EB病毒潜伏膜蛋白2多表位DNA联合多肽的免疫效应研究

目的 研究HPV L1携带EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2(LMP2)多表位DNA联合多肽的免疫效应. 方法 BALB/c雌性小鼠随机分为4组.pcHPVL1-EBV LMP2 DNA免疫组,肌肉注射pcDNA3.1(+)/HPVL1-EBV LMP2多表位DNA,每鼠每次100 μg;DNA联合多肽免疫组:先用DNA免疫,每鼠每次50 μg,同时皮下注射EBV LMP2多表位肽,每鼠每次5 μg;DNA免疫对照组:肌肉免疫空载体pcDNA3.1(+),每鼠每次100 μg;多肽免疫对照组:每鼠每次10 μg皮下注射不相关多肽.共免疫4次,间隔2周.免疫后第7周收集小鼠血清,采用ELISA法检测小鼠EBV LMP2特异性抗体IgG、IgA以及HPVL1特异性抗体IgG;免疫后第9周测定EBV特异性抗体IgG1与IgG2a亚类,同时采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定小鼠脾细胞CTL的杀伤活性. 结果 多肽联合DNA免疫组小鼠血清EBV LMP2特异性抗体IgG、IgA A值分别为1.573±0.025和0.436±0.033,单独DNA免疫组分别为1.282±0.051和0.317±0.022,差异有统计学意义(F=80.393,27.722,P＜0.05);两免疫组小鼠血清HPV L1特异性IgG A值别为0.648±0.063和0.702±0.023,差异无统计学意义(F=1.952,P＞0.05).DNA免疫组IgG1和IgG2a A值别为0.723±0.023和0.594±0.084,差异无统计学意义(F=6.643,P＞0.05),是混合Th1/Th2免疫反应类型;多肽联合DNA免疫组IgG1和IgG2aA值别为0.897±0.042和0.629±0.035,差异有统计学意义(F=72.306,P＜0.05),是偏向Th2免疫反应类型.多肽联合DNA免疫组在效靶比为10∶1时,小鼠脾细胞CTL杀伤效应(杀伤率)为27.70％,DNA免疫组为21.50％,差异有统计学意义(F=51.559,P＜0.05). 结论 多肽联合DNA免疫可产生有效的CTL杀伤效应,更能发挥有效的体液免疫作用,其免疫策略可为EBV相关肿瘤的免疫治疗提供参考.

人类寄生虫重组疫苗研究进展

随着医学技术的不断发展,疫苗从问世到现在一直被认为是控制,预防和消除感染性疾病中有效的措施之一.由于寄生虫独特的生物学特性,相对病毒和细菌而言它们更复杂,它们有着更丰富的基因组,多阶段的生活史和抗原的多样性,所以针对寄生虫病疫苗一直处于在研阶段.本文通过检索近几年国内外学者针对疟原虫、阿米巴、弓形虫、隐孢子虫等寄生虫病疫苗新的研究成果,总结了其中有可能成为新型候选疫苗位点的研究进展.

WT1抗原多表位与热休克蛋白70刺激表位融合基因疫苗的构建、表达及免疫原性研究

本研究用基因工程方法构建一种由WT1抗原多表位与结核分枝杆菌热休克蛋白70(mHSP70)刺激表位组成的融合基因疫苗并检测其表达和病疫原性.根据文献资料,筛选WT1抗原有良好免疫原性的3个受HLA0201与1个受HLA2402限制性的细胞毒性T细胞(CTL)表位及2个辅助性T细胞(Th)表位,加入通用外源性T细胞刺激表位Pan-DR-Th(PADRE)后,以不同的间隔序列相连,蛋白酶体切割软件优化多表位构成,合成1条由732 bp组成的多表位WT1基因片段,并插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中.通过PCR技术从结核分支杆菌基因组(mycobacterium tuberculosis heat shock protein 70,mHSP70)中扩增包含mHSP70刺激表位的DNA片段,亚克隆至pcDNA3.1(+),测序正确后将含有多表位的WT1基因片段亚克隆入该载体上游,构建融合基因疫苗pcDNA3.1-WT1-mHSP70(407-426).用RT-PCR方法检测该基因在293T细胞表达,并免疫C57BL/6小鼠,酶联免疫吸附斑点法(ELISPOT)检测该疫苗的细胞免疫学反应.结果表明:通过蛋白酶体切割工具PAPROC及NETCHOP3.1预测,复合多表位基因工程疫苗各表位可被正确裂解,PCR和酶切鉴定结果表明,构建的重组真核表达质粒pcDNA3.1-WT1-mHSP70(407-426)含有正确编码的融合基因片段,并在真核细胞获得了正确表达.将该基因疫苗免疫小鼠后,可诱导特异性的CTL应答.结论:成功构建含有WT1多表位与热休克蛋白70刺激表位融合基因疫苗.

多表位BCR-ABL融合基因的合成、克隆及表达研究

慢性粒细胞白血病(CML)的免疫治疗是清除白血病微小残留病并终根治CML的方向之一,包含BCR-ABL融合区的多肽具有良好的免疫原性,在体内、外可诱发BCR-ABL特异的T细胞克隆.以BCR-ABL融合肽瘤苗激发特异性T细胞应答抗CML免疫治疗有希望成为根治CML残留白血病的有效手段.本实验通过基因工程技术,设计一个280 bp的融合抗原基因片段,包含HLA-A2,HLA-A3,HLA-DR11等3个限制性BCR-ABL抗原表位,以及破伤风类毒素和霍乱毒素B亚单位的外源T细胞刺激表位.该融合抗原基因已在大肠杆菌中获得高效表达,所纯化的融合蛋白具有良好的活性及抗原性,为进一步实验奠定了基础.

乙型肝炎病毒多表位抗原基因的设计、合成及表达

目的设计合成乙型肝炎病毒多表位抗原基因并在大肠杆菌中表达,以期获得兼具预防和治疗作用的新型乙肝疫苗. 方法设计并合成一条乙型肝炎病毒(HBV)多表位抗原基因(P/T),该基因包括HBV前S2区的核苷酸序列,和分别来自乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎核心抗原、乙型肝炎DNA聚合酶的其它4个连续的HLA限制性抗原表位的核苷酸序列.基因合成后克隆入载体质粒pWR450-1,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导P/T基因与载体质粒的β-半乳糖酐酶基因融合表达. 结果成功合成并拼接出乙型肝炎多表位抗原基因P/T,阳性重组子PWR/HBV-P/T构建成功,并在大肠杆菌中融合表达出相对分子质量(Mr)约75×103的碱性蛋白质. 结论初步设计成功HBV多表位抗原基因,在大肠杆菌中可表达出具有良好抗原性的重组融合蛋白,可能是较理想的HBV预防、治疗性疫苗候选物.

梅毒苍白密螺旋体多表位抗原基因的构建、表达及免疫反应性的鉴定

目的 为梅毒检测试剂提供特异性强、灵敏度高的新型多表位重组抗原.方法 PCR扩增Tp17和Tp0453基因的优势抗原表位,连接后插入pQE32质粒中构建多表位嵌合重组体pQE32/Tp0453-17,IPTG诱导表达,免疫印迹法检测表达产物的免疫反应性.结果 成功构建了多表位嵌合重组质粒pQE32/Tp0453-17,经酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Tp0453和Tp17基因,片段长约1180 bp,其测序结果与GenBank上登录序列完全一致;SDS-PAGE分析表达产物发现,融合基因表达的重组蛋白Mr约为52×103,表达产物占全菌总蛋白的19.3%,并且在细胞内主要以包涵体形式存在;用Western印迹法检测显示,该重组蛋白能与梅毒患者的阳性血清反应,具有良好的抗原性.结论 成功表达了具有良好免疫反应性的多表位嵌合重组抗原,为新型梅毒快速诊断试剂盒的研究奠定了良好的实验基础.

流感亚型H3579抗A型多表位核酸疫苗免疫指标检测

流感是一种由流感病毒引起的传染病,发病率高、破坏性强,全球每年有25 ～ 50万死于流感[1].目前流感的预防均选择灭活疫苗,但其不能够有效应对流感病毒变异的速度,开发新型疫苗显的尤为重要.多表位核酸疫苗是将抗原基因内部抗原的活性部位与表达质粒通过串联插入而构建,能够有效发挥疫苗内部抗原表位的优势,去除保护性免疫中不利因素(潜在片段中毒性成分结构),同时能够对流感病毒中抗原表位的各种型别进行优化组合,为多价疫苗的研发提供基础模型[2-3].

细胞毒性T淋巴细胞活性检测方法进展

细胞毒性T 淋巴细胞（ Cytotoxic T lymphocyte， CTL）活性的测定是了解机体细胞免疫功能的重要方法。肿瘤免疫治疗中使用肿瘤表位分子使特异性的CTL激活并扩增，达到清除肿瘤细胞的目的［1］，抗病毒多表位DNA 疫苗也在快速发展［2］，这些研究中CTL的定性和定量检测非常重要，因此如何更好地检测CTL活性成为一个关键的问题。近年来，许多新的评估CTL活性的方法得到发展，本文就此做以综述。

乙型肝炎病毒重组多表位抗原诱发的小鼠免疫应答

目的:对乙型肝炎病毒重组多表位抗原基因在大肠杆菌中表达的融合蛋白P/BPT进行免疫原性分析,以期为HBV预防/治疗性疫苗的研制奠定实验基础.方法:构建重组质粒pWR450-1/BPT,在大肠杆菌中诱导表达并纯化蛋白P/BPT,免疫BALB/c小鼠,乳酸脱氢酶释放法检测该融合蛋白诱导小鼠的细胞毒T淋巴细胞(CTL)应答,ELISA法检测小鼠血清抗-P/BPT抗体水平,流式细胞仪检测小鼠CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群比例,用RT-PCR方法半定量检测细胞因子特异性mRNA,MIT法测淋巴细胞增殖效应.结果:P/BPT蛋白免疫后,效靶比为100:1时,可有效诱发特异性CTL应答(P＜0.05);ELISA方法测出小鼠血清抗-P/BPTIgG明显升高(P＜0.05);P/BPT蛋白免疫后,可显著刺激小鼠脾淋巴细胞增值(P＜0.05);CD4+T淋巴细胞和细胞因子IFN-γ的增殖和分泌水平亦有明显升高.结论:该融合蛋白可有效诱导小鼠体液免疫和细胞免疫应答,为进一步研制乙肝预防治疗性疫苗奠定了初步基础.

肿瘤免疫治疗实验研究的新热点——Exosome

肿瘤治疗除手术、放疗和化疗外,免疫治疗已成为治疗肿瘤的方法.肿瘤的主动特异性免疫疗法(ASI)是近年研究的热点,目前应用于临床实验的多表位肿瘤抗原主要来源于肿瘤细胞的溶泡物质,但真正实用的肿瘤相关抗原十分有限.

低限度免疫定义基因表达的HCV多表位DNA疫苗对小鼠细胞免疫的诱导作用

目的：探讨采用低限度免疫定义基因表达法制备丙型肝炎病毒（HCV）多表位 DNA疫苗的可行性，阐明该方法在疫苗领域可能的应用价值。方法：采用人工合成和 PCR 方法制备长度为1346 bp 的含有CMV启动子、HCV 1b亚型多表位和牛生长激素（BCG）多聚腺苷酸序列的低限度免疫定义基因表达 DNA疫苗，命名为M-HCV-epi；同时制备结构基因被非 HCV同源的DNA序列替换的相同长度DNA片段作为对照，命名为V-pcDNA3.1。12只ICQ小鼠随机分为实验组（n＝6）和对照组（n＝6），分别采用M-HCV-epi DNA和V-pcDNA3.1 DNA各20μg皮下注射。QRT-PCR法检测免疫后小鼠脾细胞中干扰素γ（IFN-γ）mRNA的表达水平；人工合成3个 HCV 1b亚型表位多肽和1条对照多肽。用上述合成的多肽刺激免疫后小鼠脾细胞，ELISA法检测脾细胞刺激上清中 IFN-γ水平。结果：与对照组比较，实验组小鼠脾细胞中 IFN-γmRNA表达水平升高（1.50±0.18）倍（P＜0.05）；加入 aa35-44多肽的实验组小鼠脾细胞培养上清中 IFN-γ水平较对照组明显升高（P＜0.05）。结论：低限度免疫定义基因表达法制备 HCV多表位 DNA疫苗可诱导细胞免疫反应，该方法在DNA疫苗领域可能具有应用价值。

C3d分子多表位DNA疫苗体液免疫应答的增强作用

目的 研究C3d分子对多表位DNA疫苗体液免疫应答的增强作用.方法 通过PCR方法合成多表位HME基因,分别插入真核表达载体pcDNA3.1和pcDNA3.1-3C3d,构建多表位DNA疫苗pcDNA3.1-HME和pcDNA3.1-HME-3C3d,经肌肉注射免疫小鼠,ELISA检测小鼠特异性抗体水平.结果 经免疫的小鼠均能产生针对各表位的特异性IgG抗体,且pcDNA3.1-HME-3C3d免疫组小鼠的抗体水平明显高于pcDNA3.1-HME免疫组.结论 C3d可增强多表位DNA疫苗的体液免疫应答水平.

多表位病毒疫苗的研究进展

多表位病毒疫苗是目前病毒疫苗研制的热点，特别是对于易变异或者本身有癌基因的病毒。本文就近年来这方面的研究进展作一综述。

050 编码C群脑膜炎球菌荚膜多糖模拟肽的多表位DNA疫苗诱导的保护性抗体

新型A族链球菌多表位M蛋白疫苗经注射和粘膜免疫小鼠后的免疫原性

可食用成人麻疹疫苗

麻疹疫苗诱生的免疫力弱于自然免疫,免疫力的降低终使成人需要再免疫.本文介绍了成人免疫接种的策略:将可表达合适麻疹病毒抗原的可食用植物用作成人麻疹疫苗.

弓形虫多表位基因的构建及其在大肠杆菌系统中的表达鉴定

目的构建弓形虫和破伤风毒素多个表位的编码基因,将其在大肠杆菌系统进行表达,评价重组抗原的特异反应性.方法从弓形虫保护性抗原及通用免疫增强佐剂破伤风毒素中选取含有T和(或)B细胞表位的抗原片段,通过软件分析在各片段之间插入适当数目、起间隔作用的氨基酸,以保持个片段的空间构象独立性,从而确定氨基酸顺序.根据氨基酸序列选取适当的密码子构成弓形虫多表位基因.将该基因合成并鉴定后,亚克隆入原核表达载体,在大肠杆菌中表达并分析表达产物的表达形式和抗原活性.结果成功构建了长度为360bp的弓形虫多表位基因.该基因在原核表达系统中经诱导,得到了14.4kDa的包涵体形式的表达产物.免疫印迹实验表明该产物具有强特异性抗原活性.结论弓形虫多表位基因在原核中的表达产物在弓形虫病疫苗及诊断中有潜在的应用价值.

丙型肝炎病毒多表位抗原在恒河猴中的免疫应答及保护性试验

利用HCV抗原多表位来研制HCV疫苗是目前的一个新方向.本研究利用HCV的HCV的5个保守表位串联,并加入破伤风类毒素上的一个T细胞激活位点,设计成一个HCV多表位抗原基因PCX,在大肠杆菌中表达,用此蛋白免疫恒河猴,诱导猴体产生了较高的抗体水平,滴度达1:1000以上,在免疫后的60周抗体滴度仍达1:40以上.同时,在免疫后6周用人HCV阳性血清攻击猴子,免疫PCX的猴子出现一过性ALT升高,在攻击后三周内用RT-PCR检测到猴血清内HCV的RNA阳性.结果表明,免疫多表位的PCX蛋白可以诱导机体产生高水平的免疫应答.

具有免疫反应性的弓形虫多表位抗原在大肠杆菌中的可溶性表达和鉴定

目的获得弓形虫多表位基因在原核系统中可溶性表达产物,为弓形虫病重组抗原试剂盒的制备及疫苗的研究奠定基础.方法以PCR法扩增弓形虫多表位基因,使其两端带有与载体pET32a相匹配的酶切位点,插入载体pET32a,酶切并测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG进行诱导,SDS-PAGE分析和鉴定该基因的表达水平、表达产物的可溶性及其相对分子质量,Western-blot分析表达产物的免疫反应性.结果该基因在原核表达系统中经诱导,得到了Mr31000的可溶性融合表达产物.经Ni-NTA纯化,纯度可达90%以上.免疫印迹实验表明该产物能够被弓形虫B36感染的小鼠血清和弓形虫RH感染的兔血清特异识别.结论弓形虫多表位基因在原核中的可溶性表达产物在弓形虫病诊断及疫苗研究中有潜在的应用价值.

乙型肝炎病毒多表位治疗性抗原基因的合成、表达及抗原性研究

目的研究乙型肝炎病毒多表位治疗性疫苗基因的合成、表达及其产物的抗原性.方法设计、并合成乙型肝炎病毒多表位抗原基因BPT,克隆入融合表达载体pWR450-1,构建重组质粒PWR/BPT.在大肠杆菌中表达乙型肝炎多表位抗原蛋白并纯化该蛋白,并用Westem-blotting方法初步检测该抗原蛋白的抗原性.结果成功构建了融合表达载体PWR/BPT,在大肠杆菌中表达出乙型肝炎多表位抗原蛋白,Western-blotting检测显示该蛋白具有良好抗原性.结论HBV多表位治疗性抗原基因的设计是成功的,其在大肠杆菌中表达的重组融合蛋白具有良好的抗原性,可能是较理想的HBV治疗性疫苗候选物.