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miR-143通过靶向调控K-ras基因的表达抑制宫颈癌HeLa细胞的增殖
目的：探讨miR?143靶向K?ras基因对宫颈癌细胞HeLa增殖的调控作用机制。方法选取宫颈癌细胞系HeLa，分别转染miR?143模拟物和模拟物对照，采用实时荧光PCR法检测HeLa细胞中miR?143的表达。将荧光素酶报告载体与miR?143模拟物共转染，采用荧光素酶活性实验验证miR?143对HeLa细胞的靶向作用。以miR?143模拟物、miR?143模拟物对照以及miR?143模拟物＋K?ras基因分别转染 HeLa 细胞，采用四甲基偶氮唑蓝（ MTT ）法检测各组细胞的增殖活性，采用Western blot法检测各组细胞中K?ras蛋白的表达。选取5例人宫颈癌组织标本和宫颈上皮内瘤变组织样本，采用实时荧光PCR法检测miR?143的表达，采用Western blot法检测K?ras蛋白的表达。结果实时荧光PCR检测结果显示，转染miR?143模拟物组宫颈癌HeLa细胞中miR?143的表达水平为3．31±0．45，明显高于阴性对照组（0．97±0．22， P＜0．05）。双荧光素酶活性检测结果显示，miR?143模拟物可明显抑制野生型K?ras报告载体的荧光素酶活性，但对突变型K?ras 报告载体的荧光素酶活性并无明显的抑制作用。 MTT法检测结果显示，转染miR?143模拟物后，宫颈癌HeLa细胞的增殖活性较阴性对照组明显降低（ P＜0．05）；而转染miR?143模拟物＋K?ras基因后，宫颈癌HeLa细胞的增殖活性较单纯转染miR?143模拟物组明显提高（ P＜0．05），但仍明显低于阴性对照组（ P＜0．05）。 Western blot法检测结果显示，阴性对照组、miR?143模拟物组、miR?143模拟物＋K?ras组K?ras蛋白的表达水平分别为521．36±41．89、115．27±34．08和706．52±89．44，miR?143模拟物组K?ras蛋白的表达较阴性对照组明显降低（ P＜0．05）；miR?143模拟物＋K?ras组K?ras蛋白的表达较miR?143模拟物组和阴性对照组明显增高（P＜0．05）。实时荧光PCR检测结果显示，人宫颈癌组织中miR?143的表达水平（0．32±0．06）明显低于人宫颈上皮内瘤变组织（0．93±0．17， P＜0．05）；Western blot法检测结果显示，人宫颈癌组织中K?ras蛋白表达水平（584．39±72．34）明显高于人宫颈上皮内瘤变组织（114．23±25．82， P＜0．05）。结论在小样本宫颈癌组织中，miR?143呈现低表达，K?ras呈现高表达；而miR?143可通过靶向K?ras基因的表达抑制宫颈癌HeLa细胞的增殖。
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c-myc和K-ras对小鼠卵巢上皮细胞体外转化和体内致瘤的研究
目的 探讨癌基因c-myc和K-ras在卵巢癌发生发展中的作用.方法 用逆转录病毒转基因系统,将正常的c-myc基因和突变的K-ras基因先后导入小鼠卵巢上皮(MOSE)细胞,建立表达c-myc和K-ras基因的细胞株,分别称为MOSE-Myc细胞、MOSE-Ras细胞和MOSE-RM细胞.通过细胞增殖实验、克隆形成实验、体外侵袭实验以及体内成瘤实验,研究转基因后MOSE细胞生物学特性的改变及恶性转化.结果 c-myc和K-ras基因容易被重组逆转录病毒导入MOSE细胞,转导后靶细胞内分别有相应的c-myc或K-ras mRNA转录,以及相应的c-myc(62 000)和K-ras(21 000)蛋白的表达.MOSE-Ras组和MOSE-RM(MOSE-Ras/Myc)组细胞增殖能力显著强于MOSE和MOSE-Myc组(P＜0.01),MOSE-RM组细胞增殖能力显著强于MOSE-Myc组(P＜0.05).MOSE-Ras和MOSE-RM组在软琼脂培养中均能形成克隆集落,而MOSE组和MOSE-Myc组不能形成克隆集落.MOSE-Ras组和MOSE-RM组能够穿透Matrigel,具有侵袭能力.MOSE-Ras组和MOSE-RM组细胞在裸鼠体内形成肿瘤,且肿瘤组织细胞仍然可见有K-ras和c-myc蛋白的表达;而MOSE组和MOSE-Myc组无肿瘤形成.结论 重组逆转录病毒载体作为转基因的工具,转导效率高,可稳定表达,可以感染正常的细胞;突变的K-ras可使MOSE发生恶性转化,在体内形成肿瘤;c-myc作为一个核转录调节因子,不能使MOSE发生恶性转化,但可协同其他因子,加强其他因子的功能.
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microRNA143表达对结肠癌组织中细胞增殖的影响及其作用机制
目的 探讨microRNA143(miR-143)表达对结肠肿瘤组织中细胞增殖和K-ras基因表达的影响.方法 采用Northern blot方法检测21例结肠癌组织和癌旁组织中miR-143的表达;构建miR-143的表达载体,将其转入人结肠癌细胞系SW480,用二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)方法检测miR-143转染对细胞增殖的影响;通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法检测K-rasmRNA和蛋白的表达变化.结果 在21例结肠癌组织标本中,有17例(81.0%)癌组织的miR-143表达水平低于癌旁组织.基因转染的SW480细胞中,miR-143表达水平显著升高,细胞增殖被抑制,K-ras蛋白的表达水平下降约40.3%,而K-ras mRNA水平未受影响.结论 miR-143在结肠癌组织中的表达明显低于癌旁组织,转染细胞中高表达的miR-143能够抑制细胞增殖,下调K-ras蛋白的表达.
关键词： microRNA143 结肠肿瘤 细胞增殖 K-RAS -
k-ras基因突变与结直肠癌的关系
目的 探讨k-ms基因在结直肠癌患者中的突变状况,为k-ras基因突变检测提供理论依据.方法 提取基因组DNA,采用PCR扩增和双向直接测序法,检测56例结直肠癌k-ras基因的突变状况.结果 56例结直肠癌中k-ras基因的突变率为46.63%(26/56),其中20例(20/26,76.92%)为密码子12的突变,6例(6/26,23.08%)为密码子13的突变,未发现同时存在两个位点突变的样本.突变类型以G>A为主,密码子12的突变以GGT>GAT(G12D)为主.密码子13的突变以GGC>GAC为主.统计学分析发现,k-ras基因突变与患者的性别密切相关而与其他临床病理特征如:肿瘤发生部位、有无淋巴结转移等无关.结论 在结直肠癌患者中,k-ras基因突变主要发生于密码子12;突变类型以G>A为主;k-ras基因的突变可能与患者的性别相关.
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结直肠癌K-ras基因突变与临床病理特征的相关性分析
目的 研究结直肠癌组织中K-ras基因的突变情况与临床病理特性之间的相关性.方法 采用直接测序法对90例结直肠癌石蜡标本进行K-ras基因突变检测,并对K-ras基因的突变情况及其与结直肠癌患者临床病理特征的关系进行统计学分析.结果 90例结直肠癌患者组织中,K-ras基因12、13密码子总突变者31例,总突变率为34.4％.12密码子单突变21例,突变率为23.3％；双突变1例.13密码子突变者9例,突变率为10.0％.结直肠癌K-ras基因突变率与肿瘤部位有明显相关性(P=0.042).12密码子单突变和13密码子突变与临床病理参数均无明显相关性(P＞0.05).结论 不同肿瘤部位患者的K-ras基因突变率存在明显不同.
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大肠癌组织中NF-κB p65的活化与k-ras基因突变的相关性研究
目的 探讨大肠癌组织中NF-κB p65的活化与k-ras基因突变的相关性.方法 用免疫组织化学方法检测167例已知k-ras基因状态的大肠癌组织中NF-κB p65的核表达.结果 在167例大肠癌组织中,k-ras基因突变59例,突变率35.3 ％;NF-κB p65核表达阳性63例,阳性率37.7％.不同性别、年龄、ECOG评分、病理类型、病理分化程度、TNM分期、淋巴结转移与否的病例k-ras基因突变率和NF-κB p65核表达差异均无统计学意义(均P＞0.05).k-ras基因突变的病例中NF-κB p65核表达率50.8％(30/59),k-ras基因野生型病例中NF-κB p65核表达率30.6％(33/108).两者的表达率差异有统计学意义(P=0.010).结论 大肠癌组织中NF-κB p65的活化与k-ras基因突变相关.
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HER-2与K-RAS在结直肠癌中的表达及意义
目的 检测HER-2和K-RAS在结直肠癌中的表达情况,探讨两者在结直肠癌形成中的作用、相互关系以及用于预后评价的价值.方法 运用免疫组织化学法检测12例正常结直肠黏膜组织、15例结直肠腺瘤、123例结直肠癌及25例淋巴结转移灶中HER-2和K-RAS的表达情况.结果 HER-2和K-RAS的高表达率在结直肠癌分别为67.5%和51.2%,在结直肠腺瘤分别为80.0%和33.3%,而在正常结直肠黏膜组织则分别为33.3%和0.HER-2和K-RAS在结直肠癌和结直肠腺瘤中的高表达率均显著高于正常结直肠黏膜组织(P＜0.05),但结直肠癌和结直肠腺瘤之间比较差异均无显著性.在结直肠癌中,HER-2和K-RAS的联合高表达率为36.3%.胞膜HER-2高表达率为38.2%,与浸润深度相关.K-RAS的高表达与临床病理指标无相关性.在淋巴结转移灶中,HER-2和K-RAS的高表达呈正相关(r=0.458,P＜0.05).HER-2和K-RAS的高表达与预后均无显著相关性(P＞0.05).结论 HER-2和K-RAS可能与结直肠癌的发生有关,在结直肠癌的发展过程中可能起协同作用.HER-2胞膜的高表达与结直肠癌的侵袭性有关.HER-2和K-RAS的高表达与预后均无相关性.
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西妥昔单抗对非小细胞肺癌A549细胞的抗肿瘤效应及其机制探讨
目的 探讨西妥昔单抗对K-ras突变的非小细胞肺癌A549细胞的体外生长抑制及凋亡诱导作用.方法 采用CCK-8法及流式细胞仪分别检测西妥昔单抗对A549细胞的生长抑制作用及凋亡诱导情况；通过基因芯片检测技术比较西妥昔单抗作用组与对照组K-ras突变的A549细胞肿瘤相关基因表达的差异.结果 西妥昔单抗对K-ras突变的A549细胞具有生长抑制及凋亡诱导作用.西妥昔单抗作用后,有10个基因表达显著上调,9个基因表达显著下调.Real-timePCR检测验证西妥昔单抗作用后STAT1基因及IGFBP3基因表达显著上调.结论 西妥昔单抗对K-ras基因突变的肺腺癌A549细胞具有生长抑制及凋亡诱导作用,STAT1和IGFBP3基因表达上调可能与西妥昔单抗对非小细胞肺癌的作用机制相关.
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异常高氡温泉周围居民外周血中肺癌相关基因和miRNA的表达
目的 探讨四川省若尔盖县降扎乡异常高氡温泉对周围居民外周血中肺癌相关基因和miRNA表达的影响.方法 获取高氡温泉及对照地区居民外周血样,用实时RT-PCR检测肺癌相关基因( p53、k-ras)及血浆中相关miRNA(let-7a、miR-34a/b)的表达,用Western blot检测靶蛋白p53和k-ras的表达.结果 高氡温泉周围居民p53和k-ras基因mRNA表达分别是对照组的0.97和1.33倍,但差异无统计学意义(t=0.13、-1.12,P＞0.05)；靶蛋白p53和k-ras的表达与基因表达变化趋势一致,分别是对照组的0.7倍和1.23倍,(t=0.72、0.46,P＞0.05).高氡组let-7a与对照相比有下降趋势(t=1.63,P＞0.05).值得注意的是,与对照组相比,高氡组miR-34a和miR-34b明显高表达(t=-3.20、-3.32,P＜0.05).结论 通过检测p53和k-ras基因以及miRNA的变化,推测高氡温泉周围居民受到了辐射损伤.
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K-ras基因与乳腺癌复发的相关性分析
目的 观察K-ras基因突变与乳腺癌术后复发的关系.方法 提取149个乳腺肿瘤组织样本(设为观察组),选取同一患者正常乳腺组织样本(设为对照组),用聚合酶链式反应-单链构象多态性分析和直接测序法对K-ras基因突变情况进行分析,并探讨K-ras突变与乳腺癌术后复发的相关性.结果 乳腺癌组织中K-ras突变发生率(45.64%)明显高于正常乳腺组织(2.01%)(P<0.05).K-ras突变患者的术后3年累计复发率为79.41%(45/68),明显高于未突变患者的25.92%(21/81)(P<0.05).结论 K-ras突变可能是导致乳腺癌术后复发的原因之一,可作为临床预后判断指标.
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塞替派诱发人支气管上皮恶性转化成瘤细胞的基因突变
目的旨在了解转化细胞在成瘤过程中的p15, p16, p53和K-ras基因编码序列突变情况.方法运用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术和DNA测序技术.结果转化各阶段细胞p15和K-ras基因编码序列为野生型.在转化进程中,各转化细胞均携带与细胞永生化有关的p53第47密码子CCG→TCG(脯氨酸→丝氨酸)转换,在此基础上无新的错义突变发生.p16基因在BEAS-2B细胞和BEAS-STE细胞中均为野生型,在BEAS-TTb细胞中第4密码子发生TCG→TAG(丝氨酸→终止密码子)碱基转换,结果为无义突变,第19, 52密码子分别发生GAG→AAG(谷氨酸→赖氨酸)转换,GCG→ACG(丙氨酸→苏氨酸)转换的错义突变.BEAS-TTc细胞中第19密码子发生GAG→AAG(谷氨酸→赖氨酸)转换的错义突变,而没有可检测的BEAS-TTa细胞的mRNA存在.结论 p16基因的突变或表达缺失与恶性转化细胞的成瘤过程相关.
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K-ras 基因第1外显子点突变与37例子宫内膜癌临床情况的关系
目的:研究中国子宫内膜癌患者的瘤组织中K-ras基因第1外显子(含第12,13密码子)的突变率,以及突变与子宫内膜癌临床情况的关系,探讨K-ras基因突变在子宫内膜癌发生中的作用.方法:37例子宫内膜癌的石蜡和部分冰冻标本行PCR扩增K-ras基因第1外显子(含第12,13密码子),经PCR-SSCP银染法检测突变.结果:37例子宫内膜癌患者中有12例存在K-ras基因突变,突变率为32.4%(12/37例).FIGO分期Ⅲ期、组织类型为腺鳞癌的患者突变率较高,在细胞低分化、侵肌1/2以上和绝经后的患者中突变比例也较高.石蜡和冰冻组织标本结果一致.结论:K-ras基因突变率在日、美两国内膜癌患者中不同.该组患者中的突变率与日本相似,高于美国.说明此种差异不仅存在于日本和美国患者之间,可能也存在于亚洲人与北美洲人之间.不同的基因背景,生活条件及内源性和外源性雌激素作用可能对K-ras基因突变率有影响,并引起了不同的临床表现.
关键词： 子宫内膜肿瘤/遗传学 K-RAS 点突变 基因 RAS -
胆管癌诊断及预后相关分子标记物研究进展
随着肿瘤生物学的发展及生物标记物在临床中的应用,P53基因、K-ras、Bcl-2蛋白、周期蛋白依赖激酶抑制因子等分子标记物在胆管癌中的作用逐渐被人们所认识.这些分子标记物在胆管癌的早期诊断、预后及治疗方面具有广阔的前景.
关键词： 胆管癌 p53基因 K-RAS Bel-2蛋白 周期蛋白依赖激酶抑制因子 -
大肠异常隐窝灶中APC、β-catenin、K-ras蛋白表达的意义
目的 探讨肠黏膜异常隐窝灶(ACF)与正常肠黏膜、腺瘤及腺癌中APC、β-catenin、K-ras蛋白表达的差异.方法 采用免疫组化Envision法检测ACF、正常肠黏膜、腺瘤及腺癌组织中APC、β-catenin、K-ras蛋白表达.结果 异常增生型ACF与正常肠黏膜相比较,APC、K-ras蛋白表达差异具有统计学意义(P<0.05),β-catenin表达差异具有统计学意义(P<0.01);与腺瘤相比较,β-catenin表达差异具有统计学意义(P<0.05),APC、K-ras表达差异无统计学意义(P>0.05);与腺癌比较,APC、β-catenin、K-ras蛋白表达差异具有统计学意义(P<0.01).增生型ACF与正常肠黏膜比较,APC、K-ras蛋白表达差异具有统计学意义(P<0.05),β-catenin表达差异无统计学意义(P>0.05);与腺瘤比较,β-catenin表达差异具有统计学意义(P<0.05),K-ras表达差异具有统计学意义(P<0.01);与腺癌比较APC、β-catenin、K-ras表达差异具有统计学意义(P<0.01).异常增生型ACF、腺癌中K-ras蛋白阳性表达与β-catenin蛋白异位表达呈正相关(P<0.05),APC蛋白阳性表达与K-ras蛋白阳性表达呈负相关(P<0.05).结论 ACF作为早期的癌前病变具有异常的蛋白表达,异常增生型ACF尤为明显.APC、β-catenin、K-ras蛋白表达异常相互作用促进了大肠肿瘤的发生.
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Let-7a和miR-96对胰腺癌K-RAS基因的调节作用
目的 探讨miRNA分子Let-7a和miR-96对胰腺癌系K-RAS基因的抑制作用及其致病机制.方法 通过检测胰腺癌细胞系miRNA分子(Let-7a和miR-96)水平、K-RAS基因mRNA和蛋白质表达水平,观察Let-7a和miR-96水平与K-RAS蛋白表达的关系；并通过升高胰腺癌细胞Let-7a和miR-96水平,检测其对K-RAS蛋白表达水平的影响.结果 胰腺癌细胞系K-RAS的mRNA与蛋白质表达均保持在一个较高的水平；胰腺癌细胞系miRNA分子Let-7a和miR-96水平均较低；升高胰腺癌细胞Let-7a或miR-96水平会降低K-RAS蛋白表达水平.结论 正常状态下,Let-7a和miR-96通过调控K-RAS基因发挥对肿瘤的抑制作用,胰腺癌细胞的Let-7a和miR-96水平呈一定程度的降低,削弱了对K-RAS基因的抑制作用,进而参与肿瘤的致病过程.
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局部注射胆固醇包裹let－7a miRNA模拟物下调人3种Ras表达抑制裸鼠皮下肝癌移植瘤的生长和转移
目的：研究胆固醇包裹let－7a模拟物（mimics）是否能通过下调人3种Ras抑制肝癌发展，寻找肝癌的潜在治疗策略。方法采用MTT增殖分析、 PI单染和Annexin V／FITC双染方法检测let－7a mimics在体外对肝癌细胞的作用。使用裸鼠皮下移植瘤模型和通过肿瘤局部注射方法观察let－7a mimics对体内肝癌的作用。采用实时定量PCR和Western blot方法检测let－7a及其靶点Ras的表达。结果与阴性对照组相比， let－7a mimics转染的肝癌细胞let－7a水平升高，细胞增殖缓慢（P均＜0．05）； let－7a mimics阻滞更多肝癌细胞停留在G0－G1期且促进肝癌细胞凋亡（P均＜0．05）。经let－7a mimics治疗的裸鼠体内肿瘤体积较阴性对照组减小，是阴性对照组的54．97％（ P＝0．039）；局部浸润和肝脏转移较阴性对照组明显减轻。肝癌细胞和移植瘤组织内let－7a上调的同时，人K－Ras、 H－Rras和N－Ras mRNA和蛋白的表达降低（P均＜0．05）。结论 let－7a mimics下调人3种Ras mRNA和蛋白的表达，影响细胞周期，进而抑制细胞增殖和促进细胞凋亡。瘤周多点注射胆固醇包裹的let－7a mimics能抑制移植瘤的生长、浸润和转移。提示let－7阻断Ras可成为肝癌治疗的研究策略。
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表皮生长因子受体信号通路与胰腺癌的靶向治疗
表皮生长因子受体(EGFR)信号通路在胰腺癌的增殖、转移、血管形成等方面有重要作用,人们对胰腺癌的EGFR信号通路进行了深入全面的研究,并对EGFR抑制剂和K-ras抑制剂治疗胰腺癌进行了大量临床试验.虽然厄洛替尼被美国食品药物管理局批准用于治疗晚期胰腺癌,但其仅延长中位生存期不到10 d,且皮疹、腹泻等不良反应影响了患者生活质量,是否真正使患者临床受益仍存在争议.
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APC、p53、K－ras在结直肠肿瘤检测中的研究价值
目的：采用聚合酶链反应－单链构象多态性（ PCR－SSCP）银染法检测腺瘤多发性息肉病（ APC）、p53、K－ras三个基因在结直肠肿瘤筛查中的敏感性和特异性。方法选择2011年11月至2012年8月惠州市第一人民医院消化门诊收治的14例结直肠癌（ CRC 组），60例结直肠腺瘤（ CRA组），30例正常组粪便标本，提取DNA，PCR－SSCP银染法检测基因突变。结果 APC、p53、K－ras三个基因联合检测在CRC组、CRA 组、正常组突变率分别为57.1％（8／14）、30.0％（18／60）、3.3％（1／30）；在结直肠肿瘤的灵敏度和特异度分别为35.1％（26／74）、96.7％（29／30），粪便 DNA 联合检测CRC组、CRA组的检出率高于正常组（均P＜0.05）。结论粪便DNA联合检测在无创性筛查结直肠肿瘤中具有可行性，可能是一种适合于结直肠肿瘤筛查的无创性方法和筛查模式。
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平行检测血清CA19-9和血浆K-ras突变对胰腺癌诊断价值的Meta分析
目的评估平行检测血清CA19-9和血浆K-ras突变对胰腺癌诊断的价值。方法网络文献检索Pubmed、CNKI、维普等数据库，全面收集关于平行检测血清CA19-9和K-RAS基因突变对胰腺癌诊断研究的文献。采用Meta-Disk 1.4、RevMan 5和Comprehensive Meta-Analysis Version 2（CMA2）进行全面的Meta分析。结果按照预定的纳入标准，共纳入符合文献8篇。结果显示在胰腺癌的诊断中，平行检测血CA19-9和K-RAS基因突变的灵敏度和特异度分别是0.909（0.864～0.943）和0.711（0.618～0.792）。而单独检测血CA19-9和KRAS的灵敏度分别是0.719（0.656～0.776）和0.671（0.606～0.731）；其特异度分别是0.693（0.6～0.776）和0.912（0.845～0.957）。单独检测CA19-9和平行检测的敏感度和特异度优势比（Odds Ratio， OR）分别是0.793（0.6～1.038）和0.986（0.653～1.488）。单独检测K-RAS和平行检测的敏感度和特异度优势比（Odds Ratio， OR）分别是0.773（0.585～1.022）和1.305（0.880～1.936）。
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在人类非小细胞肺癌细胞A549中沉默K-Ras降低自噬水平
目的:在人的非小细胞肺癌细胞A549中通过降低K-Ras表达研究其在自噬中的作用.方法:磷酸钙方法转染K-RasshRNA,Western blot检测自噬标志物的变化.结果:在A549细胞中,通过K-Ras-shRNA慢病毒转染显著地降低了K-Ras 的蛋白水平,同时自噬标志物LC3Ⅱ水平降低,自噬调控分子Beclin-1水平降低.结论:K-Ras knockdown引起细胞自噬水平的降低.
