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结核病小鼠T淋巴细胞亚群及其表达的四项细胞因子分析
目的 探讨T淋巴细胞(简称T细胞)表达穿孔素(PFN)、颗粒酶B(GzmB)、γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)与结核免疫的关系.方法 60只MK小鼠按随机数字表法分成结核病组和健康对照组,每组30只.以CD3PerCP、CD4FTTC、CD8APC单抗标记T细胞亚群,以藻红蛋白标记PFN、GzmB、IFN-γ、IL-2单抗标记细胞因子,以流式细胞仪检测分析总的淋巴细胞、CD3+、CD4+、CD8+、CD4+CD8+;双阳(DP)T细胞计数和各亚群占淋巴细胞百分率,观察各T细胞亚群内表达PFN、GzmB、IFN-γ、IL-2的阳性细胞计数和各自占淋巴细胞百分率.采用t检验进行统计学分析.结果 (1)CD4+CD8+、DP T细胞均能不同程度地表达PFN、GzmB、IFN-γ、IL-2.PFN、GzmB的表达以CD8+T细胞占优势.IFN-γ、IL-2的表达以CD4+T细胞占优势.(2)T细胞亚群细胞计数结果与T细胞亚群占总淋巴细胞百分率结果,所反映的T细胞免疫变化趋势可能相似,也可能不同甚至相反.(3)两组间表达PFN的T细胞差别不明显,但结核病组表达GzmB的各个T细胞亚群计数和CD3+%、CD8+%、DP%高于对照组(t值为-3.72～4.13.均P<0.05).(4)结核病组表达IFN-γ的CD3+、CD4+T细胞计数高于对照组;但结核病组表达IL-2的CD8+、DP T细胞计数和CD3+%、CD4+%、CD8+%、DP%均低于对照组(t值为2.62～3.46,均P<0.05).结论 、CD,4+、CD8+、DPT细胞均能不同程度地表达PFN、GzmB、IFN-γ、IL-2;联合评价T细胞各亚群计数和其占淋巴细胞百分率更能判断免疫学状态.
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GrB/Bid蛋白在胃癌中表达及临床意义的初步研究
目的 探讨胃癌组织中颗粒酶B(GrB)和Bid蛋白的表达情况及与胃癌演进的关系,了解二者在肿瘤免疫耐受机制中的作用.方法 采用免疫组织化学S-P法检测GrB和Bid在胃癌和切缘组织中的表达状况.结果 GrB在胃癌组织中阳性表达率为47.62％,切缘组织中的阳性率为40.48％,二者相比差异无统计学意义(P ＞0.05);Bid在胃癌组织中的阳性表达率(26.19％)明显低于胃切缘上皮组织(76.19％),二者相比有统计学意义(P ＜0.05);GrB的表达水平与胃癌临床分期、淋巴转移有关(P＜0.05),Bid的表达水平与胃癌分化程度、浸润深度、临床分期及淋巴结转移有关(P ＜0.05);GrB和Bid在42例胃癌中表达呈负相关(rs=-0.311,P＜0.05).结论 胃癌组织中GrB和Bid表达可能共同参与胃癌演进,胃癌组织中Bid的表达下调或缺失可能引起胃癌细胞逃逸内源或外源性GrB介导的细胞凋亡,获得免疫耐受潜能,逃逸机体免疫应答.
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槐耳清膏在小鼠心脏移植排斥反应中作用的初步探讨
目的 探讨槐耳清膏在小鼠心脏移植急性排斥反应中的作用.方法 实验分为3组:A组:同种异基因移植后槐耳清膏处理组(槐耳清膏组);B组:同种异基因移植财照组(移植排斥组)及C组:同系移植对照组(同系移植组).观察各组移植心脏的存活时间、术后第5天供心的组织病理改变.用免疫荧光检测移植心脏中CD8+T淋巴细胞的浸润和颗粒酶B的表达水平.结果 A组移植心脏的平均存活时间为(6.38±0.69)d,与B组(8.31±0.59)d相比明显缩短(P<0.01);心肌组织呈3级急性排斥反应病理改变,CD8+T淋巴细胞弥漫性浸润及颗粒酶B表达与两个对照组相比明显增强(P<0.05).结论 在术后早期单用槐耳清音会促进小鼠心脏移植物的急性排斥反应,可能机制足促进CD8+T淋巴细胞的组织浸润并增强颗粒酶B的表达.
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重型再生障碍性贫血患者CD8+HLA-DR+T淋巴细胞效应因子mRNA的表达
目的 观察重型再生障碍性贫血(SAA)患者外周血CD8+ HLA-DR+T淋巴细胞效应因子水平,进一步探讨SAA的免疫发病机制.方法 采用免疫磁珠分选24例SAA初治患者及23名健康对照外周血CD8+ HLA-DR+效应T细胞,半定量反转录PCR检测分选细胞穿孔素、颗粒酶B、Fas配体(FasL)、肿瘤坏死因子β(TNF-β) mRNA表达情况.结果 SAA初治组CD8+ HLA-DR+效应T细胞的穿孔素、颗粒酶B、FasL、TNF-β mRNA的表达量分别为0.66±0.25、0.56±0.26、0.77±0.24、0.58±0.16,均明显高于健康对照(0.53±0.14、0.40±0.13、0.61±0.16、0.46±0.15,P=0.042、0.012、0.011、0.011).结论 CD8+ HLA-DR+效应T细胞可能通过穿孔素、颗粒酶B途径、Fas/FasL途径及TNF-β途径损伤SAA患者骨髓造血细胞,在SAA免疫发病过程中发挥了重要作用.
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骨髓增生异常综合征患者外周血自然杀伤细胞的变化及临床意义
目的 分析骨髓增生异常综合征(MDS)患者外周血自然杀伤(NK)细胞占淋巴细胞百分比、功能变化及其与造血功能相关性,并对不同危险度进行分析,探讨NK细胞在MDS发病机制中的作用.方法 用流式细胞术检测2013年3-11月天津医科大学总医院血液科收治的20例MDS患者(MDS组)、15例急性髓系白血病(AML)患者(AML组)的外周血NK(CD3-CD16+ CD56+)细胞占淋巴细胞百分比、NK细胞胞膜活化性受体(NKG2D、NKp44)和抑制性受体(CD158a、CD158b)及NK细胞胞质蛋白穿孔素、颗粒酶-β的表达,并与15名健康对照(对照组)比较；分析上述变化与外周血中性粒细胞比例(ANC％)、淋巴细胞比例(Lym％)、血红蛋白、血小板、网织红细胞百分比(RET％)及骨髓原始细胞百分比(CD34+％)的相关性.结果 (1) MDS组NK细胞占淋巴细胞百分比(3.87％±0.97％)显著低于对照组(6.08％±1.37％),高于AML组(2.58％±0.78％)(均P＜0.05).(2)MDS组NK细胞表面NKG2D表达(中位数:52.83％)显著低于对照组(86.36％),高于AML组(42.00％)(均P＜0.05).NKp44表达,MDS组高于AML组和对照组(中位数:2.41％比0.92％、0.62％,均P＜0.05).(3) MDS组和AML组NK细胞表面CD158a表达(5.46％±2.40％、4.05％±1.89％)均显著低于对照组(7.97％±2.85％)(均P ＜0.05).CD158b表达3组间差异无统计学意义(P＞0.05).(4) MDS组NK细胞穿孔素表达(中位数:17.83％)显著低于对照组(59.79％),高于AML组(13.06％)(均P＜0.05)；MDS组、AML组NK细胞颗粒酶-β表达(中位数:21.54％、30.65％)均显著低于对照组(83.42％)(均P＜0.05).(5) MDS患者低危组NK细胞占淋巴细胞百分比及NKG2D、NKp44表达高于高危组(4.06％±0.56％比3.59％±1.37％、53.42％±6.85％比47.29％±8.08％、2.46％比2.07％,均P＜0.05)；CD158a、CD158b表达低于高危组,但差异均无统计学意义(均P ＞0.05).(6) NK细胞占淋巴细胞百分比与MDS患者外周血ANC％呈正相关(r=0.780,P＜0.05),与外周血Lym％、骨髓CD34+％均呈负相关(r=-0.543、-0.610,均P＜0.05);NK细胞表面CD158a与骨髓CD34+％呈正相关(r=0.612,P＜0.05)；NKp44、CD158b、穿孔素、颗粒酶-β表达均与各造血指标无相关性(均P ＞0.05).结论 MDS患者外周血NK细胞数量、功能的下降可能引起免疫功能异常,对MDS克隆细胞杀伤力不足导致疾病的发生,下降的程度与疾病进展相关.
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免疫性血小板减少症患者NK细胞数量及功能
目的 探讨免疫性血小板减少症(ITP)患者外周血中自然杀伤(NK)细胞数量及功能的变化.方法 选取2015年9月至2016年5月天津医科大学总医院血液科住院的初诊ITP患者34例,完全缓解ITP患者32例及健康志愿者30名.采用流式细胞术检测外周血NK细胞及其亚群比例,NK细胞表面分子激活性受体NKp44、抑制性受体NKG2A及CD16,胞质蛋白穿孔素及颗粒酶β的表达水平,并将其与ITP患者的免疫状态及血小板水平做相关性分析.结果 (1)NK细胞及其亚群占外周血淋巴细胞比例:NK细胞:初诊组(10.99％±4.89％)及完全缓解组(9.73％±6.75％)低于对照组(14.67％±7.24％) (P =0.023、0.003);Bright亚群:初诊组(0.48％±0.23％)及完全缓解组(0.41％±0.33％)低于对照组(0.64％±0.32％)(P=0.037、0.002);Dim亚群:初诊组(10.16％±5.02％)及完全缓解组(8.07％±5.74％)低于对照组(14.16％ ±7.19％) (P =0.009、0.007).(2)各亚群占NK细胞的比例:Bright亚群:初诊组(6.48％±4.33％)高于对照组(4.21％±2.70％)(P=0.020);Dim亚群:初诊组(93.51％±4.33％)低于对照组(95.79％±2.70％)(P=0.020).(3)激活性受体NKp44:初诊组低于完全缓解组及对照组[0.28％(0.95％)比0.61％(2.05％)、0.92％(0.90％),P=0.047、0.048];抑制性受体NKG2A:初诊组高于对照组(42.34％±23.86％比29.25％±12.83％,P=0.009);CD16:初诊组低于对照组(93.51％ ±4.33％比95.79％±2.70％,P=0.020).(4)穿孔素:初诊组低于对照组[87.52％ (25.29％)比91.55％(8.29％),P=0.025];颗粒酶β 3组之间差异无统计学意义.(5)NK细胞与外周血杀伤T细胞(CD3+ CD8+)、B1细胞(CD5+ CD19+)呈负相关(r=-0.387、-0.273,P=0.012、0.028),与外周血辅助/杀伤T细胞比值(CD3+ CD4 +/CD3+ CD8+)、血小板计数呈正相关(r=0.358、0.314,P=0.028、0.011).结论 ITP患者外周血NK细胞数量下降,发育障碍、功能降低,对自身反应性T、B细胞的抑制不足导致疾病的发生.
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噬血细胞性淋巴组织细胞增生症患儿及其家系穿孔素和颗粒酶B的表达
目的 了解穿孔素1 (PRF1)基因突变型的噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(HLH)患儿穿孔素和颗粒酶B的表达水平,初步探讨PRF1基因突变与患儿免疫细胞功能和临床表现的关系.方法 将8例(例1～8)治疗后HLH患儿、5例(例1～5)患儿的父母及同胞纳入研究,以30名门诊体检正常健康儿童作为正常对照;采用PCR法分段扩增PRF1、Unc13D、STX11、STXBP2、RAB27A、LYST、SH2D1A、BIRC4基因并直接测序;通过ExPASy网站在线分析系统进行PRF1蛋白构象生物信息学分析;采用流式细胞术检测细胞毒T淋巴细胞(CD8+T细胞)和NK细胞穿孔素和颗粒酶B的表达.结果 ①8例患儿中有3例存在PRF1外显子编码区杂合错义突变:例1为复合杂合错义突变R4C和R33H,其父、兄也存在相同突变;例2为杂合错义突变V50L,其母、弟也存在相同突变;例3为杂合错义突变R489W,其父不存在R489W,其母未参与检测,推测其突变来自母亲.例1、2、3可明确诊断为家族性HLH第2亚型(FHL2).②例1及其父、兄以及例2及其母、弟的外周血CD8+T细胞穿孔素阳性率(0～1.48％)和NK细胞的穿孔素阳性率(8.69％～32.10％)较正常对照组明显减少,但两组间颗粒酶B表达未见明显差异.结论 R4C和R33H复合杂合突变以及V50L杂合突变均可导致CD8+T淋巴细胞和NK细胞穿孔素表达减少,为FHL的致病突变.
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骨髓单个核细胞Coombs试验阳性血细胞减少症患者NK细胞数量及功能研究
目的 检测骨髓单个核细胞Coombs试验阳性血细胞减少症(CBCPC)患者外周血NK细胞数量和功能,探讨NK细胞在CBCPC发病中的作用机制.方法 采用流式细胞术检测20例CBCPC初治患者、22例CBCPC缓解患者和12名健康志愿者外周血NK细胞及其亚群比例,表面激活性受体NKG2D、NKp46、NKp44,抑制性受体CD158a、CD158b及穿孔素、颗粒酶β的表达.结果 ①初治组、缓解组患者CD3 CD56' NK细胞比例显著低于对照组[分别为(10.04±5.33)％、(11.62±6.80)％、(19.94±7.38)％,P值均＜0.01].②初治患者NK细胞激活性受体NKG2D比例(74.03±18.24)％显著高于缓解组患者[(45.97±29.45)％]和对照组[(41.89±15.34)％](P值均＜0.01).③初治患者NK细胞抑制性受体CD 158a中位水平为3.72％(7.88％),显著低于缓解组的16.10％ (26.43％)和对照组的11.04％(22.87％)(P值分别为0.015、0.025).④初治、缓解患者NK细胞穿孔素比例分别为(75.71±10.14)％、(77.88±22.82)％,均显著高于对照组的(60.22±14.58)％(P值分别为0.018、0.008).⑤初治和缓解患者NK细胞比例与穿孔素比例乘积分别为(7.68±4.54)％、(8.24±5.80)％,均显著低于对照组的(12.13±5.19)％(P值分别为0.011、0.023);初治和缓解患者NK细胞比例与颗粒酶β比例乘积分别为(7.83±5.26)％、(8.37±6.83)％显著低于对照组的(14.79±8.37)％(P值分别为0.008、0.012).结论 初治CBCPC患者NK细胞比例降低,激活性受体表达增加,抑制性受体表达降低,提示NK细胞在CBCPC发病机制中起保护作用,但代偿不足.
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重度子癎前期患者外周血单个核细胞颗粒酶B mRNA的表达及意义
目的:探讨外周血单个核细胞颗粒酶B(GzmB)mRNA在重度子癎前期发病中的作用.方法:选取2007年12月-2009年6月就诊于我院产科的重度子癎前期患者32例(子癎前期组),正常孕妇32例(对照组).采用逆转录-聚合酶链反应方法检测其外周血单个核细胞GzmB mRNA的表达,并与平均动脉压进行相关性分析.结果:子癎前期组GzmB mRNA相对表达强度为1.297±0.239,高于对照组的0.792±0.210,差异有统计学意义(P＜0.01).重度子癎前期孕妇外周血中单个核细胞GzmB mRNA表达水平与平均动脉压呈正相关(r=0.693,P＜0.01).结论:GzmB可能参与了重度子癎前期的发病过程.
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穿孔素和颗粒酶B在儿童传染性单核细胞增多症肝损伤中的表达及意义
目的 观察传染性单核细胞增多症(IM)患儿外周血单个核细胞(PBMC)中CD8+T淋巴细胞和NK细胞中穿孔素及颗粒酶B的变化,探索其在肝损伤中的临床意义.方法 选择2016年1月-2017年6月在湖南省儿童医院住院且符合IM诊断标准的患儿60例,以30例健康儿童志愿者为对照组;通过细胞表面标记和细胞内细胞因子染色技术,采用流式细胞术分析PBMC中CD8+T淋巴细胞和NK细胞及其穿孔素及颗粒酶B的表达.计量资料2组间比较采用f检验,3组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用Dunnett-t法.结果 在60例IM患儿中,肝损伤发生率50％(30/60),其中ALT＜200 U/L者60％(18/30),200 U/L≤ALT ＜400 U/L者33.3％(10/30),ALT≥400 U/L者6.67％(2/30),所有患儿经治疗1个月后复查肝功能均恢复正常.与正常组相比,IM非肝损伤和肝损伤组CD8+T淋巴细胞中穿孔素和颗粒酶B的表达均明显升高(P值均＜0.05).与IM非肝损伤组相比,肝损伤组中CD8+T淋巴细胞表达水平及NK细胞中穿孔素和颗粒酶B的表达均明显升高(P值均＜0.05).结论 IM患儿肝损伤发生率高,主要为轻中度转氯酶升高,能自限性恢复正常,NK细胞中穿孔素和颗粒酶B及CD8+T淋巴细胞高表达是造成IM肝损伤的原因.
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特应性皮炎患者外周血皮肤归巢的CD8+T细胞研究
目的 探讨特应性皮炎(AD)患者外周血CD8+T细胞皮肤归巢及杀伤功能相关蛋白的表达.方法 15例AD患者和14例健康人,用流式细胞仪,检测外周血CD8+T细胞、表达皮肤淋巴细胞相关抗原的CD8+T细胞(CLA+CD8+T细胞)的比例.结果 CD8+T细胞比例在AD组和对照组之间差异无统计学意义(P＞ 0.05);CD8+T细胞穿孔素、颗粒酶B和FasL的表达在两组间差异亦无统计学意义(均P＞0.05).CLA+℃D8+T细胞比例在AD组(3.80％±1.46％)高于健康对照组(2.18％±0.85％)(t=3.636,P＜ 0.01),AD组CLA+CD8+T细胞比例与SCORAD(SCORing of Atopic Dermatitis)评分呈正相关(r=0.565,P＜0.05);CCR4在CD8+T细胞表达在AD组(13.86％±4.42％)高于健康对照组(9.50％±2.14％)(t=3.738,P＜ 0.01),而CCR10和CXCR6的表达在两组间差异均无统计学意义(P＞0.05).CLA+CD8+T细胞穿孔素的表达在AD组(74.27％±15.94％)高于健康对照组(57.20％±14.64％)(t=2.998,P＜ 0.01),颗粒酶B的表达在AD组(70.90％±13.85％)也高于健康对照组(56.41％±11.00％)(t=3.104,P＜ 0.01),而FasL的表达在两组间差异无统计学意义(P＞0.05).CLA+CD8+T细胞CCR4、CCR10和CXCR6的表达在AD组与对照组间差异无统计学意义(均P＞0.05).结论 AD患者外周血CLA+CD8+T细胞数量增加,杀伤功能相关蛋白穿孔素、颗粒酶B的表达增强,可能参与了AD的发病.
关键词： 皮炎 特应性 CD8阳性T淋巴细胞 皮肤淋巴细胞相关抗原 颗粒酶类 受体 趋化因子 -
慢性乙型肝炎病毒感染者外周血自然杀伤细胞免疫效应分子的表达
目的 研究慢性HBV感染者外周血自然杀伤细胞(NK细胞)免疫效应分子表达与感染状态的相关性.方法 健康人作为对照组,慢性HBV感染者根据感染状态分为肝功正常高病毒复制组、肝功能正常低病毒复制组、肝功能异常高病毒复制组、肝功能异常低病毒复制组.应用流式细胞法检测外周血NK细胞的穿孔素(PF)、颗粒酶B(Gr B)、颗粒溶素(GNLY)、肿瘤坏死因子(TNF)α和干扰素(IFN)γ的表达,分析其与感染状态的相关性.组间比较用单因素方差分析;相关性分析采用直线相关Pearson分析.结果 阳性细胞百分比同对照组(31.50%±27.64%)相比,肝功能正常高病毒复制组(59.74%±30.82%)和肝功能正常低病毒复制组(61.89%±33.30%)的GNLY表达增加有统计学意义;同对照组(57.38%±23.69%)相比,肝功正常高病毒复制组(39.89%±21.30%)、肝功能异常高病毒复制组(37.54%±18.79%)的IFN γ表达降低,P值均<0.05,差异有统计学意义;肝功能正常高病毒复制组的PF、Gr B、GNLY(阳性细胞百分比分别为56.98%±38.34%、81.53%±19.58%、59.74%±30.82%)和肝功能正常低病毒复制组的PF、Gr B、GNLY(阳性细胞百分比分别为62.95%±31.98%、84.51%±14.57%、61.89%±33.30%)表达高于肝功能异常高病毒复制组 (阳性细胞百分比分别为35.47%±29.64%,66.55%±22.92%,42.03±33.17%),P值均<0.05,差异有统计学意义;除了TNF α和GNLY不具有相关性外,PF、Gr B、GNLY、TNF α和IFN γ之间呈两两正相关关系.结论 高病毒复制水平的HBV感染者外周血NK细胞表达的IFN γ明显低于正常对照组;肝功能正常的HBV感染者外周血NK细胞表达的PF、Gr B、GNLY水平明显高于肝功能异常者.
