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HLA-E真核表达载体的构建及其在K562细胞中的表达与鉴定
本研究旨在亚克隆HLA-E真核表达载体,并使其在HLA-I类阴性的靶细胞K562细胞上获得稳定表达.首先采用PCR方法从多顺反子表达载体(pG/A2E)扩增出目的片段A2/E cDNA,与真核表达载体pcDNA3.1(+)重组,构建成HLA-E真核表达载体pcDNA3.1(+)/A2E,然后采用脂质体转染的方法将重组质粒转入K562细胞,后经G418筛选及有限稀释,利用抗HLA-E特异的单克隆抗体K0126-3进行FACS检测,以观察HLA-E分子在靶细胞表面的表达情况.结果显示,HLA-E分子在经pcDNA3.1(+)/A2E转染的靶细胞表面获得表达(27.76%),而经空载体pcDNA3.1(+)转染的靶细胞则未获得表达.结论:成功构建了pcDNA3.1(+)/A2E真核表达载体,并使HLA-E分子在HLA-I类阴性的K562细胞表面表达,为进一步研究HLA-E作用的分子机制以及探索HLA-E与NK受体之间的相互作用和HLA-E体外表达对NK细胞功能的影响奠定了基础.
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HLA-E cDNA克隆及在LcL721.221细胞的表达
目的克隆HLA-E cDNA,并使其在HLAⅠ类阴性的靶细胞LcL721.221细胞上获得稳定表达.方法用RT-PCR方法从人外周血淋巴细胞扩增出HLA-E cDNA,并通过内核糖体进入位点(IRES)将目的基因亚克隆于已经载有HLA-A2的逆转录病毒表达载体pGCEN上,构建成HLA-A2/E多顺反子表达载体(pG/A2E),采用感染的方法将重组质粒转入LcL721.221细胞,后经G418筛选及有限稀释,利用抗HLA-E特异的单克隆抗体3D12进行FACS检测,以观察HLA-E分子在靶细胞表面的表达情况.结果 HLA-E分子在经pG/A2E转染的靶细胞表面获得明显的表达(88.79%),且显著高于表达HLA-E的对照细胞株JAR(26.21%),而经pG/A2载体转染的靶细胞则未获得表达. 结论成功构建了pG/A2E多顺反子表达载体,并使HLA-E分子在HLAⅠ类阴性的LcL721.221细胞表面获得表达.
关键词： HLA-E 多顺反子表达载体 LcL721.221 先导肽
