ABL激酶的稳定性没有影响,但却明显导致细胞形态异常,表现为细胞体积增大及异常核细胞数目增多,出现异常有丝分裂相等,提示CHIP分子对细胞有丝分裂过程可能具有调控作用.结论:野生型CHIP可诱导K562细胞发生有丝分裂异常.
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二磷酸氯喹对K562细胞增殖与凋亡的影响
本研究探讨二磷酸氯喹时K562细胞增殖与凋亡的影响及其可能的作用机制.用细胞增殖试验(MTT法)检测不同浓度二磷酸氯喹对K562细胞的增殖抑制作用;应用细胞形态学检查、流式细胞术、DNA琼脂糖凝胶电泳观察和检测细胞凋亡;以罗丹明123(Rhodamine 123)为细胞染色剂,采用流式细胞术检测不同浓度二磷酸氯喹处理后K562细胞线粒体膜电位(△Ψm)的变化.结果表明:用不同浓度二磷酸氯喹(1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100 μmoL/L)分别作用于K562细胞24、48和72小时后,细胞生长活力明显降低,具有剂量依赖性;典型的细胞形态学改变、亚G1峰的测出、梯形条带的显现共同证实了二磷酸氯喹能诱导K562白血病细胞凋亡;Rhodamine 123染色显示二磷酸氯喹处理的K562细胞线粒体膜电位强度下降.结论:二磷酸氯喹对K562细胞有生长抑制、诱导凋亡作用,其作用可能与细胞线粒体膜电位(AΨm)下降有关.
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绿色荧光蛋白标记的报告系统优化K562细胞转染条件的研究
本研究旨在提高基因转染人红白血病细胞株K562的转染效率,同时观察绿色荧光蛋白(GFP)作为报告系统用于转染条件优化的可行性.目的基因以GFP为报告系统,通过脂质体转染及电穿孔两种方式转染K562细胞,荧光显微镜下观察并计算转染效率.结果表明:电转染较脂质体转染K562细胞的效率高,电穿孔转染效率在10%左右,而脂质体转染效率小于1%.结论:电转染较脂质体转染K562细胞的效率高,GFP可作为报告系统优化K562细胞转染条件.
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EGFP作为报道基因在研究WT1基因调控元件中的应用
本研究调查EGFP基因作为报道基因在研究WT1因调控功能中应用的可行性.利用基因重组技术分别将WT1基因启动子和增强子的功能片段构建到质粒pEGFP-1载体中,转化感受态E. coli茵细胞,筛选了阳性转化茵落,通过限制性酶切鉴定重组质粒插入片段正确的菌落,抽提重组质粒DNA;同时将重组质粒转染K562细胞,通过荧光显微镜检测重组质粒的功能.结果表明:通过基因重组技术分别构建了含有WT1基因启动子的载体(pEWP)和含有WT1基因启动子和增强子的载体(pEWPE、pEWPA和pEWPD).转染48小时后,pEWP、pEWPE、pEWPA和pEWPD的K562细胞在荧光显微镜下能够显示荧光,而转染了空载体pEGFP-1的K562细胞未出现荧光.结论:EGFP基因作为报道基因可以用于WT1基因调控功能的研究,为进一步开展基因治疗创造了条件.
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HLA-E真核表达载体的构建及其在K562细胞中的表达与鉴定
本研究旨在亚克隆HLA-E真核表达载体,并使其在HLA-I类阴性的靶细胞K562细胞上获得稳定表达.首先采用PCR方法从多顺反子表达载体(pG/A2E)扩增出目的片段A2/E cDNA,与真核表达载体pcDNA3.1(+)重组,构建成HLA-E真核表达载体pcDNA3.1(+)/A2E,然后采用脂质体转染的方法将重组质粒转入K562细胞,后经G418筛选及有限稀释,利用抗HLA-E特异的单克隆抗体K0126-3进行FACS检测,以观察HLA-E分子在靶细胞表面的表达情况.结果显示,HLA-E分子在经pcDNA3.1(+)/A2E转染的靶细胞表面获得表达(27.76%),而经空载体pcDNA3.1(+)转染的靶细胞则未获得表达.结论:成功构建了pcDNA3.1(+)/A2E真核表达载体,并使HLA-E分子在HLA-I类阴性的K562细胞表面表达,为进一步研究HLA-E作用的分子机制以及探索HLA-E与NK受体之间的相互作用和HLA-E体外表达对NK细胞功能的影响奠定了基础.
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人类ERMAP基因在不同细胞系中表达的研究
为了探讨人类ERMAP基因在不同细胞系的表达谱和表达量的特点,选择血液肿瘤、实体瘤、正常组织细胞等不同类型的15种细胞系,在培养的12、24、36、48、60、72小时共6个时间点采集细胞,用荧光定量PCR检测人类ERMAP基因表达量.结果发现,K562细胞在培养12、24小时时ERMAP基因表达阳性,其表达量分别为(5.092±2.331)×106 cps/μl RNA、(5.328±3.916)×106cps/μl RNA;ECV304细胞在培养24小时时ERMAP基因表达阳性,其表达量为(0.84±0.12)×106cps/μl RNA,其余13株细胞系ERMAP基因表达阴性.结论:首次发现人类ERMAP基因在ECV304细胞系中表达,进一步证实ERMAP在K562细胞系中表达.
