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新型纳米材料及与前成骨细胞联合培养的实验研究
自组装的纳米纤维肽作为一种新型材料,被广泛应用于细胞的三维培养以及组织缺损的修复.本研究在传统自组装多肽RADA16-1(RAD16)的基础上,为成骨细胞体外培养构建了一种支架材料,即把细胞黏附基序arginine-glycine-aspartic(RGD)连接到RAD16上,再与纯RAD16按比例混合,构成本实验的研究材料Hybrid.用原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)观察材料的微观结构.通过相差显微镜、MTT、组织化学染色等工具或方法观察成骨细胞(MC3T3-E1)在材料中的生长、增殖和分化情况.结果 显示,Hybrid可以形成良好的纳米纤维结构.与RAD16相比,这种改进的纳米材料可以促进细胞的增殖,且碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的表达呈强阳性,有明显的钙结节形成.实验表明该材料在骨组织工程方面有潜在的应用价值.
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优选人脱细胞真皮基质及荧光标记示踪与其复合培养的成纤维细胞
目的 优选人脱细胞真皮基质(ADM)并评价其生物学特性. 方法 通过高渗盐-NaOH消蚀法(A组)、高渗盐-十二烷基硫酸钠(SDS)法(B组)和DispaseⅡ-Triton X-100法(C组)制作人脱细胞真皮基质,以特殊染色、免疫组织化学观察3种方法 制作ADM的组成成分;四甲基偶氮唑盐(MTT)细胞毒性实验评价3种方法 制作ADM的细胞毒性反应;细胞培养法评价其细胞相容性,优选ADM .重组腺病毒绿色荧光表达载体(Ad-GFP)转染的人成纤维细胞(FB)接种在优选ADM上,荧光显微镜观察 FB的生长情况. 结果 3种方法 均能够保留胶原纤维、弹性纤维, A组和C组能够完全脱去细胞,B组未能完全脱去细胞;A组和B组制备ADM细胞毒性反应小于1级;C组制备ADM细胞毒性反应大于1级.A组与B组24h 3T3细胞贴壁数有统计学意义( P <0.05),3T3细胞能够在A组ADM表面贴附;优选A组ADM.转染Ad-GFP的FB在优选ADM上生长和增殖良好. 结论 高渗盐-NaOH消蚀法制备的ADM蕴涵丰富的生物信息,细胞毒性小,生物相容性好,是一种很好的生物支架材料.
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人咽缩肌细胞体外复合培养的研究
目的 探索人咽缩肌细胞体外培养的条件,观察其在相应的生物支架上生长情况,为体外构建人下咽肌组织瓣做前期研究.方法 取9例下咽癌志愿者癌旁正常的咽缩肌组织进行原代培养,当细胞传代至第4代时,将细胞接种于改性的1mm3平面或立体凹槽聚氨酯(polyurethane,PU)生物支架上进行复合培养.通过倒置相差显微镜、免疫荧光和电镜观察鉴定细胞的形态及增殖、分化的状况.结果 咽缩肌佳的体外培养条件是37℃、5％ CO2孵箱环境,选择DMEM培养基并添加20％胎牛血清,采用组织块培养法可获得足够数目成活的咽缩肌细胞,此细胞在接枝丝素蛋白的凹槽PU支架上增殖分化良好并具备定向生长的能力,从而模拟了体内生长的状况.结论 组织块培养法获得的咽缩肌细胞与接枝丝素蛋白的凹槽PU支架复合培养时其生长状况佳,这为体外构建下咽组织瓣提供了一定的基础.
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有效微生物群净化湖水安全性评价
有效微生物群(Effect Microorganisms,EM)是一种复合微生物活菌制剂,由光合细菌、乳酸菌、放线菌及发酵型丝状真菌等5科10属80多种微生物复合培养而成.自20世纪90年代引入我国以来,在种植业、养殖业和环境污染治理、净化方面取得了明显的作用和效果[1-3].目前对EM的应用研究较多,而对EM的安全性研究报道较少.为了解应用EM治理污水的安全性,在观察EM净化受污染湖水的效果同时,对应用EM净化的湖水进行急性毒性及遗传毒性实验研究.
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异种生物衍生骨材料与骨髓间充质干细胞的生物相容性
背景：异种生物衍生骨保存了原骨组织的天然网状孔隙结构，且具有免疫原性低、细胞相容性好的特点。目的：验证异种生物衍生骨材料与骨髓间充质干细胞的生物相容性。
方法：取新鲜猪股骨制备生物衍生骨，扫描电镜观察材料结构。将第3代兔骨髓间充质干细胞以2×109 L-1的浓度接种于生物衍生骨材料的松质骨面，复合培养7d内，采用扫描电镜观察细胞生长情况；复合培养8d内，计数材料上附着的细胞数。
结果与结论：生物衍生骨表面粗糙，孔隙不规则并相互通联，构成网状结构。复合培养3 d，细胞在衍生骨材料表面发生附着，且细胞形态不均一；复合培养培养5 d，细胞连接成片呈层状生长，细胞之间紧密接触；复合培养7 d，细胞呈现多层生长状态，成堆生长，部分区域存在细胞外基质分泌现象。复合培养后，前2 d 为潜伏适应期，3-6d细胞生长呈出线性曲线，处于细胞生长对数期；第6天后，细胞生长曲线逐渐变得平缓，细胞增殖速度下降，增殖进入平台期。表明异种生物衍生骨材料与骨髓间充质干细胞具有良好的生物相容性。 -
人尿道黏膜上皮细胞系与脱细胞羊膜基质复合培养的实验研究
目的 探讨人尿道黏膜上皮细胞系与脱细胞羊膜基质复合培养的效果.方法 将人尿道黏膜上皮细胞系接种于脱细胞羊膜基质上,待细胞在脱细胞羊膜基质上生长至铺满表面,用活细胞示踪剂标记细胞,然后将脱细胞羊膜基质固定、封片,倒置相差和荧光显微镜下进行观察.结果 人尿道黏膜上皮细胞系细胞在脱细胞羊膜基质上生长,细胞呈单层生长,活细胞示踪剂显示细胞生长良好,并具有活细胞功能.结论 人尿道黏膜上皮细胞系是良好的实验室组织工程化尿道种子细胞,脱细胞羊膜基质是良好的实验室组织工程化尿道支架材料,适用于实验室组织工程化尿道复合过程研究.
关键词： 组织工程 人尿道黏膜上皮细胞系 脱细胞羊膜基质 复合培养 -
脱细胞基质与颌下腺细胞体外复合培养的实验研究
目的:颌下腺细胞与脱细胞生物衍生支架材料复合培养,观察细胞在支架材料上的生长情况.方法:用传代培养第2代的颌下腺细胞与颌下腺脱细胞基质在体外复合培养,扫描电镜下观察不同时间细胞在支架材料上的生长情况.结果:颌下腺细胞多数附着在支架材料的孔隙内或其边缘,细胞大小不等、形态各异,部分细胞之间分泌基质相互连接,细胞表面凸凹不平、突起丰富、数目不等、长短不一,表面结构似"银耳"状.结论:颌下腺脱细胞基质支架材料具有良好的生物相容性,是一种较为理想的颌下腺组织工程用支架材料.
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复合培养对肺动脉平滑肌细胞周期的影响
目的探讨肺微血管内皮细胞(LMVEC)与肺动脉平滑肌细胞(PASMC)复合培养时LMVEC对PASMC周期的影响.方法 LMVEC滤膜培养后,与PASMC复合培养,采用流式细胞仪检测PASMC周期的变化.结果不同明胶浓度处理滤膜、不同种植密度相同、不同孵育时间处理滤膜对LMVEC生长数量有明显的影响,但不同孔径滤膜对LMVEC生长的影响无显著性差异.用1‰明胶处理滤膜, 105/cm2的种植密度及孵育2 d即可获得较好效果.复合培养后,PASMC的G1期细胞数减少,S+ G2/M期细胞数增多,即促进细胞生长;使LMVEC的G1期细胞数增多,S+G2/M期细胞数减少,即抑制细胞生长.结论复合培养后,促进PASMC细胞生长,抑制LMVEC细胞生长;但对两种细胞的凋亡影响不明显.
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实施整体设计将素质教育渗透到检验专业的教育教学之中
随着高等教育教学改革的不断深入,人们越来越清楚的意识到,培养适应新世纪我国现代化建设需要的具有创新意识、能力和创业精神的高素质人才,仅有教学内容、课程体系和现代教学手段的改革还不够,还需要对包括教育内容、教育方法、教学进程在内的全过程进行整体科学设计,将素质教育贯穿在整个教育教学过程中,实现知识、能力和素质教育的有机统一.为此,我校检验专业从1996年开始探索对本专业在校学生进行整体培养设计,实施"五阶段复合培养教学模式",将素质教育渗透到专业教育中去,取得了较好的效果.
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兔骨髓基质细胞与生物活性玻璃支架的相容性
目的:探讨应用兔骨髓基质细胞与生物活性玻璃复合培养构建组织工程化人工骨的可行性.方法:将体外分离培养的兔骨髓基质细胞,经向成骨方向诱导分化后,与生物活性玻璃进行联合立体培养,通过扫描电镜观察骨髓基质细胞在生物活性玻璃上的生长情况.结果:骨髓基质细胞可在体外增殖和向成骨方向分化,并且可在生物活性玻璃上黏附和铺展.结论:骨髓基质细胞与生物活性玻璃复合培养可构建具有活细胞成分的组织工程化人工骨.
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口腔黏膜上皮细胞和成纤维细胞的复合培养
目的为癌前病变临床病理研究建立一种简便、迅速和有效的口腔黏膜上皮细胞和成纤维细胞复合培养的方法, 实现体外模拟组织工程化口腔黏膜的发生发展. 方法用DispaseⅡ分离上皮和皮下组织, 用KGM培养口腔黏膜上皮细胞. 用细胞培养法和组织块培养法获取实验用的口腔黏膜上皮细胞和成纤维细胞, 并采用复合培养法对两种细胞进行共同培养. 结果用DispaseⅡ可成功地分离上皮和皮下组织. KGM可明显促进口腔黏膜上皮细胞的分裂繁殖 . 复合培养的HE染色切片显示薄层的结缔组织之上有方形的基底细胞、颗粒细胞和角化层 . 结论 KGM可明显促进口腔黏膜上皮细胞的分裂和成熟. 采用组织培养法获取原代成纤维细胞是适合口腔黏膜取材等特点的有效方法. 气液相培养的口腔黏膜下结缔组织可促进上皮细胞的分层和分化.
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复合培养对低氧时肺动脉平滑肌细胞表达细胞因子的调节
目的 研究低氧对肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)白细胞介素-1β、4、10、13(IL-1β、4、10、13)活性的影响,及复合培养下肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs)对其调控作用.方法 大鼠PASMCs单独培养或与PMVECs复合培养,分为正常组、低氧作用2 h(H2)、6h(H6)、12 h(H12)、24 h(H24)组,采用ELISA法测定各组培养细胞上清中IL-1β、IL-4、IL-10、IL-13的活性.结果 低氧刺激后PASMCs的IL-1β、IL-4、IL-10、IL-13活性2 h开始升高,6 h达高峰,12 h降低;各时相点复合培养组均低于对应的单独培养组(P＜0.01).结论 低氧可以激活PASMCs的IL-113、IL-4、IL-10、IL-13活性,在复合培养条件下,PMVECs对此效应具有下调性影响.
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低氧对复合培养的平滑肌细胞中白细胞介素-6表达的影响
目的研究低氧对复合培养的平滑肌细胞中白细胞介素6(IL-6)表达的影响.方法低氧处理与肺微血管内皮细胞复合培养的鼠肺动脉平滑肌细胞,采用RT-PCR方法检测常氧组、低氧2、6、12 h组IL-6基因的表达水平,并测定细胞培养上清中IL-6的活性.结果低氧复合培养2 h组肺动脉平滑肌细胞中IL-6 mRNA表达水平升高,在低氧6h组达高,低氧12 h组有所降低,但与常氧组比较有明显差别.低氧复合培养2 h组肺动脉平滑肌细胞上清中IL-6的活性明显升高,6 h组细胞上清中IL-6的活性水平高,12 h组的活性降低,24 h组的水平低于2 h组.IL-6活性水平与其基因表达的水平一致.结论低氧可以增强复合培养的肺动脉平滑肌细胞中IL-6基因的表达,使细胞培养上清中IL-6活性升高,进而有可能激活其它一些信号转导相关基因调节细胞的低氧反应.
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低氧刺激复合培养的平滑肌细胞表达Janus激酶
目的研究低氧对复合培养的平滑肌细胞中Janus激酶(JAK)基因表达的作用.方法鼠肺微血管内皮细胞与肺动脉平滑肌细胞复合培养,采用半定量RT-PCR技术检测常氧组、低氧2、6、12 h组的JAK1、JAK2和JAK3基因的表达水平,并对PCR产物进行测序.结果低氧复合培养2 h组肺动脉平滑肌细胞中JAK1、JAK2、JAK3 mRNA表达水平升高,在低氧6h组达高,与正常组比较均有明显差别.低氧12 h组的表达量低于6 h组,但高于正常组.RT-PCR产物直接测序证实扩增产物片断与Genebank中相应序列相同.结论低氧增强复合培养的肺动脉平滑肌细胞中JAK基因的表达,而JAK基因在低氧所致的肺动脉收缩和低氧肺动脉高压的信号转导中可能发挥重要作用.
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脂多糖对复合培养的微血管内皮细胞Janus激酶表达的影响
目的研究脂多糖 (Lipopolysaccharide, LPS) 对复合培养的微血管内皮细胞中Janus激酶(Janus kinase, JAK)基因表达的影响.方法与肺动脉平滑肌细胞复合培养鼠肺微血管内皮细胞,采用半定量RT-PCR技术检测正常组、LPS 2、8、16 h组的JAK2和TYK2基因的表达水平.结果 LPS复合培养2 h组肺微血管内皮细胞中JAK2 mRNA表达水平升高,在LPS 8 h组达高,与正常组比较均有明显差别.在正常组和LPS刺激组均未见肺微血管内皮细胞表达TYK2基因.结论肺微血管内皮细胞不表达TYK2基因;LPS可使复合培养的肺微血管内皮细胞中JAK2基因的表达升高.
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组织工程细胞支架与种子细胞复合培养的研究进展
组织工程的核心是建立由生物材料与细胞结合的三维空间复合体,即以合适的生物材料构建与所需要修复的组织或器官结构相同或类似的支架并复合特定细胞,用以对病损组织进行形态、结构和功能的重建而达到永久性替代[1].支架材料是组织工程的基础,它既要为细胞提供生长的空间又要被植入体内,故材料的性质会对细胞的生长、繁殖、分化和宿主内环境产生重要影响.因此,选择具有良好的生物相容性及细胞亲和性好的支架材料尤为重要.另外,要构建细胞支架复合体,又必须考虑种子细胞黏附于支架的问题,支架材料、种子细胞以及复合体的构建在组织工程中被称为三大基本要素.
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同一供者及不同供者的人胎盘MSCs与脐静脉内皮细胞复合培养的比较研究
目的 比较同一供者及不同供者的人胎盘MSCs(human placenta-derived MSCs,HPMSCs)与人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)三维复合培养效果,为体外构建三维血管化组织工程骨提供实验依据. 方法 取健康足月产妇自愿捐赠的胎盘及脐带组织,采用Ⅳ型胶原酶消化和人淋巴细胞分层液密度梯度离心法分离培养HPMSCs,通过流式细胞学检测细胞表型,取第2代细胞向成骨细胞诱导培养鉴定;以Ⅰ型胶原酶消化分离培养HUVECs,通过Ⅷ因子相关抗原因子免疫组织化学染色进行鉴定.实验分为两组,A组取不同供者的第3代HUVECs和成骨诱导培养3周的第3代HPMSCs以1∶1比例复合种植于胶原水凝胶,制备细胞-胶原水凝胶复合物;B组将同一供者的以上两种细胞同法复合制各复合物.复合培养第1、3、5、7天取材,行CD31免疫荧光染色,于激光共聚焦显微镜下观察其成血管倾向,测量复合物中的索道长度和节点数,并进行统计学分析. 结果 经鉴定,成功分离培养HPMSCs及HUVECs.CD31免疫荧光染色示,与A组相比,B组细胞-胶原水凝胶复合物中的HUVECs可在三维空间上较早、较好地伸展,在水凝胶内部相互交织能力较强,形成的索道更长,节点更多,网络更密集.第7天时B组索道长度和节点数分别为(8.11±0.62) mm/mm2及(2130±1.41)个/mm2,显著优于A组的(6.68±0.35) mm/mm2及(17.10±1.10)个/mm2,差异均有统计学意义(t=0.894,P=0.000; t=0.732,P=0.000). 结论 将同一供者的HPMSCs与HUVECs 体外复合种植于胶原水凝胶支架上,比不同供者来源的细胞形成的网络成血管倾向更明显,交织连续性好,层次丰富.
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BMSCs来源的成骨细胞与血管内皮细胞复合异体冻干颗粒骨的黏附性研究
目的 探讨大鼠BMSCs来源的成骨细胞、血管内皮细胞复合异体冻干颗粒骨的黏附性,为构建血管化组织工稃骨奠定实验基础.方法 取4周龄SD大鼠,雌雄不限,体重100～110 g,分离培养BMSCs,取生长状态良好的第3代BMSCs行成骨诱导培养及成血管内皮细胞诱导培养并鉴定.将诱导7 d的两种细胞按1:1比例混合培养,作为实验组;以生长状态良好未诱导的第2代BMSCs作为对照组.培养后1～8 d采用MTT法测定细胞增殖并绘制生长曲线.取诱导14 d的两种细胞分别按0.25×106、0.50×106、1.00×106、2.00×106、4.00×106个/mL接种于20%Col Ⅰ修饰前后的异体冻干颗粒骨(修饰组与未修饰组),接种后24 h计算细胞黏附率.将诱导14 d的两种细胞按1:1比例混合,以总细胞密度2×106个/mL接种于修饰后异体冻干颗粒骨,扫描电镜观察细胞在支架上的生长情况.结果 BMSCs成骨诱导7 d,ALP染色示胞浆内可见蓝染颗粒,胞核呈红色;成血管内皮细胞诱导14 d,CD31、CD34免疫细胞化学染色呈阳性.MTT检测结果显示,实验组细胞增殖较对照组缓慢,培养3～8 d两组细胞吸光度值差异有统计学意义(P＜0.05).细胞接种密度为(0.25～1.00)×106个/mL时,两组黏附率随接种密度增加而上升:接种密度为1.00×106个/mL时,黏附率达高;当接种密度＞2.00×106个/mL,黏附率明显降低.两组各细胞接种密度间的黏附率比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).扫描电镜观察显示,体外诱导的成骨细胞与血管内皮细胞黏附于支架上仍可分化增殖,细胞胞体见丝状伪足.结论 大鼠BMSCs诱导培养的成骨细胞与血管内皮细胞在20%Col Ⅰ修饰的异体冻干颗粒骨上生长状态良好,可用于构建血管化组织工程骨.
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食管黏膜上皮细胞与SIS复合培养及生物学特性研究
目的 探讨体外快速培养犬食管黏膜上皮细胞(esophageal mucosa epithelial cells,EMECs)及其与SIS体外复合培养的方法,为组织工程食管研究提供实验依据.方法 取2～5周龄幼犬5只,无菌获取其食管组织,采用混合酶消化法,分离培养EMECs,于倒置相差显微镜下观察细胞生长情况,取第2代细胞培养1～5 d绘制生长曲线并进行细胞表面标志物细胞角蛋白19(cytokeratin 19,CK-19)检测.取第2代EMECs与SIS复合培养4、8 d,行形态学、组织学及扫描电镜观察.结果 倒置相差显微镜下EMSCs呈典型铺路石样.CK-19免疫组织化学染色可见细胞胞浆呈阳性染色.MTT法测定第2代细胞在传代培养2 d生长达高峰.EMECs与SIS复合培养4 d,细胞呈多角形,细胞间连接紧密,呈铺路石样排列;SIS表面形成1～2层细胞组成的复层上皮样结构.8 d时,细胞密度增大,SIS表面形成2～3层细胞组成的复层上皮样结构;扫描电镜见细胞在材料上已大量增长,呈层状排列.结论 采用混合酶消化法,用含6%FBS的DKSFM培养犬EMECs,方法简便,适合推广应用.SIS与EMECs有良好的相容性,可作为构建组织工程食管的理想支架材料.
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雪旺细胞促进骨髓间充质干细胞增殖的实验研究
目的 通过雪旺细胞(Schwann cell, SC)与骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells, MSCs)复合培养,观察SC对MSCs增殖的影响,为其在构建组织工程血管中应用提供实验依据.方法 选用体重40 g SD大鼠,用组织块培养法获取SC,用骨髓差速贴壁法获取MSCs;用免疫组织化学法分别对两种细胞进行鉴定.用Transwell培养板复合培养两种细胞,实验组于板上层接种MSCs,下层接种SC;同时上下两层均接种MSCs设为对照组.各组均选择第1、3、5和7天4个时间点进行检测, 用氚标胸腺嘧啶核苷酸标记MSCs,液体闪烁仪进行细胞计数(counts per minute, CPM).提取实验组SC、MSCs和对照组MSCs的细胞蛋白,分别对血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和其受体Flk-1, 协同受体1(neuropilin-1, NRP-1)进行Western blot检测. 结果 SC呈梭形,表达S-100蛋白,阳性率达90%.MSCs表达CD105和CD 44,不表达CD 34和CD 45.Transwell复合培养:MSCs,第1、3、5和7天增殖数量分别为2 411.00±270.84、3 016.17±241.57、6 570.83±2 848.27、6 375.83±1 431.28,明显大于对照组2 142.17±531.63、2 603.33±389.64、2 707.50±528.55、2 389.00±908.01,差异有统计学意义(P＜0.05),实验组CPM值于第5天高.于复合培养第5天Western blot显示:SC表达VEGF、Flk-1和NRP-1;VEGF、Flk-1、NRP-1在实验组MSCs中表达明显强于对照组. 结论 两种细胞体外复合培养后,SC在第1、3、5和7天均能显著增加MSCs的数量,并促进增殖,增殖高峰在第5天.与SC复合培养后,MSCs表达VEGF明显增加,其相应受体Flk-1、NRP-1表达上调,SC通过促进MSCs分泌VEGF增加参与了细胞的增殖过程.
