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β-连环素在人颈椎终板软骨中的表达及其意义
目的:观察β-连环素在人颈椎椎体终板软骨中的表达变化,探讨其与终板软骨退变的关系及意义.方法:选取2011年9月至2012年3月间住院接受颈前路椎体次全切手术的颈椎终板软骨标本,分为退变组(28例)和对照组(10例),运用RT-PCR和western-blot法检测终板软骨组织中β-连环素、蛋白多糖、Ⅱ型胶原及Sox9基因的表达.结果:退变组和对照组均可检测到β-连环素的表达,而退变组β-连环素表达量明显高于对照组(P＜0.01),蛋白多糖、Ⅱ型胶原及Sox9基因表达量明显低于对照组(P＜0.01).结论:人退变颈椎终板软骨组织内β-连环素表达明显升高,提示其与椎体终板软骨退变存在重要关系.
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骨髓间充质干细胞软骨分化生物学的影响因素
间充质干细胞(MSCs)因具有在适宜的体内或体外条件下分化形成软骨组织的潜能,且易于从骨髓中分离和体外大量扩增纯化,便于自体移植,故被认为是软骨组织工程有希望的种子细胞来源之一[1].然而,MSCs在体外培养条件下软骨表型的分化却是一个受多种因素限制的复杂过程.目前其调控机制仍不是很清楚.已知局部环境是影响MSCs向软骨细胞转化的重要因素,低氧张力、高细胞密度、局部应用生长因子等均有利于MSCs分化为软骨细胞.
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以ITS为主要成分的无血清培养基对软骨细胞增殖和表型的影响
目的 观察以ITS为主要成分的无血清培养基对软骨细胞增殖和表型的影响.方法 培养猪耳软骨细胞,分为无血清组和含血清组,无血清组应用包含胰岛素铁硒传递蛋白(ITS)、地塞米松及维生素C为主要成分的无血清培养基;含血清组应用包含10％血清的常规培养基.观察平面和三维培养状态下无血清培养基对软骨细胞增殖、基质分泌和软骨表型维持的作用.结果 平面培养条件下,无血清组的细胞增殖率出现下调,细胞表型不能维持.在三维培养情况下无血清组可以保持软骨细胞存活和软骨细胞的表型,Ⅱ型胶原和蛋白多糖组织学染色结果与含血清组无明显差异,软骨特异幕困ColⅡ、Aggrecan的表达与含血清组无明显差异,并能够形成较好的软骨样组织.结论 以ITS、地塞米松及维生素C为主要成分的无血清培养基,在三维培养条件下能基本保持软骨细胞的存活和表型,可用于软骨细胞的体外三维培养.
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TGF-β1诱导成体干细胞向软骨分化的研究进展
软骨缺损的修复在临床上一直以来都是一个难题,主要是因为软骨自身修复能力很弱,而目前较常应用的软骨细胞移植法,又受到细胞来源的限制.因此人们对软骨缺损修复的研究开始转向了成体干细胞向软骨细胞诱导分化上.近年来应用于诱导成体干细胞向软骨细胞分化的生长因子有很多,TGF-β1就是其中重要的一种.作为一种多功能的缩氨酸,TGF-β1是一种应用广泛的生长因子,它在诱导软骨分化和维持软骨表型上起着重要作用[1],而且,Dickinson等的研究指出,在软骨发生过程中,有高浓度的TGF-β1mRNA或蛋白的表达[2].本文就TGF-β1在诱导成体干细胞向软骨细胞分化方面的作用综述如下.
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永生化髁突软骨细胞软骨表型的特征
体外培养的髁突软骨细胞(mandibular condylarchondrocyte,MCC)常表现出不同分化状态的软骨细胞并存,其表型特征也随培养时间而变化,这些不稳定的因素为研究MCC的生物学特性带来了一定的困难.作者通过基因转染的方法将SV40大T抗原基因导入原代培养的兔髁突软骨细胞,建立了能在体外1年半的时间内稳定传代100次以上的永生化髁突软骨细胞系[1](immortalized mandibular condylarchondrocyte,IMCC).一些实验表明,永生化的软骨细胞失去了软骨细胞的表型特征,本实验将通过免疫组化方法,观察IMCC有无Ⅱ型胶原和软骨特异的蛋白多糖(proteoglycan,PG)的表达.
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缺氧环境通过HIF-1α/YAP信号促进大鼠生长板软骨细胞表型维持
目的 研究缺氧条件下缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)和Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)蛋白在软骨细胞表型维持中的作用.方法 生长板软骨细胞取自7日龄的SD大鼠,并通过氯化钴干预以模拟体外缺氧微环境.通过检测细胞外基质水平和Ⅱ型胶原(Colla-gen 2,Col2)蛋白水平表达变化来确定软骨细胞在氯化钴刺激下软骨表型变化.通过Western blotting方法检测HIF-1α、YAP蛋白水平在氯化钴刺激后的表达变化.结果 氯化钴于体外实验中模拟的缺氧环境能够促进软骨细胞细胞外基质的表达水平,并且能够上调Col2蛋白表达,同时上调HIF-1α和YAP蛋白水平的表达.抑制HIF-1α的表达可以下调缺氧环境所致的YAP蛋白表达水平的上调,而抑制YAP的表达并不能影响HIF-1α蛋白表达水平.结论 氯化钴于体外实验中模拟的缺氧环境可能通过HIF-1α/YAP信号促进大鼠生长板软骨细胞软骨表型的维持.
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细胞骨架结构改变对软骨细胞表型的影响
目的:分析细胞骨架结构改变对软骨细胞表型的影响.方法:二维及三维微团培养兔膝关节软骨细胞,分别破坏软骨细胞骨架的微管、肌动蛋白及波形蛋白,分析细胞骨架改变引起软骨细胞表型改变的关系.结果:破坏软骨细胞骨架的波形蛋白,可引起Ⅱ型胶原蛋白及蛋白聚糖表达下降,且三维微团培养较二维培养下降更明显,而Ⅰ型胶原蛋白表达则无明显改变:破坏软骨细胞骨架的微管,不引起Ⅰ型胶原蛋白、Ⅱ型胶原蛋白及蛋白聚糖表达的改变;破坏软骨细胞骨架的肌动蛋白,在二维培养条件下可促进Ⅱ型胶原蛋白的表达,而在三维微团培养条件下,Ⅱ型胶原蛋白表达则无明显改变.结论:波形蛋白对维持正常软骨细胞表型起重要作用.
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调节软骨细胞骨架蛋白对成软骨表型的影响
目的 研究软骨细胞骨架蛋白结构改变与成软骨细胞表型改变的关系.方法 采用三维微团培养法培养新西兰兔膝关节软骨细胞,将软骨细胞分为对照组、秋水仙碱组、细胞松弛素B组及丙烯酰胺组,通过秋水仙碱、细胞松弛素B及丙烯酰胺分别调节软骨细胞骨架的微管、肌动蛋白微丝及波形蛋白中间纤丝,从大体形态、组织切片染色、免疫组化染色及RT-PCR分析成软骨细胞表型的改变.结果 对照组、秋水仙碱组及细胞松弛素B组细胞较密集、均一,丙烯酰胺组细胞较少、分散.对照组、秋水仙碱组及细胞松弛素B组COLⅡ、蛋白多糖染色深,COL Ⅰ染色浅;而丙烯酰胺组COLⅡ、蛋白多糖染色浅,COL Ⅰ染色较深.RT-PCR数据统计分析显示对照组与秋水仙碱组、细胞松弛素B组相比,COL Ⅰ(1.21 ±0.21 vs 1.55 ±0.06、1.70±0.07)及COLⅡ(1.10 ±0.12vs0.91 ±0.21、0.90 ±0.30)表达差异无统计学意义(P＞0.05);而对照组COLⅡ表达明显多于丙烯酰胺组(0.26 ±0.06),COL Ⅰ表达明显低于丙烯酰胺组(9.63±0.38),差异有统计学意义(P＜0.05).结论 丙烯酰胺调节软骨细胞骨架波形蛋白中间纤丝可明显下调COLⅡ、蛋白多糖的表达.
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二维及微团培养法对软骨细胞表型的影响
目的：探讨二维及微团培养对软骨细胞表型的影响。方法体外高密度二维及微团培养方法培养兔软骨细胞，从细胞形态、细胞外基质表达情况分析软骨细胞表型的差异。结果高密度二维方案培养兔软骨细胞，2周后软骨细胞多层分布， HE染色显示细胞呈圆形，细胞间联系较密，阿尔新蓝染色显示细胞外蛋白多糖分泌较少；微团培养方法培养兔软骨细胞，2周后形成肉眼可见的白色组织，HE染色显示细胞呈多边形，细胞较分散，阿尔新蓝染色显示细胞外蛋白多糖分泌明显多于二维培养，差异有统计学意义（P＜0．05）。结论微团培养方法培养兔软骨细胞，有利于软骨细胞分泌细胞外基质。
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鹿茸多肽对软骨表型化骨髓间充质干细胞凋亡的影响
目的通过观察鹿茸多肽对白细胞介素 1β(interleukin 1β,IL-1β)诱导软骨表型化骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)凋亡的影响,以优化软骨组织工程的种子细胞.方法新西兰大白兔2只,抽取其骨髓;经密度梯度离心得到单核细胞,经体外分离、培养获得兔MSCs.用转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)将其诱导分化软骨表型.将软骨表型化MSCs随机分成A组(空白对照组):5%胎牛血清的α-MEM培养液;B组(IL-1β组):5%胎牛血清的α-MEM培养液加入100 ng IL-1β;C组(鹿茸多肽组):5%胎牛血清的α-MEM培养液加入10 μg/ml鹿茸多肽作用3 d后再加入100 ng IL-1β;D组(TGF-β1组):5%胎牛血清的α-MEM培养液加入10 ng/ml TGF-β1作用3 d后再加入100 ng IL-1β.分别于培养24、48和72 h后取样,采用透射电镜观察细胞形态,Annexin V法检测细胞凋亡率,RT-PCR技术分析Caspase-3 mRNA表达水平,ELISA法检测Caspase-3蛋白酶活性.结果透射电镜观察:B组24 h后细胞核内染色质开始呈块状凝集,分布于核膜下,核膜不规则;48 h后细胞核内染色质凝集加剧;72 h后部分细胞内的核碎片凝集成凋亡小体.各时间点C、D组细胞结构改变相对滞后,且数量较少;A组细胞结构几乎无明显改变.各时间点B组MSCs凋亡率、Caspase-3 mRNA表达及蛋白酶活性逐渐增高,与A组比较差异有统计学意义(P<0.01);C、D组与B组比较则逐渐下降,且差异有统计学意义(P<0.05).结论 Caspase-3参与MSCs凋亡,鹿茸多肽通过减少Caspase-3 mRNA表达,并抑制其蛋白酶活性,阻止或逆转软骨表型化MSCs凋亡.
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人髌下脂肪垫干细胞与骨关节炎软骨细胞间接共培养可促进其向软骨细胞分化
目的 将人髌下脂肪垫干细胞(IPFPSC)及骨关节炎软骨细胞(OAC)进行间接共培养,促进OAC软骨表型的恢复及诱导IPFPSC向软骨细胞分化.方法 体外分离、培养人IPFPSC及OAC,分为单独IPFPSC组、单独OAC组及IPFPSC和OAC间接共培养组,体外成软骨诱导21 d后,通过HE染色、Alcian蓝染色、免疫荧光细胞化学染色检测细胞1型胶原蛋白(Col1)、Col2、Col10、聚集蛋白聚糖(aggrecan)及SOX-9的表达情况.结果 共培养组OAC聚集成微球,IPFPSC呈椭圆形;单独组OAC聚集分布,排列松散,单独组IPFPSC呈长梭形.HE染色显示共培养组OAC聚集成团,核染色深,IPFPSC呈椭圆形,胞质丰富,呈旋涡状生长;单独组OAC聚集分布,核染色浅;单独组IPFPSC呈长梭形,核染色浅.Alcian蓝染色显示共培养组OAC及IPFPSC蛋白多糖分泌多,单独OAC及单独IPFPSC组分泌少.免疫荧光细胞化学染色显示共培养组IPFPSC及OAC中Col2、aggrecan及SOX-9表达较强,Col1与Col10表达较弱;而单独培养的IPFPSC及OAC组则相反.结论 IPFPSC和OAC间接共培养可以促进OAC软骨细胞表型的恢复及诱导IPFPSC向软骨细胞分化.
