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腺病毒介导c-FLIPs基因诱导淋巴细胞抗凋亡作用
目的探讨表达c-FLIPs重组腺病毒诱导淋巴细胞抗凋亡作用.方法采用RT-PCR方法,从人T淋巴细胞株的总RNA中克隆c-FLIPs基因;通过pAdeasy系统,构建表达c-FLIPs的重组腺病毒Ad.c-FLIPs;Hochest染色法及PI染色流式细胞仪检测anti-Apo-1诱导感染Ad.c-FLIPs后的H9细胞凋亡.结果采用RT-PCR方法从人T淋巴细胞株中扩增出c-FLIPs基因;构建重组腺病毒Ad.c-FLIPs;经Hoechst染色,荧光显微镜下观察细胞核的形态,结果发现,经anti-Apo-1诱导凋亡处理24 h后,未经Ad.c-FLIPs感染的H9细胞有大量的细胞核呈浓染致密的固缩形态或颗粒状荧光的凋亡细胞;Ad.c-FLIPs感染的H9细胞中细胞核呈浓染致密的固缩形态或颗粒状荧光的细胞数明显减少,大部分细胞染色质呈弥漫均匀低强度荧光;流式细胞仪分析经PI染色后的H9细胞,未经Ad.c-FLIPs预处理的H9细胞在anti-Apo-1作用24 h后,细胞的凋亡率分别为48.33%±7.41%;经Ad.c-FLIPs预处理1 d的H9细胞,其细胞凋亡率分别下降到3.60%±0.21%.结论重组腺病毒Ad.c-FLIPs可有效地诱导淋巴细胞的抗凋亡作用.
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腺病毒载体介导HBsAg基因在哺乳动物细胞中的表达
目的探讨腺病毒载体介导乙型肝炎病毒(HBV)前S2/S(preS2/S)基因在几种哺乳动物细胞中的表达.方法制备携带HBV preS2/S基因的非复制型重组腺病毒Ad-HBs,体外转染人胚肾细胞(293)、绿猴肾细胞(Vero)、肝癌细胞系(HepG2)和间质干细胞(MSCs),荧光显微镜观察EGFP的表达,同时采用RT-PCR检测目的基因的转录,ELISA法检测目的基因的表达.结果MOI为20的重组腺病毒Ad-HBs转染293、Vero、HepG2细胞和MSCs,48 h后90%以上的细胞表达EGFP,同时细胞表达高滴度的HBsAg(A值＞3.229).结论腺病毒载体不仅能够介导HBV preS2/S基因于连续细胞系细胞中高效表达,也能介导HBV preS2/S基因于干细胞中高效表达.
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2011-2012年徐州地区儿童急性呼吸道感染中腺病毒感染特征
目的 了解徐州地区儿童腺病毒感染的型别及流行特点.方法 采用Real-time PCR方法对2011年1月至2012年12月共990份急性呼吸道感染患儿鼻咽分泌物标本进行检测;对腺病毒阳性的标本进行常规PCR扩增hexon基因并对扩增产物进行测序分型,同时用Hep-2进行细胞分离.结果 990份标本中,Real-timePCR检测腺病毒阳性数为164(16.6％);腺病毒感染全年散发,其高峰期为3-4月;以7岁以下儿童多见,感染阳性率为91.5％;对其中100例PCR阳性标本扩增产物进行测序分型,涵盖B\C\E三个亚种,以HAdV B3 18株(占18.0％),HAdV C2 17株(占17.0％),HAdV B7 16株(占16.0％)多见,混合HAdV B3和HAdV B7感染2例;134例PCR阳性标本中分离出毒株59株,分离率为44.0％.结论 腺病毒是徐州地区儿童急性呼吸道感染的重要病原,徐州地区腺病毒型别种类多样化,病毒重组变异概率较高,需加强对该病毒的流行监测.
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一起学校内腺病毒引起的急性呼吸道感染疫情暴发调查
目的：对一起学校内急性呼吸道感染暴发疫情进行流行病学调查和病原学检测，以明确诊断，控制疫情。方法开展现场流行病学调查，核实搜索病例，分析疫情特征；采用病例对照研究分析危险因素；采集咽拭子标本，运用RT-PCR方法进行病毒核酸检测。结果共有病例43例，学生罹患率为1.31%，病例分布在4个班级，有明显的集聚性。病例对照研究显示与病例密切接触是危险因素。12例的咽拭子标本病毒核酸检测显示，8例腺病毒阳性。结论本次急性呼吸道感染疫情暴发由腺病毒引起，学生间密切接触是主要的传播方式。
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80例成人腺病毒B组55型感染临床分析
目的 对80例成人腺病毒B组55型感染者的资料进行总结,以进一步指导临床诊治.方法 主要采用描述性流行病学方法对患者资料进行回顾性分析.结果 本组患者多为18～29岁的青年,呈人群聚集分布,有接触史,主要症状包括发热(100％)、咳嗽(92.5％)、咽痛(88.8％)、咳痰(85.0％)和畏寒(78.8％).常见体征为咽部充血(88.8％).患者外周血白细胞计数正常或偏低,多数中性粒细胞比例升高.结论 成人腺病毒B组55型感染可引起暴发流行,以发热、咳嗽、咽痛和咳痰为主要表现,临床症状轻,预后良好.
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121例成人55型腺病毒肺炎胸部CT影像分析
目的：回顾性分析121例成人55型腺病毒肺炎的胸部CT影像学表现，为该病的影像学诊断提供参考。方法总结2012年2月某单位暴发的55型腺病毒感染疫情，选择其中121例经肺部CT确诊的肺炎患者为研究对象，分析其临床表现及胸部CT特点。结果121例体温为（39.22±0.77）℃，热程为（7.12±2.23） d，所有患者均有咳嗽、咳痰、咽痛及咽充血，其中87.60%扁桃体肿大，64.46%颈部淋巴结肿大。90例表现为肺部单叶或多叶段少许渗出性病变，22例为多叶段片状团簇状影，8例为肺部单叶条索状影，1例为支气管扩张伴感染。单肺叶病变组热程短于多肺叶病变组（P＜0.05），但2组间高体温、白细胞计数、中性粒细胞比例及CRP差异无统计学意义。结论成人55型腺病毒感染与普通上呼吸道病毒感染临床表现类似，胸部CT提示多数患者存在肺部影像学异常，肺外表现较少；多肺叶受累者并未表现出明显的重症倾向。
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腺病毒感染对生物燃料烟雾所致豚鼠肺部炎症反应的作用
目的 探讨腺病毒感染在生物燃料烟雾所致的豚鼠肺部炎症反应中的作用.方法 将46只雌性白化豚鼠用随机数字表法分为感染组(26只)和假感染组(20只),感染组鼻腔接种野生型5型腺病毒(Ad5),假感染组接种PBS作为对照.22 d后再用随机数字表法将每组各20只豚鼠再分为暴露于木材锯末和谷壳烟雾组与暴露于新鲜空气的对照组.21 d后检测豚鼠肺组织病理和BALF中白细胞介素(IL)-8、IL-6和细胞黏附分子-1(CAM-1)的含量.所有数据均以x±s表示,组间比较采用单因素方差分析.结果 生物燃料烟雾暴露和腺病毒感染均能使豚鼠BALF中白细胞总数明显增高[(37.1±5.5)×106/L和(16.8±2.3)×106/L],与对照组[(11.2±2.5)×106/L]比较差异有统计学意义(F值分别为208.947和22.687,均P＜0.01),且有交互作用.生物燃料烟雾暴露的豚鼠BALF中IL-8、IL-6和CAM-1浓度增高[(0.38±0.06)、(O.188±0.021)和(6.5±1.6) mg/kg],与对照组[(O.30±0.05)、(0.125±0.022)和(4.8±0.9) mg/kg]比较差异均有统计学意义(F值为13.525～69.021,均P＜0.01),腺病毒感染及豚鼠BALF中IL-8及CAM-1浓度增高[(0.37±0.05)和(8.2±2.1) mg/kg],差异均有统计学意义(,值分别为11.964和57.162,均P＜0.01),对IL-6[(O.126±0.023) mg/kg]无明显影响(F=0.667,P＞0.05).腺病毒感染及生物燃料烟雾暴露对豚鼠BALF中IL-8、CAM-1浓度增加有协同作用(F值分别为5.153和56.573,P＜0.05和P＜0.01).结论 木材锯末与谷壳烟雾可导致豚鼠肺部炎症反应,出现支气管炎及肺气肿样改变,腺病毒感染可加重生物燃料烟雾引起的豚鼠肺组织的炎症反应.
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2005-2008年兰州地区婴幼儿腹泻腺病毒感染的分子流行病学调查
目的 通过分子流行病学调查研究兰州地区婴幼儿腺病毒(AdV)腹泻特点.方法 采用聚合酶链反应(PCR)对2005年7月-2008年6月兰州地区婴幼儿腹泻粪便标本进行AdV检测.结果 889份标本中共检出AdV的感染43例,总阳性率是4.8%,其中肠道腺病毒(EAdV,F亚属)Ad40,Ad41阳性率3.8%(34/889),其次是非肠道腺病毒(NEAdV)Ad12,Ad18,Ad31,Ad2,Ad5,Ad6,Ad7阳性率1.0%(9/889).发病年龄高峰以1岁内的婴幼儿为主,呈全年散发流行,未表现出明显的季节性.结论 AdV是兰州地区婴幼儿病毒性腹泻的重要病原之一,其主要的流行株为Ad41型.
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腺病毒介导Bcl-2基因对原代螺旋神经节细胞存活的促进作用
目的 研究外源性细胞凋亡相关基因Bcl-2对原代培养的螺旋神经节细胞(spiral ganglion cells,SGCs)存活及突起生长的影响,以期找到保护SGCs的有效方法.方法 大鼠螺旋神经节细胞原代培养,免疫印迹法(western blot)检测转染AdEasy系统构建携带Bcl-2和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)的腺病毒后SGCs表达Bcl-2蛋白的水平.免疫细胞组织化学染色鉴定螺旋神经节细胞,计数SGCs的数目.结果 AdEGFP/Bcl-2组SGCs的存活数目分别高于AdEGFP组及空白对照组,AdEGFP组的存活SGCs细胞数略少于空白对照组.结论 Bcl-2蛋白能促进体外SGCs细胞存活,腺病毒本身有轻微的细胞毒性,但表达外源性Bcl-2基因却可以保护SGCs不受腺病毒细胞毒性损害.
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腺病毒潜伏感染加重生物燃料烟雾所致的豚鼠肺部及血清中氧化-抗氧化失衡
目的 探讨腺病毒潜伏感染在生物燃料烟雾所致的豚鼠肺部及血清中氧化-抗氧化失衡中的作用.方法 将46只白化豚鼠用随机数字表法分为感染组(26只)和假感染组(20只),感染组鼻腔接种野生型腺病毒5型,假感染组接种PBS作为对照.22 d后随机将各组剩余动物(各20只)再各分为暴露于木材锯末和谷壳烟雾组和暴露于新鲜空气的对照组.暴露结束后进行肺组织病理检测,并检测肺组织匀浆及豚鼠血清中的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化能力及BALF中的MDA、SOD、总抗氧化能力.所有数据均以(x)±s表示,采用SPSS 15.0软件进行析因方差分析,组间比较采用单因素方差分析,P＜0.05为差异有统计学意义.结果 腺病毒潜伏感染使豚鼠肺组织匀浆及血清中GSH-PX、GSH、SOD、总抗氧化能力显著降低(F值分别为171.024、109.05、24.704、41.660、23.513、12.652、12.447、14.912,P值均＜0.01),使豚鼠肺组织匀浆CAT降低(F=5.081,P＜0.05),MDA升高(F=5.725,P＜0.05).生物燃料烟雾暴露使豚鼠肺组织匀浆及血清中GSH-PX、GSH、SOD、CAT、总抗氧化能力显著降低(F值分别为316.979、430.92、36.462、164.64、175.621、109.86、271.558、16.710、94.802、56.668,P值均＜0.01),MDA显著升高(F值分别为56.083、32.928,P值均＜0.01).腺病毒感染和生物燃料烟雾暴露的交互效应使豚鼠肺组织匀浆GSH-PX降低(F=4.384,P＜0.05)及血清中GSH-PX、GSH降低(F =13.233,P＜0.01;F=5.979,P＜0.05),腺病毒感染+生物燃料烟雾暴露组与单纯生物燃料烟雾暴露组比较,豚鼠肺组织匀浆中GSH、SOD、CAT、总抗氧化能力降低(F值分别为19.690、17.177、14.630、16.070,P值均＜0.01),血清中SOD及总抗氧化能力降低(F值分别为15.664、12.975,P值均＜0.01).结论 木材锯末与谷壳烟雾可导致豚鼠肺部氧化-抗氧化失衡,腺病毒潜伏感染加重了由生物燃料烟雾引起的豚鼠肺组织氧化-抗氧化失衡.
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应用噬菌体随机肽库筛选腺病毒模拟肽的研究
目的探讨模拟腺病毒表位肽的噬菌体对该病毒感染Hela细胞的保护作用,以便为研制防治腺病毒感染的新型疫苗奠定基础.方法用3型腺病毒中和抗体筛选噬菌体随机六肽库,经3轮筛选后,随机挑取了21个噬菌体克隆,扩增后分别加入3型腺病毒感染的Hela细胞.用结晶紫染色法观察Hela细胞的病变程度. 结果10/21个克隆噬菌体短肽对3型腺病毒感染Hela细胞具有保护作用.结论噬菌体表面的短肽可以模拟中和抗体相关的腺病毒表位,对3型腺病毒感染Hela细胞有一定的保护作用.
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腺病毒感染大鼠骨髓间充质干细胞及其对细胞增殖的影响
目的 分离培养大鼠骨髓间充质干细胞( MSCs) ,优化腺病毒感染条件. 方法 全骨髓贴壁法分离培养骨髓MSCs,经形态学及表面分子标志鉴定后以携带绿色荧光蛋白( GFP)的腺病毒感染细胞,流式细胞术测定细胞荧光阳性率判断感染率,甲基噻唑基四唑( MTT)法确定不同病毒感染复数( MOI)对细胞增殖的影响. 结果 分离培养的细胞高表达MSCs表面标志CD90和CD105,低表达造血细胞表面标志CD34和CD45,成功分离MSCs;腺病毒感染率随MOI升高而增加,当MOI≤100时细胞增殖率无明显变化,MOI=200时细胞增殖率降低. 结论 MOI=100为大鼠骨髓MSCs佳腺病毒MOI.
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特异性靶向卵巢癌COC1细胞的Puma基因表达系统的建立
目的:建立人端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因启动子介导的p53正向凋亡调控因子(p53 up-regulated modulator of apoptosis,Puma)基因腺病毒表达载体,实现Puma基因在卵巢癌细胞中的定向表达.方法:采用RT-PCR的方法扩增Puma基因开放阅读框全长以及hTERT启动子区,并克隆至腺病毒穿梭表达载体pDC316中;将重组载体包装为腺病毒颗粒,进而感染正常卵巢上皮细胞HUM-CELL-0088以及卵巢癌COC1细胞;分别采用实时荧光定量PCR及蛋白质印迹法检测Puma mRNA及蛋白的表达情况;CCK-8(cell counting kit-8)法及FCM法检测Puma表达对COC1细胞增殖及凋亡的影响.结果:成功构建了hTERT启动子介导的Puma基因重组腺病毒表达载体pDC316-hTERT-Puma.表达载体pDC316-hTERT-Puma能够介导Puma基因在卵巢癌COC1细胞中特异性高表达,而在正常卵巢上皮细胞中低表达;Puma基因成功表达后,COC1细胞的增殖被抑制(P＜0.05),凋亡率明显增加(P＜0.05).结论:成功构建了hTERT启动子介导的Puma基因腺病毒表达载体,实现了Puma基因在卵巢癌细胞中的定向表达,为进一步实现Puma在卵巢癌中的靶向治疗奠定了基础.
关键词： 卵巢肿瘤 肿瘤抑制蛋白质p53 人端粒酶反转录酶 腺病毒科感染 -
沉默结缔组织生长因子基因重组腺病毒的构建及功能验证
目的:构建沉默结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)基因的复制缺陷型重组腺病毒Ad-siCTGF,并进行功能验证.方法:选取已验证的能高效沉默CTGF基因的靶序列,克隆入载体pSES-HUS中;将质粒线性化处理后与腺病毒骨架质粒pAdEasy共同转染大肠埃希菌BJ5183,构建重组腺病毒载体Ad-siCTGF;腺病毒载体用Pac I酶切线性化处理后转染HEK293细胞,包装重组腺病毒;采用"乒乓交互感染法"提高病毒滴度.用此病毒感染4T1细胞,行实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative -PCR, RFQ-PCR)及Western 印迹法验证其沉默效果.结果:Pac I酶切电泳证实重组腺病毒载体Ad-siCTGF构建成功,扩增纯化后测定重组病毒Ad-siCTGF的滴度为2.6×10~(10) pfu/mL.感染此病毒后,4T1细胞中CTGF mRNA表达水平下调至36.27%,蛋白表达水平下调至31.56%.结论:成功构建能沉默CTGF基因的重组腺病毒,为进一步研究CTGF在肿瘤中的作用机制奠定了基础.
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1起腺病毒引起的急性呼吸道感染爆发疫情调查
目的 对泰州市靖江某小学校1起急性呼吸道感染爆发疫情进行流行病学调查,以明确诊断,控制疫情. 方法 通过流行病学调查描述疫情流行特征;采用病例对照研究分析流行因素;采集患者咽拭子进行呼吸道多种病毒的PCR检测. 结果 疫情报告病例29例,发病高峰呈双峰分布,主要集中该校五(2)班学生(占93.10％),具有班级聚集性.病例对照研究显示每次洗手使用肥皂为保护性因素.3份咽拭子标本检测全部为呼吸道腺病毒阳性,阳性率100％. 结论 此次急性呼吸道感染爆发疫情由腺病毒引起,传播途径以密切接触为主.
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ATP7B基因重组腺病毒载体对肝豆状核变性患者肝细胞的影响
目的 研究腺病毒介导的ATP7B基因转染肝豆状核变性(Wilson)患者的肝细胞后,ATP7B在肝细胞内的表达及生物学活性.方法 ATP7B基因重组腺病毒载体转染体外培养的Wilson患者肝细胞,观测绿色荧光在肝细胞内的表达,以细胞免疫化学技术和ELISA等方法检测ATP7B蛋白在细胞内、外的表达情况.结果 经转染后肝细胞能成功合成ATP7B蛋白,其表达量在转染后的3～5d达到高峰,14 d后表达显著下降.结论 携带ATP7B目的基因的重组腺病毒载体经转染后能在Wilson病离体肝细胞中成功表达.
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儿童腺病毒肺炎血清和支气管肺泡灌洗液中白细胞介素6、白细胞介素10及肿瘤坏死因子α的水平及意义
目的：通过检测腺病毒肺炎患儿血清和支气管肺泡灌洗液中白细胞介素6、白细胞介素10及肿瘤坏死因子α的表达，并且与健康对照组相比较，探讨其与儿童腺病毒肺炎临床表现的相关性。方法采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测40例腺病毒肺炎患儿及20例健康对照儿童血清和支气管肺泡灌洗液中白细胞介素6、白细胞介素10及肿瘤坏死因子α水平。结果腺病毒肺炎急性期和恢复期的患儿外周血中 IL-6、IL-10、TNF-α的水平均明显高于对照组，差异均有统计学意义（均 P ＜0．05）。腺病毒肺炎急性期患儿外周血中 IL-6、IL-10、TNF-α的水平明显高于恢复期[（47．5±17．7）pg／mL 比（22．3±6．5）pg／mL，（7．5±1．3）pg／mL 比（5．3±2．1）pg／mL，（123．4±5．3）pg／mL 比（71．3±5．4）pg／mL]，差异均有统计学意义（t ＝7．57、8．39、11．57，均 P ＜0．05）。结论腺病毒肺炎患儿外周血以及支气管肺泡灌洗液中白细胞介素6、白细胞介素10及肿瘤坏死因子α水平显著性升高，表明白细胞介素6、白细胞介素10及肿瘤坏死因子α可能在儿童腺病毒肺炎的发病中起着重要的作用。
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急性流行性角结膜炎的虹膜炎症
流行性角结膜炎(epidemic kerato conjunctivitis,EKC)系由腺病毒引起,且多为第VIII型,目前病例报道中很少提到EKC的虹膜炎症.1996年至1999年我们在514例EKC患者中诊治21例伴有虹膜炎症,现报道如下.
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重症腺病毒肺炎患儿20例临床分析
目的 探讨小儿重症腺病毒肺炎的临床特点,进一步提高对小儿重症腺病毒肺炎的认识.方法 选取2015年6月至2017年1月间本院ICU收治的重症腺病毒肺炎患儿20例,分析其临床症状、辅助检查及疾病转归.结果 18例出现持续高热,热程较长.所有患儿均出现并发症;易合并其他病原体感染,常见的细菌为肺炎链球菌,流感嗜血杆菌,病毒为呼吸道合胞病毒;胸部影像学表现以渗出、实变为主,双侧多见;纤支镜检查发现支气管内膜炎、喉气管软化、气管狭窄等病变;中位发热时间(IR 16-20.5)d;发病到病情加重需呼吸机辅助呼吸的中位数时间(IR 8.5-15)d.结论 儿童重症腺病毒肺炎病情重、并发症多、病程长,易继发细菌感染,缺乏特异性治疗手段,重症病例中,患儿多合并支气管肺发育不良,先心病及遗传代谢性疾病,中重度营养不良等,导致病情迁延,反复,加大治疗难度,及时、早期纤支镜检查及灌洗治疗,对于疾病的诊断及治疗均有非常重要的意义.
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青岛市冬春季儿童腹泻腺病毒感染分子流行病学特点
目的 了解青岛市2007年冬春季儿童腹泻腺病毒(EADV)感染的流行病学特点.方法 收集2007年1～5月临床诊断为病毒性腹泻病儿的粪便标本,采用ELISA及PCR方法检测EADV.结果 106例标本检测阳性率为38%,随机抽取10例阳性标本进行DNA诊断,均为EADV.结论 青岛市冬春季儿童腹泻与EADV感染有关,流行株为40、41型的病毒株.
