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遗传性出血性毛细血管扩张症一家系致病基因分析及沙利度胺治疗疗效观察
目的:分析遗传性出血性毛细血管扩张症(hereditary hemorrhagic telangiectasia,HHT)一家系ACVRL1、ENG和MADH4(SMAD4)基因突变,并观察沙利度胺对其治疗的疗效.方法:对该家系进行详细的家系调查,采用PCR方法对先证者进行ACVRL1、ENG和SMAD4基因全部外显子序列扩增,应用Sanger测序法进行序列分析,将结果与数据库参照序列进行对比;对检测到的可疑突变在纳入研究的其他7名家系成员中进一步进行检测.先证者采用沙利度胺(100 mg/d)治疗6个月,而后观察其出血频率、出血量、输血频率等,评估疗效.结果:先证者(Ⅱ-1)及其另外4名家系成员(Ⅱ-2、Ⅲ-1、Ⅲ-2、Ⅲ-3)均存在有ACVRL1基因c.1231C＞T杂合突变,与临床表型共分离,为文献已经报道的突变;同时该家系部分成员(Ⅱ-1、Ⅱ-3,Ⅲ-1、Ⅲ-2)存在有ENG基因c.1096G＞C突变,不与临床表型共分离,为数据库收录的基因多态性;SMAD4基因未见突变.经沙利度胺治疗后,先证者出血频率、出血量、输血频率均减少,血红蛋白浓度和血清铁均升高.结论:HHT具有表型异质性,且随着年龄增长表型增多;ACVRL1基因c.1231C＞T突变是该家系的致病基因.沙利度胺对遗传性出血性毛细血管扩张症出血具有较好的疗效.
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剔除成骨细胞特异性基因Smad4不影响小鼠造血稳态的维持
体内证实,成骨细胞作为造血干细胞(HSC)niche的组成部分是随着基因修饰小鼠模型的建立而实现的,成骨细胞构成了HSC自我更新和多向分化的重要微环境.Smad4基因在成骨细胞的特异性剔除可导致小鼠成骨细胞数量的下降和骨内膜面积的减少.为了阐明体内成骨细胞的减少是否影响小鼠骨髓的造血活性,本研究对成骨细胞特异性Smad4基因剔除小鼠的骨髓和髓外造血进行了系统分析,采用流式细胞技术检测骨髓和肝脏、脾脏成熟血细胞的比例;用集落培养技术、脾结节形成实验和LSK细胞分析检测不同阶段造血前体细胞的数量.结果显示,条件剔除小鼠的骨髓造血稳态维持正常,没有髓外造血的表现,特别是其不同阶段的造血前体细胞比例正常,而单位体重的细胞数量反而增加.结论:体内成骨细胞数量的减少不是导致骨髓造血活性下降的决定性因素.
关键词： 成骨细胞 SMAD4基因 骨髓 造血 造血干细胞niche -
新疆哈萨克族胃癌中Smad4基因启动子的甲基化状态
目的:探讨mad4基因启动子甲基化在新疆哈萨克族胃癌发病中的作用.方法:收集新疆哈萨克族胃癌组织30例及哈萨克族正常胃黏膜组织30例作为研究对象,哈萨克族胃癌及哈萨克族正常胃黏膜组织均取自新疆新源县哈萨克族胃癌研究现场.运用MassARRAY技术平台检测Smad4基因启动子的甲基化状态.结果:(1)哈族胃癌组与对照组中Smad4基因启动子的CpG单位平均甲基化率分别为26.5％和21.7％,哈族胃癌组mad4基因启动子平均甲基化率要明显高于哈族正常组；(2)Smad4基因在哈族胃癌中CpG单位3-4与CpG单位10-11平均甲基化水平分别为19.1％和20.3％,两者的平均甲基化水平明显高于正常对照的10.9％和11.5％,两者的平均甲基化率在哈族癌组和对照组中有显著差异(P＜0.05).结论:(1)哈萨克族胃癌的发生可能与Smad4基因启动子区的甲基化状态有关；(2)Smad4基因启动子区CpG单位3-4与CpG单位10-11这两个CpG单位甲基化状态的改变可能导致胃癌的发生.
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Smad4在消化系肿瘤发生中的作用
转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGF-β)是一多功能的细胞因子,对细胞的生长分化具有调节作用. Smad4为TGF-β细胞内信使, 也是一抑癌基因, 能抑制多数细胞的生长, 对肿瘤的生长也具有抑制作用. 目前研究发现, Smad4的表达异常, 可诱发胃肠道癌前疾病的发生, 并促进这些癌前疾病向肿瘤的发展, 并影响肿瘤细胞的生物学特性.
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胰腺癌Smad4蛋白的表达及与肿瘤病理特征和患者生存的关系
文献报道,检测胰腺细胞Smad4基因的表达可提高对胰腺癌的早期诊断率[1].本研究检测胰腺癌组织Smad4蛋白的表达,分析其与肿瘤病理特征及患者预后的关系.一、资料与方法1.临床资料:收集我科2007年2月至2009年6月行手术切除并经病理证实的胰腺导管腺癌患者22例,男性13例,平均年龄64岁,女性9例,平均年龄61岁.
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肺癌smad4基因和转化生长因子β1及其受体的表达
smad4系位于18q2.1上的抑癌基因,其蛋白产物是转化生长因子β(TGF-β)超家族受体的直接底物,对恶性肿瘤的发生、发展及转移有重要影响[1].
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膀胱癌18q缺失做图与Smads蛋白表达分析
目的研究18号染色体短臂的杂合性缺失在膀胱癌发生发展中的作用，为早诊及定位克隆相关基因提供资料。方法利用位于18q上的12个多态性微卫星位点进行缺失做图，并对此区域的抑癌基因Smad 2和Sma d 4进行免疫组织化学分析。结果 84.2%（32/38）的病例至少在12个位点中的一个发生杂合性缺失，小缺失区域跨越Smad 4基因。免疫组化结果显示：Smad 2蛋白有21.1%（8/38）表达上调，34.2%（13/38）表达下调；Smad 4蛋白有68.4%（26/38）表达下调而仅1例表达上调。结论 18号染色体短臂的缺失与膀胱癌变相关。位于18号染色体短臂的两个候选抑癌基因Smad 2和 Smad 4的异常表达，对于膀胱癌的发生、发展可能有着重要作用。
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遗传性出血性毛细血管扩张症Smad4基因的筛查
目的：检查遗传性出血性毛细血管扩张症（HHT）患者中Smad4基因突变及听力情况。方法根据2000年Shovlin提出的临床诊断标准，对7例ENG和ACVRL1基因筛查均阴性的HHT患者进行Smad4基因筛查和听力检查。结果7例患者smad4基因测序均未发现突变位点，2例患者除严重鼻出血外还伴肝脏血管畸形，7例患者均无听力障碍、胃肠出血者及肠息肉患者。结论 Smad4基因与HHT、耳聋的相关性值得进一步研究，为疾病诊疗提供新的思路。
关键词： SMAD4基因 耳聋 遗传性出血性毛细血管扩张症 -
阻断TGF-β1信号传导在减缓四氯化碳/乙醇诱导的小鼠肝细胞癌发展中的作用
目的探讨反义Smad4RNA阻断转化生长因子-β1(TGF-β1)信号传导系统及其对肝癌发生发展的影响.方法采用逆转录病毒将反义Smad4基因导入四氯化碳(CCl4)/乙醇诱导的小鼠肝脏,经Southern印迹证实反义Smad4基因已经整合入小鼠肝脏,Northern印迹及Western印迹方法显示反义Smad4基因能下调Smad4的表达.结果发现纤维化肝脏Smad4的表达较正常组明显增强.经转基因处理后小鼠纤维化肝脏Smad4的表达明显弱于硬化组,且肝脏纤维化程度明显减轻.防治组和硬化组比较肝癌的发生率无明显差别,但防治组肝癌包块的直径、数目均不同程度地少于硬化组.结论反义Smad4基因能有效阻断TGF-β信号传导,从而减缓肝纤维化的程度;同时,能减缓肝癌的发展进程.
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反义Smad4基因对贮脂细胞系CFSC生物学特性的影响
目的探讨通过反义Smad4基因转移阻断转化生长因子β1(TGF-β1)的信号传导后对贮脂细胞部分生物学特性的影响.方法分别构建、重组了含有反义Smad4基因序列的复制缺陷型腺病毒表达载体AdvATSmad4和空病毒表达载体Adv0.将两种复制缺陷型腺病毒扩增纯化,再分别转入贮脂细胞系CFSC内,测定它们生长曲线、3H掺入率(3H-TdR)、脯氨酸掺入等部分生物学特性的变化,并用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western 印迹和免疫组织化学等方法检测转基因细胞Smad4和细胞外基质的表达.结果与正常对照组CFSC和转染Adv0的CFSC细胞相比较,转染AdvATSmad4的CFSC细胞内有反义Smad4表达,其生长曲线、3H-TdR、脯氨酸掺入等均有不同程度的降低,且其合成分泌Smad4和细胞外基质减少.结论反义Smad4 基因可以抑制贮脂细胞内源性Smad4的表达,抑制贮脂细胞的生长、繁殖和细胞外基质的产生,可作为抗肝纤维化基因治疗的选择之一.
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Smad4静默对K-ras突变小鼠胰腺PanIN细胞增殖及转移能力的影响
背景与目的：由己建立的小鼠基因打靶模型证实，K-ras突变启动了胰腺癌前病变-胰腺上皮内瘤变(pancreatic intraepithelial neoplasia，PanIN)，p53、p16失活均可单独促进小鼠PanIN发展为浸润性胰腺癌。作为人胰腺癌中另一失活频率高发的抑癌基因Smad4，本课题组前期研究提示，应用RNA干扰技术沉默PanIN细胞株中内源性Smad4表达，促使PanIN细胞恶性转化。基于此目的，本研究进一步探讨siRNA干扰Smad 4基因对PanIN细胞体内外增殖及转移能力的影响，从而有助于阐明PanIN恶性转化的新机制。方法：构建和筛选能特异性静默PanIN细胞中Smad4表达的佳siRNA稳定表达质粒,稳定转染佳siRNA表达质粒进入PanIN细胞，用Zeocin筛选稳定转染克隆，挑选阳性克隆、扩增，稳定转染后细胞命名为PanIN-S。本研究运用细胞计数、克隆形成实验等分别比较两组在活细胞率和体外增殖能力的影响，同时为进一步验证Smad 4基因静默对PanIN细胞体外迁移、侵袭能力的影响，本研究采用Transwell和Mitigel assay检测其干扰前后体外运动、侵袭能力。动物实验中，建立PanIN及PanIN-S细胞组裸鼠移植瘤模型，并应用免疫组化方法检测并比较两组PCNA、VEGF和MMP-9的表达及其差异。结果：成功构建了Smad4基因siRNA体系；体外实验中与PanIN组相比， PanIN-S组细胞增殖、侵袭能力明显增强，差异有统计学意义(P<0.05)；动物模型免疫组化结果显示，与PanIN组相比，PanIN-S组PCNA、VEGF和MMP-9表达显著增高(P<0.05)。结论：K-ras突变基础上小鼠PanIN细胞Smad4基因静默促使PanIN细胞的恶性转化；PanIN基础上Smad4静默促使小鼠PanIN细胞体内外增殖及转移能力的增强，其增殖及转移可能与PCNA、VEGF和MMP-9高表达有关。
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Smad4基因沉默促进PanIN裸鼠移植瘤增殖和微血管形成的研究
背景与目的:由已建立的小鼠基因打靶模型证实,K-ras突变启动了胰腺癌前病变一胰腺腺管内上皮瘤(pancreatic intraepithelial neoplasia,PanIN),p53或p16失活均可单独促进小鼠PanIN发展为浸润性胰腺癌.作为人胰腺癌中另一失活频率高发的抑癌基因Smad4,其失活对PanIN的转化作用及是否可单独促进PanIN发展为胰腺癌目前仍不清楚.基于此目的,在已成功分离建立K-ras突变启动的PanIN细胞株基础上,本研究拟进一步应用RNA干扰技术沉默PanIN细胞株中内源性Smad4表达,以探讨siRNA干扰Smad4基因对PanIN细胞恶性转化作用.方法:构建Smad4基因沉默慢病毒质粒,筛选Smad4沉默稳转细胞并命名为PanIN-S细胞;分别用PanIN和PanIN-S细胞并采用皮下接种的方法,构建获得PanIN及PanIN-S细胞组裸鼠移植瘤模型(每组5只),2周后测定各组肿瘤体积和质量;应用免疫组织化学SP法检测并比较各组增殖细胞核抗原(PCNA)和CD31的表达及其差异.结果:成功构建了Smad4基因SiRNA体系;与未干扰PanIN细胞组相比,PanIN-S组裸鼠肿瘤体积和质量显著增加(P<0.05);组织病理学检查,符合胰腺癌(腺癌);免疫组织化学结果显示PCNA和CD31表达显著增高(P<0.05).结论:Smad4基因沉默可促使在K-ras突变基础上的小鼠PanIN细胞的恶性转化;裸鼠移植瘤中Smad4失活可显著促进小鼠移植瘤增殖和肿瘤微血管形成,这些可能是其致瘤恶性转化的重要作用机制.
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前癃通胶囊含药血浆对前列腺间质细胞Smad4基因表达的影响
目的:探讨中药前癃通胶囊含药血浆对体外培养前列腺间质细胞Smad4基因表达的影响,为中药复方治疗良性前列腺增生(BPH)提供实验依据. 方法:收集2012年8～ 10月门诊BPH患者15例,按照随机数字表对入选患者进行实验分组,分为前癃通高、中、低剂量组,制备前癃通含药血浆.同时,体外培养前列腺间质细胞,当细胞接近长成单层后进行免疫荧光检测,进行间质细胞鉴定;加含药血浆后培养24h,采用实时荧光定量PCR(q-PCR)技术检测间质细胞Smad4基因表达;Western印迹检测Smad4蛋白在间质细胞的表达. 结果:经含药血浆处理后间质细胞Smad4基因mRNA的表达随药物剂量增加依次增强,与空白组、无血浆组比较,各组差异均有统计学意义(P＜0.01).经含药血浆处理后间质细胞Smad4蛋白的表达随药物剂量增加依次增强,与空白组比较,低剂量组差异无统计学意义(P＞0.05),中剂量组差异有统计学意义(P＜0.01);与低剂量组比较,中剂量组差异有统计学意义(P＜0.05);与高剂量组比较,各组之间差异均有统计学意义(P均＜0.01). 结论:中药前癃通胶囊含药血浆体外培养前列腺间质细胞,可抑制其增殖,其机制与促进Smad4基因及蛋白表达有关.
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大肠癌SMAD4基因研究进展
SMAD4是近年来从染色体18q21.1分离出的一个候补肿瘤抑制基因,其编码的蛋白SMAD4参与了转化生长因子β(TGF-β)超家族细胞内信号传导过程.SMAD4是信号传递蛋白SMADs的功能活动中心.人大肠癌组织中常有染色体18q21的缺失,其中包括DCC、SMAD4和SMAD2等基因,SMAD4纯合性丢失可能参与了结直肠癌的致癌过程,并在晚期结肠癌生长中起重要作用,为临床肿瘤治疗开辟新的思路.
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TGFβ1与Smad 4基因在肝细胞癌中的表达及意义
目的 探讨TGFβ-Smad信号通路中TGFβ1与Co- Smad(Smad 4)与肝细胞癌的发生、发展的关系.方法 采用免疫组化ABC法及原位杂交法(ISH),检测41例肝细胞癌组织与癌旁组织中TGFβ1、Smad 4蛋白、Smad 4 mRNA的表达,以5例外伤性肝破裂手术切除标本作为正常对照.比较HCC组与时照组及HCC癌旁中TGFβ1与Smad 4蛋白、Smad4 mRNA表达的差异,并进行图像分析.结果 正常对照组中TGFβ1呈阴性表达,Smad 4蛋白、Smad 4 mRNA均呈阳性表达;HCC组织中TGFβ1阳性表达率为78.0%(32/41),癌旁组织中为95.1%(39/41),两者比较差异显著(P<0.05);Smad 4蛋白在HCC组织中阳性表达率为48.8%(20/41),在癌旁组织中为78.0%(32/41),两者比较有显著性差异(P<0.01);Smad 4 m RNA在HCC组织中阳性表达率为51.2%(21/41),在癌旁组织中为73.1%(30/41),两者比较有显著性差异(P<0.05);与正常肝组织比较,HCC组织中Smad 4蛋白和Smad 4 mRNA阳性表达率均显著降低(P<0.05);Ⅰ、Ⅱ级HCC组织与Ⅲ、Ⅳ级HCC组织Smad 4 m RNA阳性表达存在显著差异(P<0.05),Ⅲ、Ⅳ级阳性表达率较Ⅰ、Ⅱ级降低;Smad 4蛋白的阳性面积百分比、光密度及Smad 4 m RNA的阳性面积百分比癌旁组织均显著高于HCC组织(P均<0.05).HCC组织中Smad 4蛋白、Smad 4 m RNA表达与TGF-β1表达比较均存在显著差异(P<0.05),但均无显著相关性(P>0.05).结论 TGFβ1过表达、Smad4表达缺失可能在肝细胞癌的发生、发展中发挥重要作用.
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TGF-β及其伙伴分子Smad4在胃癌组织中的表达
目的:探讨TGF-β及其伙伴分子Smad4在胃癌组织中的表达.方法:利用逆转录(RT)-PCR技术测定胃癌组织TGF-β mRNA和smad4mRNA水平,并分析两者与胃癌患者各项临床病理指标间的关系.结果:Smad4mRNA在胃癌组织中的B日性表达率明显下降.TGF-β和Smad4均与胃癌组织的分化程度、肿瘤大小、浸润深度、淋巴转移和TNM分期有关.Smad4 mRNA在胃癌组织分化程度高、肿瘤＜5cm、浸润深度浅、无淋巴转移、TNM分期较早的患者中阳性表达率高.TGF-β mRNA在胃癌组织中的阳性表达率明显升高.TGIF-βmRNA在胃癌组织分化程度高、肿瘤＜5cm、浸润深度浅、无淋巴转移、TNM分期较早的患者中阳性表达率低.胃癌组织中TGF-β和Smad4表达间呈负相关.结论:TGF-β和Smad4共同调节胃癌的发生、发展及其生物学行为.
关键词： 胃肿瘤 逆转录-聚合酶链反应 转化生长因子β SMAD4基因 -
遗传性出血毛细血管扩张症分子遗传学研究进展
遗传性出血性毛细血管扩张症(hereditary hemorrhagic telangiectasis, HHT,OMIM 187300)是常染色体显性遗传性血管发育导常的一种疾病.目前,该病的相关基因有3种,分别是ENG、ALD-1和SMAD4基因.通常由ENG突变引起HHTI型,ALK-1突变引起HHT2型,SMAD4突变引起JPHT型.对HHT进行遗传流行病学分析及其深入的分子遗传学研究有利于指导其临床诊治和预防.
关键词： 遗传性出血性毛细血管扩张症 ENG基因 ALK-1基因 SMAD4基因 突变 -
TGF-β及其伙伴分子Smad4在大肠癌组织中的表达
目的 探讨转化生长因子-β(TGF-β)及其伙伴分子Smad4基因在大肠癌组织中的表达.方法 利用RT-PCR技术测定大肠癌组织TGF-β mRNA和Smad4 mRNA水平,并分析二者与大肠癌患者临床病理的关系.结果 Smad4 mRNA在大肠癌组织中的阳性表达率明显下降.Smad4与大肠癌组织的分化程度、肿瘤大小、浸润深度、淋巴转移和TNM分期有关.TGF-β与大肠癌组织的浸润深度、淋巴转移和TNM分期有关.Smad4 mRNA在大肠癌组织分化程度高、肿瘤＜ 5 cm、浸润浅、无淋巴转移、TNM分期较早患者的阳性表达率高.TGF-β mRNA在大肠癌组织中的阳性表达率明显升高.TGF-β mRNA在浸润浅、无淋巴转移、TNM分期较早的大肠癌患者中阳性表达率低.大肠癌组织中TGF-β与Smad4表达呈负相关.结论 TGF-β和Smad4共同作用于大肠癌的发生、发展的各生物学行为.
关键词： 结肠肿瘤 直肠肿瘤 逆转录-聚合酶链反应 转化生长因子-β SMAD4基因 -
抑癌基因Smad4对HepG2生长的影响及其机制探讨
目的 研究抑癌基因Smad4对人肝癌细胞株HepG2生长的影响,并探讨其作用机制.方法 采用脂质体瞬时转染法转染PFTX-5 Smad4质粒至人肝癌细胞株HepG2(实验组),以转染空质粒PFTX-5的HepG2细胞为对照组,野生型HepG2细胞为空白组,利用免疫印迹(Western blot)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Smad4及血管内皮生长因子(VEGF)表达的变化;用MTT法检测细胞增殖及用FITC-Annexin V、碘化吡啶(propidiumiodide,PI)双染后流式细胞仪(FCM)检测细胞周期和凋亡情况,Westernblot检测细胞周期素D1(Cyelin D1)表达差异.结果 PFTX-5 Smad4瞬时转染到肝癌细胞后,实验组与对照组和空白组相比,Smad4 mRNA和蛋白表达明显上升(P<0.05),而VEGF mRNA和蛋白的表达显著降低(P<0.05).实验组细胞CyclinD1表达明显下降(P<0.05),细胞周期时相分布出现合成前期(G0/G1期)阻滞.实验组细胞凋亡率明显升高(P<0.01),增殖受到明显抑制.结论 Smad4高表达可能通过降低肝癌细胞中VEGF的表达,抑制cyclinD1转录合成,并诱导强烈的G1期阻滞和细胞凋亡,对细胞的增殖有明显的抑制作用,为进一步研究肝癌生长增殖机制提供了实验基础.
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人Smad4克隆及真核表达载体的构建与鉴定
目的:克隆人抑癌基因Homo sapiens SMAD family member 4(NM_005359 1659 bp)mRNA构建人Smad4的真核表达载体.方法:从膀胱癌患者膀胱组织中提取总RNA,经RT-PCR得到Smad4基因开放阅读框架cDNA序列,并将其定向克隆到真核表达载体pcDNA3.0,构建含目的基因的pcDNA3.0-Smad4重组质粒.结果:经基因序列测定、PCR和酶切分析,证实插入载体pCDNA3.0的片段为日的基因开放阅读框的核苷酸序列.结论:重组质粒pCDNA3.0-Smad4构建成功,为该基因的蛋白表达及其相关功能研究奠定了基础.
