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帕罗西汀对抑郁模型大鼠不同脑区环磷酸腺苷反应元件结合蛋白的影响
目的 探讨帕罗西汀在不同用药时间对抑郁模型大鼠海马、前额叶皮质环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)磷酸化(p-CREB)及总蛋白(t-CREB)水平的影响.方法 成年雄性Sprague-Dawley大鼠36只,随机分为6组:对照组、抑郁模型组(以下简称模型组)、抑郁模型+用药1 d组(以下简称用药1 d组)、抑郁模型+用药1周组(以下简称用药1周组)、抑郁模型+用药2周组(以下简称用药2周组)和抑郁模型+用药4周组(以下简称用药4周组),每组各6只.抑郁模型的制作为强迫大鼠游泳4周,每天1次,每次15 min.帕罗西汀的剂量为10 mg/kg体质量,灌胃给药,时间分别为1 d和1,2,4周,每天1次,于每次游泳前用药.采用Western blot法检测各组大鼠海马及前额叶皮质的p-CREB和t-CREB水平.结果 (1)模型组及用药1 d、1周组大鼠海马p-CREB水平明显低于对照组(P＜0.01),用药2,4周组大鼠海马p-CREB水平与对照组的差异无统计学意义(P＞0.05);模型组及各用药组海马t-CREB水平与对照组的差异无统计学意义(P＞0.05).(2)模型组及用药1d和1,2周组大鼠前额叶皮质p-CREB水平均明显低于对照组(P＜0.05),用药4周组与对照组的差异无统计学意义(P＞0.05).模型组及用药1 d、1周组大鼠前额叶皮质t-CREB水平与对照组的差异无统计学意义(P＞0.05),用药2,4周组大鼠前额叶皮质t-CREB水平均明显高于对照组(P＜0.05或P＜0.01).结论 慢性强迫游泳导致大鼠海马及前额叶皮质CREB活性降低,长期使用帕罗西汀可逆转此效应,提高抑郁大鼠前额叶皮质的CREB水平.
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环磷酸腺苷反应元件结合蛋白在吗啡依赖及戒断大鼠脑区的表达
目的研究吗啡依赖及吗啡戒断时环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)在大鼠脑内的表达.方法将15只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为正常对照组、吗啡依赖组和吗啡戒断组,每组各5只.于大鼠背部皮下注射吗啡,第1 天注射20 mg/kg,逐日递增剂量,至第5 天达100 mg/kg,形成大鼠吗啡依赖模型.吗啡戒断组大鼠在末次注射吗啡后16 h皮下注射纳洛酮1 mg/kg.采用免疫印迹法观察各组大鼠的前额叶皮质、伏隔核和海马等脑区CREB的表达.结果 (1)在前额叶皮质,吗啡依赖组和吗啡戒断组CREB的含量(为相对光密度值)分别为[(131±11)%]和[(133±15)%],均高于正常对照组[(100±14)%],差异有显著性(P<0.05);(2)在伏隔核,三组CREB的差异无显著性(P>0.05);(3)在海马,吗啡戒断组CREB的含量[(141±18)%]高于正常对照组[(100±14)%],差异有非常显著性(P<0.01).结论大鼠处于吗啡依赖和戒断时CREB的表达在前额叶皮质和海马发生改变,表明多个脑区CREB表达的调节参与了阿片类物质依赖的形成.
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反义FosB和反义CREB基因抑制左旋多巴诱发异动症大鼠前强啡肽原基因的表达
目的探讨纹状体内转录调控因子FosB基因和环-磷酸腺苷应答元件结合蛋白(CREB)基因对左旋多巴诱发异动症(LID)大鼠前强啡肽原(PDyn)基因表达的影响.方法 6-羟基多巴(6-OHDA)立体定位注射及慢性左旋多巴(L-dopa)治疗诱发LID大鼠模型,所有大鼠共分为对照组(n=10)、对照+反义 FosB组(n=12)、对照+正义FosB组(n=13)、对照+反义CREB组(n=11)、对照+正义CREB组(n=13)、LID组(n=10)、LID+反义 FosB组(n=9)、 LID+正义FosB组(n=7)、LID+反义CREB组(n=8)、LID+正义CREB组(n=8).对照组与LID组分别注射PBS,其余各组大鼠纹状体内分别注射相应反义、正义FosB和CREB.后4组大鼠进行异常不自主运动(AIM)评分,并采用原位杂交方法观察大鼠纹状体内PDyn mRNA的变化.结果反义FosB治疗前后LID大鼠AIM评分分别为40.1±9.2、12.5±5.4,差异有统计学意义(P<0.01).LID+反义FosB组损毁侧纹状体PDyn mRNA水平(吸光度,0.2415±0.0220)较LID+正义FosB组损毁侧(吸光度,0.4105±0.0386)显著降低(P<0.01).对照+CREB组大鼠损毁侧纹状体PDyn mRNA水平(吸光度,0.1775±0.0246)较对照组(吸光度,0.2403±0.0323)明显降低(P<0.01).反义CREB治疗前后LID大鼠AIM评分分别为40.5±10.0、43.2±11.8,差异无统计学意义(P>0.05). LID+反义CREB组损毁侧纹状体PDyn mRNA水平(吸光度,0.2415±0.0220)与LID+正义CREB组(吸光度,0.4087±0.0440)之间差异无统计学意义(P>0.05).结论在LID大鼠中,FosB蛋白取代了CREB调控PDyn mRNA的表达,是发生LID的关键因素之一.
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运动神经元生存蛋白多克隆抗体的制备及该蛋白在脊髓性肌萎缩症患者骨骼肌中的表达
目的 制备运动神经元生存(SMN)蛋白多克隆抗体,探讨SMN蛋白在细胞内的定位及在脊髓性肌萎缩症(SMA)患者骨骼肌中的表达情况.方法 构建pET-28a(+)/SMN原核表达质粒,诱导表达SMN-His融合蛋白,免疫新西兰大白兔制备SMN多克隆抗体.构建pcDNA3.1/myc-HisB-SMN真核表达质粒并转染中国仓鼠卵母(CHO)细胞.收集骨折患者以及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型SMA患者的骨骼肌组织各3份.分别采用免疫印迹及免疫荧光染色技术进行CHO细胞及骨骼肌组织的SMN蛋白表达研究.结果 成功制备了兔抗人全长SMN多克隆抗体,经鉴定其特异性及敏感性均较高.免疫荧光染色显示SMN蛋白在细胞质及细胞核中呈斑片状或颗粒状分布,以核周较为明显.免疫印迹结果显示骨折患者骨骼肌组织SMN与内参照磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)条带密度比值(SMN/GAPDH)平均为0.619,Ⅲ、Ⅱ型SMA患者SMN/GAPDH比值较低,均值分别为0.347和0.340,而Ⅰ型SMA患者骨骼肌中SMN/GAPDH比值显著降低,均值仅为0.079.结论 高质量的兔抗人全长SMN多克隆抗体的制备为SMA的蛋白功能及发病机制研究奠定了基础,SMA患者骨骼肌中SMN蛋白表达量可能与疾病的严重程度相关.
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CREB1蛋白在大鼠急、慢性吗啡依赖和戒断中的表达变化
目的 研究急、慢性吗啡依赖和戒断对大鼠脑组织cAMP反应元件结合蛋白(CREB1)的表达调节作用.方法 雄性SD大鼠36只,随机分为急性对照组、急性吗啡依赖组、急性吗啡戒断组、慢性对照组、慢性吗啡依赖组、慢性吗啡戒断组,每组6只.采用免疫组化方法测定不同脑区和核团CREB1蛋白表达水平.结果 急性吗啡依赖和戒断抑制蓝斑CREB1蛋白表达.慢性吗啡依赖和戒断增加皮质、海马、蓝斑等脑区核团CREB1蛋白的表达,但是在慢性吗啡依赖和戒断时,伏隔核CREB1蛋白表达下降.结论 急、慢性吗啡依赖和戒断时CREB1在大鼠皮质、海马、下丘脑、蓝斑、伏隔核等脑区的表达存在差异,可能与介导阿片类药物依赖信号转道通路的反应性不同有关.
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慢性神经病理性疼痛大鼠背根神经节和脊髓背角pCREB表达的变化
目的探讨背根神经节和脊髓背角磷酸化cAMP反应元件结合蛋白(pCREB)表达在慢性压迫性神经损伤(CCI)致神经病理性疼痛大鼠痛觉过敏中的作用.方法成年雌性SD大鼠32只,体重230～270 g,随机分为4组(n=8):空白组、sham组、CCI 2w组和CCI 4w组.CCI前测定痛阈[机械缩足反射阈值(MWT)和热缩足反射潜伏期(TWL)]基础值,CCI后(空白组、sham组和CCI 2w组于CCI 14 d;CCI 4w组于CCI 28 d)再次测定痛阈.后一次测定痛阈后次日,取L4,5脊髓和L5背根神经节,免疫组织化学染色,计数pCREB免疫反应阳性(pCREB-IR)神经细胞数量.结果MWT:CCI后sham组、CCI 2w组、CCI 4w组均低于基础值,CCI后sham组低于空白组,CCI 2w组低于sham组(P＜0.01);TWL:CCI 2w组短于基础值,CCI 2w组短于sham组,CCI后CCI 4w组长于CCI 2w组(P＜0.01).sham组背根神经节pCREB-IR神经细胞数量多于空白组,CCI 2w组背根神经节及脊髓背角pCREB-IR神经细胞数量多于sham组,CCI 4w组背根神经节及脊髓背角pCREB-IR神经细胞数量少于CCI 2w组(P＜0.05或0.01).结论CCI致慢性神经病理性疼痛大鼠背根神经节和脊髓背角pCREB表达增加,这可能是外周神经损伤后中枢和外周敏感化的分子机制.
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异丙酚对小鼠海马脑片CREB磷酸化水平的影响
目的 评价异丙酚对小鼠海马脑片cAMP反应元件结合蛋白(CREB)磷酸化水平的影响.方法 BALB/C小鼠,体重18～22 g,雌雄不拘,迅速断头取脑,将其海马切成450 μm厚的脑片.42张脑片,分别随机用不同浓度(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5和10-4 mol/L)异丙酚孵育1 h,每个浓度6张脑片,另外6张脑片,不用异丙酚孵育,作为正常对照.70张脑片,其中63张脑片以5×10-6 mol/L异丙酚孵育,分别于异丙酚孵育1、2、5、7、9、12、15、30和60 min随机取出7张脑片,另外7张脑片,不用异丙酚孵育,作为正常对照;35张脑片以5×10-6 mol/L异丙酚孵育5 min后,用人工脑脊液洗脱异丙酚,分别于洗脱2、4、7、10、25 min随机取出7张脑片.采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹法测定脑片CREB磷酸化水平.结果 与正常对照比较,10-9～10-4 mol/L异丙酚可降低脑片CREB磷酸化水平,5×10-6 mol/L异丙酚孵育1～60 min可降低CREB磷酸化水平,5×10-6 mol/L异丙酚孵育5 min后,用人工脑脊液洗脱2～7 min时,CREB磷酸化水平未恢复(P＜0.05或0.01),用人工脑脊液洗脱10、25 min时,CREB磷酸化水平恢复(P＞0.05).结论 异丙酚可抑制小鼠海马脑片CREB磷酸化,这可能是其抑制记忆功能的机制之一.
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鞘内注射H-89对神经病理痛大鼠脊髓背角磷酸化cAMP反应元件结合蛋白表达的影响
目的观察鞘内注射高选择性蛋白激酶A抑制剂H-89对慢性神经病理痛大鼠脊髓背角磷酸化环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(pCREB)表达的影响.方法成年雌性SD大鼠58只,体重230～270 g.采用右侧慢性坐骨神经结扎的方法建立慢性神经病理痛模型.第一部分,取28只模型大鼠随机分为4组(n=7),H1、H2、H4组分别单次鞘内注射1、2、4 nmol H-89[用二甲亚砜(DMSO,10mmol/L)溶解成10 μl],Con组单次鞘内注射10 mmol/L DMSO 10μl.给药前和给药后15、30、60min分别测定右侧50%缩足反射阈值(MWT)和热缩足反射潜伏期(TWL).第二部分,取24只模型大鼠随机分成4组(n=6),Con组:单次鞘内注射10 mmol/L DMSO 10 μl,H1、H2、H4组分别单次鞘内注射H-89 1、2、4 nmol(10μl);另取6只大鼠实施假手术后,单次鞘内注射10mmol/LDMSO 10μl(Sham组).第二部分大鼠给药后30min处死,取L4,5脊髓,免疫组织化学染色观察脊髓背角pCREB的表达.结果与给药前比较,H2组MWT给药后15 min增加,H4组给药后15、30 min MWT增加,TWL延长(P＜0.05或0.01);与Con组比较,H2组MWT给药后15 min增加,H4组给药后15、30minMWT增加,TWL延长(P＜0.05或0.01).与Con组比较,Sham、H1、H2和H4组脊髓背角pCREB免疫反应阳性神经元数量和表达降低(P＜0.05或0.01).结论鞘内注射H-89抑制了神经病理痛大鼠脊髓背角pCREB表达,PKA/CREB信号通路的激活参与了慢性神经病理痛的维持.
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鞘内注射DREAM-shRNA对神经病理性痛大鼠脊髓背角p-CREB表达的影响
目的 探讨鞘内注射转录因子下游调控元件拮抗因子-短发夹RNA(DREAM-shRNA)对神经病理性痛大鼠脊髓背角磷酸化环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(p-CREB)表达的影响.方法 成年健康雄性SD大鼠,体重280～320 g,采用坐骨神经慢性压迫(CCI)法建立大鼠神经病理性痛模型.于CCI后第3天鞘内置管.取鞘内置管成功的大鼠24只,随机分为4组,每组6只,假手术组(S组):仅暴露坐骨神经,不结扎;神经病理性痛组(NP组):于CCI后第8天鞘内注射生理盐水10 μl;RNA干扰组(RNAi组):于CCI后第8天鞘内注射DREAM-shRNA 5 μl和牛理盐水5 μl;空白载体组(BV组):于CCI后第8天鞘内注射慢病毒空白载体5 μl和生理盐水5μl,各组连续注射7 d.于CCI前1 d(T0,基础状态)、CCI后第7～14天(T1-8)时测定机械痛阈.于CCI后第15天时测定脊髓背角绿色荧光蛋白(GFP)和p-CREB的表达水平.结果 与基础值比较,各组各时点机械痛阈降低(P<0.05或0.01);与T1时比较,NP组和BV组T5-8时机械痛阈降低,RNAi组T8时机械痛阈升高(P<0.05或0.01);与S组比较,NP组和BV组机械痛阈降低,RNAi组T2时机械痛阈降低,T8时升高,NP组、RNAi组和BV组脊髓背角p-CREB表达上调(P<0.05);与NP组比较,RNAi组T6-8时机械痛阈升高,脊髓背角p-CREB表达下调(P<0.05).RNAi组脊髓背角可见大量绿色荧光,即GFP表达阳性,其余3组脊髓背角未见绿色荧光,即GFP无表达.结论 鞘内注射DREAM-shRNA缓解大鼠神经病理性痛的机制可能与抑制脊髓背角p-CREB的表达有关.
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学习记忆过程中磷酸化的CREB在大鼠脑纹状体内的表达
目的:探讨大鼠在学习记忆过程中磷酸化的转录因子环磷酸腺苷反应单元结合蛋白 (cAMP responsive element binding protein, CREB)在脑纹状体内的表达. 方法:将动物首先在 Y迷宫中进行学习记忆训练,然后应用免疫组织化学方法检测磷酸化的 CREB(phospharylated CREB, pCREB) 在脑纹状体内的表达. 结果:大鼠经电 Y迷宫训练后,脑纹状体内侧的边缘区内即有明显的 pCREB阳性表达,而假训练组或对照组的边缘区内均无明显的 pCREB阳性表达.此外,在海马、前额叶皮质和扣带回等处也有较多的 pCREB阳性表达. 结论:大鼠进行电 Y迷宫厌暗学习时,脑纹状体边缘区内磷酸化的转录因子 pCREB参与学习记忆的信号转导过程.
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复方丹参滴丸对心肌细胞氧化损伤的保护作用及其对CREB表达的影响
目的 研究复方丹参滴丸对过氧化氢损伤心肌细胞H9c2的保护作用及其对磷酸化CAMP反应元件结合蛋白(p-CREB)表达的影响.方法 用0.3 mmol/L的H202处理心肌细胞H9c2,复制心肌细胞氧化损伤模型.将不同浓度的丹参滴丸(0.125 g/L、0.250 g/L和0.500 g/L)于H2O2处理前加入,分别用MTT法测定细胞生长抑制率,分光比色法检测乳酸脱氢酶(LDH)释放率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot检测p-CREB表达水平.结果 丹参滴丸可减轻由H202诱导的H9c2细胞凋亡和死亡,其生长抑制率与药物浓度呈依赖关系；丹参滴丸可以上调H9c2细胞中p-CREB的表达,下调LDH释放率(P均＜0.05).结论 丹参滴丸可保护心肌细胞H9c2免受氧化损伤,并上调p-CREB的表达.
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外源CRE顺式元件对慢性吗啡作用SK-N-SH细胞CREB蛋白表达及DNA结合活性的影响
目的: 研究以cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)为靶点的CREB转录因子诱骗(CRE-transcription factor decoy oligodeoxynucleotide、CRE-decoy ODN) 对慢性吗啡作用SK-N-SH细胞CREB相关指标的影响.方法: 体外合成含cAMP反应元件 (cAMP response element,CRE)的单链寡核苷酸,以 DOTAP为转移介质,将CRE-decoy ODN与慢性吗啡作用和纳络酮催促戒断的SK-N-SH细胞共同孵育,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射自显影检测CRE-decoy ODN细胞掺入;EMSA检测CRE-decoy ODN与转录因子CREB结合的特异性以及其对慢性吗啡作用SK-N-SH细胞CREB的DNA结合活性影响;Western Blot检测CREB-1及磷酸化CREB-1蛋白表达.结果: 以DOTAP为介质,将CRE-decoy ODN成功导入SK-N-SH细胞;慢性吗啡作用及纳络酮催促戒断使SK-N-SH细胞CREB的DNA结合活性和磷酸化CREB-1蛋白表达明显增高(P值均<0.01),CREB-1蛋白无明显改变,CRE-decoy ODN可抑制CREB的DNA结合活性和磷酸化CREB-1蛋白表达的改变(P<0.01),对CREB-1蛋白表达无明显影响.结论: CRE-decoy ODN可特异抑制慢性吗啡作用及纳络酮催促戒断SK-N-SH细胞CREB的DNA结合活性和磷酸化CREB-1蛋白表达的增高,对CREB-1蛋白表达无明显影响.
