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人FAS启动子驱动的HSV-TK重组腺病毒靶向杀伤SKBR3乳腺癌细胞的研究
目的:构建脂肪酸合成酶(FAS)启动子驱动下的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)重组腺病毒,研究其对乳腺癌细胞SKBR3的靶向杀伤作用.方法:以AdEasyTM腺病毒系统为载体,构建FAS启动子驱动下的HSV-TK重组腺病毒载体Ad-FAS-TK,将线性化的Ad-FAS-TK在AD-293细胞中包装,经过大量扩增和纯化,得到重组腺病毒.MTT法检测重组腺病毒Ad-FAS-TK与前体药物更昔洛韦(GCV)对SKBR3细胞的靶向杀伤作用.TUNEL法检测细胞凋亡.结果:成功构建FAS启动子驱动下的HSV-TK重组腺病毒载体Ad-FAS-TK,经包装、扩增和纯化得到约1010 pfu/ml的重组腺病毒.MTT法和TUNEL检测结果显示,FAS启动子驱动下的HSV-TK重组腺病毒与GCV能够诱导SKBR3细胞凋亡,产生靶向细胞毒作用.结论:FAS启动子驱动下的HSV-TK重组腺病毒联合GCV对SKBR3细胞具有靶向杀伤作用,FAS启动子可以作为肿瘤靶向基因治疗的工具.
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基因工程改造腺病毒联合化疗治疗鼻咽鳞癌
目的:通过基因工程改造腺病毒(简称H101)局部注射治疗鼻咽鳞癌,了解H101治疗的疗效和安全性.方法:分治疗组(A)和对照组(B),A组:H101+PF方案化疗;B组:单用PF方案化疗.结果:A组21例,有效率80.95%(17/21),B组20例,有效率25%(8/20),两组比较有统计学差异(P《0.05);毒副反应无明显差异.结论:H101联合化疗对鼻咽鳞癌有较好的疗效和较不良反应,易为患者接受.
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肝癌靶向 SEA/CD80共表达腺病毒在小鼠体内的分布和表达
目的：研究肝癌靶向 SEA/ CD80共表达腺病毒（A - S - C）在小鼠体内的分布。方法：局部注射 A - S
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hTERT启动子调控的SEA-CD80基因共表达重组腺病毒载体的构建及在不同肿瘤细胞中的表达鉴定
目的：构建肿瘤靶向性葡萄球菌肠毒素 A 和 CD80基因共表达重组腺病毒载体。方法：采用 PCR 技术从质粒 pShuttle - AFP - CD80扩增人 CD80全长 cDNA 片段，克隆至已构建载体 pMD18- T - BIS，取代小鼠CD80 cDNA 片段。重组质粒命名为 pMD18- T - hBIS。经酶切，将 CWV 增强子修饰的人端粒酶反转录酶启动子从已构建载体 pGL3- CWVE - hTP，亚克隆至穿梭质粒 pShuttle2，然后经酶切将片段 hCD80- IRES - SEA从 pMD18- T - hBIS 质粒亚克隆至 CWV 增强子修饰的人端粒酶反转录酶启动子下游，构建质粒 pShuttle2-CE - hTP - hBIS。再与腺病毒骨架质粒 pAdEasy -1共转化 E. coli BJ5183，以获得的重组子（命名为 Ad - CE- hTP - BIS）转染 Ad293细胞制备病毒并纯化。将病毒分别感染人肝癌细胞 H7721、宫颈癌细胞株 Hela 细胞和原代培养的人牙龈成纤维细胞，经免疫荧光染色后，激光共聚焦显微镜观察 SEA 和 CD80在细胞膜的表达情况。结果：重组腺病毒能够使 CD80和 SEA 在人肝癌细胞 H7721、宫颈癌细胞株 Hela 细胞膜上共表达，而在人牙龈成纤维细胞中不表达。结论：成功地构建了多肿瘤靶向性 SEA 和 CD80基因共表达重组腺病毒载体。为应用 SEA 和 CD80基因对人多种肿瘤进行靶向基因治疗奠定了基础。
关键词： 葡萄球菌肠毒素 A 人 CD80 人端粒酶反转录酶启动子 腺病毒 -
DD3启动子调控 TRAIL 过表达载体的构建及腺病毒包装
目的：构建 DD3（PCA3）启动子调控的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 TRAIL 过表达腺病毒载体，并对其进行病毒包装及滴度测定。方法：将 DD3启动子用分子克隆技术替换掉穿梭质粒 pHBAd －U6－GFP原有启动子 U6，再用 AgeI 单酶切将制备的重组质粒 pHBAd －DD3－GFP 线性化，将 TRAIL 基因片段克隆至线性化 pHBAd －DD3－GFP 上，经抗性筛选后 PCR 及测序鉴定为 pHBAd －DD3－TRAIL 载体。将其连同病毒骨架质粒 pHBAd －BHG 共同转染至 HEK293细胞包装成病毒并扩增，测定病毒感染性滴度。结果：经 PCR及测序验证证实成功构建 DD3启动子调控的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 TRAIL 过表达腺病毒载体 pH-BAd －DD3－TRAIL 并包装扩增，病毒滴度为1．58×1010 PFU ／ml。结论：构建 DD3启动子调控的凋亡配体TRAIL 过表达重组腺病毒，可用于下一步在前列腺癌细胞中特异性地表达及诱导细胞凋亡杀伤靶细胞效应研究中。
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bcl-2重组腺病毒载体的构建
本研究目的在于构建bcl-2的正义和反义重组腺病毒载体,以研究bel-2过度表达对周围神经损伤后脊髓前角运动神经元抗凋亡能力和对轴突再生的影响.为此,将正义和反义bcl-2 cDNA克隆到腺病毒穿梭质粒pAdCMV,利用体内同源重组原理,用该重组质粒与pJM17质粒共转染293细胞,获得复制缺陷型重组腺病毒AdCMV/sense-bcl-2和AdCMV/antisense-bcl-2,其中bcl-2 cDNA插入腺病毒基因组的E1区,并由CMV启动子控制.利用原位杂交、免疫组化反应鉴定重组腺病毒.结果显示:从感染AdCMV/sense-bcl-2重组腺病毒的293细胞中检测到bcl-2的表达;重组腺病毒可感染293细胞并在293细胞内进行有效复制.从而表明本研究成功地构建了bcl-2重组腺病毒,为进一步研究bcl-2重组腺病毒的功能提供了条件.
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血红素加氧酶-1基因转染对神经元损伤的保护作用
目的 观察腺病毒介导的血红素加氧酶-1(HO-1)基因转染大鼠后对脑缺血再灌注损伤的保护作用.方法 雄性SD大鼠随机分为4组:假手术对照组(SH)、生理盐水组(V)、空载体组(Ad)和Ad-HO-1转染组(HO).后三组在缺血前3 d于右侧脑室部分别注射20 μl生理盐水、含1 μl空载体腺病毒(1.0×1010 plaque-forming unit/ml, PFU/ml)的生理盐水或含1 μl重组HO-1腺病毒(1.0 ×1010 PFU/ml) 的生理盐水,连续注射3 d后,采用右侧大脑中动脉栓塞法(MCAO)建立脑缺血再灌注模型.每组大鼠测定神经功能后,处死大鼠并取全脑标本,测定右脑梗死体积及细胞凋亡指标,荧光显微镜下观察脑组织荧光蛋白的表达情况,Western blot检测脑组织HO-1的表达.结果 HO组中HO-1表达量明显高于Ad组和V组,Ad组和HO组可见有荧光蛋白表达,转染率为34.5%±3.4%.HO组神经功能显著优于Ad组和V组(P<0.001).与SH组比较,V组、Ad组脑梗死体积、神经细胞凋亡明显升高.与V组及Ad组比较,HO组脑梗死体积显著减小(P<0.01)、神经元凋亡显著减少(P<0.01).结论 腺病毒携带的HO-1基因能有效的转染脑组织,并在脑内稳定表达;HO-1基因转染显著减轻脑缺血再灌注后神经细胞损伤.
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腺病毒介导的p16基因对TJ899细胞系活性的影响
目的研究五型腺病毒载体(Ad5)携带p16基因对恶性脑胶质瘤细胞系TJ899生长状态的影响.方法免疫组化(SP法)测定p16蛋白表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和克隆形成实验测定恶性脑胶质瘤细胞系生长状态.结果重组体腺病毒能介导p16外源基因在恶性脑胶质瘤细胞系TJ899细胞中阳性表达,6 d时肿瘤细胞生长抑制率为93%,并且能显著地抑制肿瘤细胞的克隆形成能力.结论腺病毒介导p16基因能在肿瘤细胞中表达,并能明显抑制肿瘤细胞生长的状态.
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腺病毒载体介导的PML生长抑制因子转染人角质形成细胞的实验研究
目的 探讨腺病毒介导的PML基因对角质形成细胞(KC)的生长抑制作用.方法 用原位杂交和免疫组织化学法分别检测PML基因重组腺病毒的转导效率,观察培养人KC中PMLmRNA和蛋白的表达量及表达时间,MTT法检测PML基因转染后人KC的生长状况,观察转染PML基因后KC的增殖能力的变化.结果 腺病毒滴度为100MOI时被转染的人KC可达100%,Ad-PML基因转染的人KC能高效表达PMLmRNA和PML蛋白,表达时间可持续2周以上,PML基因对人KC体外生长具有明显抑制作用.结论 腺病毒介导的PML基因能在人KC中高效稳定地表达,能显著抑制人KC的体外生长,PML生长抑制因子有可能用于银屑病等皮肤病的基因治疗.
关键词： 角质形成细胞 早幼粒细胞性白血病基因 腺病毒 -
腺病毒介导血管内皮生长因子基因促进皮下血管新生
目的探讨腺病毒介入性血管内皮生长因子(VEGF)基因导入皮下促进血管新生的可行性.方法使用25G 1ml注射器将0.2ml含有1×109pfu(plaque formation unit)腺病毒AdexCAhVEGF165注入小鼠腹部正中皮下.对照组注入对照腺病毒AdexCAlacZ于小鼠皮下,15天后处死动物,组织学切片随机观察皮下组织中毛细血管数量.结果观察组皮下组织可见大量新生血管.每平方毫米含220±44个毛细血管,较对照组每平方毫米70±14个增加约3倍(t=8.4,P＜0.01).结论 VEGF导入皮下可增加皮下组织毛细血管数量,可望用于缺血性疾病的治疗.
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人血管内皮抑素腺病毒注射液抑制大鼠脉络膜新生血管实验研究
目的:探讨人血管内皮抑素腺病毒注射液(Ad-Es)玻璃体注射对半导体激光诱导的BN(Brown Norway)大鼠脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)的抑制作用.方法: 雄性BN大鼠30只,右眼眼底采用激光光凝建立CNV模型,按随机数字表法分为三组:单次给药组、重复给药组及生理盐水对照组.光凝后21d,单次给药组玻璃体腔内注射Ad-Es 0.01mL;重复给药组玻璃体腔内注射Ad-Es 0.01mL,并于1wk后重复给药;生理盐水对照组玻璃体腔内注射生理盐水0.01mL.观察各组末次给药后7d荧光眼底血管造影荧光素渗漏情况,应用激光共焦显微镜下脉络膜血管平铺法测量各组CNV面积,光镜下观察组织细胞学变化,免疫组织化学检测CNV组织中CD105的表达.结果:FFA造影显示给药组渗漏发生率明显低于生理盐水对照组,重复给药组渗漏发生率低于单次给药组,差异均有统计学意义(P<0.05);激光共焦显微镜下CNV定量分析显示给药组CNV面积显著低于对照组,重复给药组CNV面积低于单次给药组,差异均有统计学意义(P<0.05).光镜下光凝部位新生血管内皮细胞数,给药组明显低于对照组,重复给药组低于单次给药组;CNV组织中CD105的表达,给药组明显低于生理盐水组,重复给药组低于单次给药组.结论:Ad-Es可以有效抑制动物模型的CNV生成,重复给药组抑制效果优于单次给药组,为治疗CNV提供了一种可能的新途径.
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治疗病毒性结膜炎引起的泪小点闭塞
目的：评估以不同的方法治疗病毒性结膜炎并发症泪小点及泪小管闭塞的疗效。
方法：此回顾性群组研究共纳入35例临床确诊为感染病毒性结膜炎的患者,经治疗后完全缓解,4 wk后并发泪小点闭塞。本研究采用了泪小点扩张术,穿孔硅胶泪小点栓子植入术,和Mini-Monoka硅胶管植入术对该35例泪小点闭塞患者进行治疗。
结果：首先,单独采用泪小点扩张术对所有35例患者进行治疗,其中只有6例患者(17.14%)取得了满意的疗效。其次,采用穿孔泪小点栓子植入术对上述采用泪小点扩张术无效的患者进行治疗,有20例(57.14%)患者取得了较好的疗效。后,采用Mini-Monoka管植入术对上述两种治疗方案都无效的患者进行治疗,有9例(25.71%)患者的病情取得了重大的改善。另外,通过对上述病例进行统计分析,结果表明该疾病的严重程度与Mini-Monoka管的使用和是否双眼同时患病或者和上、下泪小点同时闭塞并无关联。
结论：运用穿孔硅胶泪小点栓子能够有效治疗由病毒性结膜炎引起的泪小点闭塞。对分别经泪小点扩张术和穿孔硅胶泪小点栓子植入术治疗无效的患者,可采用 Mini-Monoka管植入术以取得良好的治疗效果。 -
B7-H1基因修饰的调节性DC对小鼠甲状腺相关性眼病的治疗作用
目的：构建表达小鼠B7-H1基因的腺病毒载体,转染修饰树突状细胞,并研究该细胞对小鼠甲状腺相关性眼病( thyroid-associated ophthalmopathy,TAO)的治疗效应。方法：设计并构建小鼠B7-H1的腺病毒表达载体,转染小鼠骨髓来源的树突状细胞,检测该树突状细胞的表型和功能,鉴定其对免疫应答的负向调控能力,采用实验动物模型观察B7-H1基因修饰的树突状细胞在体内治疗TAO的效果。
结果：成功构建出具有良好B7-H1表达效力的腺病毒载体,病毒滴度为1.8伊109 PFU/mL,转染腺病毒的小鼠骨髓来源的树突状细胞表现出调节性树突状细胞性能,能够负向抑制免疫应答；在动物模型中使用该型树突状细胞可以有效控制甲状腺眼病的发生发展。
结论：成功构建了表达小鼠B7-H1基因的腺病毒表达载体,转染了该载体的树突状细胞具有调节性树突状细胞的性能,抑制正向免疫应答,能够有效抑制甲状腺眼病的发生发展,揭示基因修饰的树突状细胞可能成为治疗甲状腺眼病的潜在生物制剂。 -
nm23-H1cDNA克隆及腺病毒载体的构建
目的:在正常人肝组织中克隆nm23-H1cDNA基因,构建腺病毒克隆载体.方法:应用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术,从正常人肝组织中扩增出nm23-H1cDNA,连接到质粒pMD18-T上,经测序、鉴定,与腺病毒穿梭质粒正向连接,构建腺病毒克隆载体.结果:克隆的基因经测序鉴定,与已知nm23-H1cDNA编码区基因100%符合,以此基因成功构建正向腺病毒穿梭质粒载体.结论:利用分子克隆技术,成功克隆中国人nm23-H1cDNA基因,构建出正向重组腺病毒穿梭质粒载体.
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腺病毒介导Epo基因对骨髓间充质干细胞影响的体外研究
目的:研究促红细胞生成素(erythropoietin,Epo)对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)增殖和分化的影响.方法:分离培养大鼠BMMSCs并进行传代;在成骨诱导条件下,以腺病毒为载体,分别携带Epo基因和EGFP基因作为实验组和阴性对照组,转染第3代BMMSCs,以加入相同体积无血清培养基作为空白对照组;通过MTT、RT- PCR、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色以及茜素红染色方法检测细胞的增殖和分化;采用配对t检验进行统计学分析.结果:阴性对照组与空白对照组相比没有差异;实验组与阴性对照组相比,细胞数量增加(P<0.05),ALP染色以及钙结节形成明显;实验组3 d时Runx2、Osx的表达及9 d时OCN的表达增加(P<0.05).结论:Epo能促进BMMSCs的增殖及其向成骨细胞的分化.
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腺病毒介导TWEAK基因对破骨细胞影响的体外研究
目的:研究TWEAK对成熟破骨细胞的作用.方法:体外分离培养破骨细胞;以腺病毒为载体,携带TWEAK基因,转染培养体系中的细胞;3d后计数抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate- resistant acid phosphatase,TRAP)阳性细胞数,7 d后测量骨吸收陷窝的面积.采用t检验分析TWEAK对破骨细胞生存时间和功能的影响.结果:转染空病毒组与空白对照组没有差异;转染TWEAK组与转染空病毒组相比,TRAP阳性细胞数增加(P<0.05),骨吸收陷窝面积增加(P<0.01).结论:腺病毒本身对破骨细胞没有作用.TWEAK在一定程度上能延长破骨细胞的生存时间并能显著促进破骨细胞的骨吸收功能.
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腺病毒介导的TRA/L基因诱导腺样囊性癌细胞凋亡研究
目的:探讨以凋亡基因TRA/L为靶基因,腺病毒(Ad)为载体的重组基因治疗载体AdCMV-TRAIL诱导腺样囊性癌细胞系ACC-2凋亡的功能.方法:用携带绿色荧光蛋白基因EGFP的AdCMV-EGFP检测 腺病毒载体对ACC-2的转染效率;将携带TRAIL基因的AdCMV-TRAIL转染ACC-2;应用RT-PCR方法检测转染后TRA/L基因表达;应用倒置显微镜和荧光倒置显微镜观察细胞形态,MTT方法检测细胞存活率,应用流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡率.结果:AdCMV-EGFP在1000 p/cell时转染效率为100%:RT-PCR在实验组检测到594 bp的TRA/L基因;AdCMV-TRAIL组和AdCMV-EGFP组的细胞存活率随着时间逐渐下降,且转染AdCMV-TRAIL的肿瘤细胞比转染AdCMV-EGFP的肿瘤细胞下降快,统计学分析有显著差异(P<0.001).AdCMV-TRAIL和AdCMV-EGFP均能促进腺样囊性癌细胞凋亡,且转染AdCMV-TRAIL 引发细胞凋亡的程度明显较AdCMV-EGFP组大,统计学分析有非常显著的差异(P=0.0005).结论:Ad-CMV-TRAIL在体外能明显抑制ACC-2细胞的活性,有效促使其凋亡;AdCMV-TRAIL可以成为腺样囊性癌转基因治疗的新策略.
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忍冬感冒胶囊抗腺病毒体外实验
目的对忍冬感冒胶囊抗腺病毒感染进行体外试验.方法采用细胞培养观察药物对细胞病变作用的影响.结果忍冬感冒胶囊浸液两种接种方法对腺病毒Ⅲ型(Ad3)感染的IC50分别为500和93.02 g·L-1,IC90为952.38和134.95 g·L-1,MIC为288.18和67.98 g·L-1.结论忍冬感冒胶囊浸液浓度500～125 g·L-1,对腺病毒Ⅲ型(Ad3)有较强直接灭活作用(P＜0.01);浓度1000～500 g·L-1,可抑制和/或延缓腺病毒Ⅲ型(Ad3)在细胞内的增殖.
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促凋亡蛋白PUMA对小鼠肝细胞凋亡的影响及其分子机制
目的:通过腺病毒介导puma在小鼠肝细胞BNL.CL2内过表达,观察其对周期和凋亡的影响及其分子机制.方法:用HEK293 low passage(LP)细胞包装制备重组PUMA腺病毒(Ad-puma)和GFP(Ad-GFP)腺病毒,PCR,Western Blot检测鉴定包装的腺病毒.腺病毒感染BNL.CL2细胞后,流式细胞仪检测感染Ad-PUMA后的BNL.CL2细胞的周期和凋亡.免疫共沉淀实验分析BCL-2家族成员间在PUMA介导的凋亡中的相互作用.结果:①用HEK293包装制备了目的细胞中有效高表达Ad-PUMA和Ad-GFP浓缩病毒存储液.所制备的病毒浓缩液Ad-PUMA的滴度为2.0 × 10~(11)ifu/L;Ad-GFP滴度为2.1×10~(12)ifz/L.②Ad-PUMA感染BNL CL.2细胞后24,36 h与对照组相比细胞凋亡增加;36 h S期细胞明显增多细胞周期中的S期的细胞则明显增多,G2期细胞相对减少.③小鼠肝细胞中PUMA介导的凋亡不仅可能与PUMA,Bax与Bcl-XL的竞争性结合作用有关,也存在PUMA与Bax的直接激活作用.结论:PUMA可有效地促进鼠肝细胞BNL.CL2的凋亡.可能Ad-PUMA介导的PUMA过表达后使细胞从S期到G2期时发生停留或阻滞.在BNL.CL2细胞中,PUMA促凋亡的分子机制既与PUMA,Bax与Bcl-XL的竞争性结合作用有关,也存在PUMA与Bax的直接相互作用.
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FLIP腺病毒表达载体的构建及其在大鼠肺血管内皮细胞中的表达
目的:构建FLIP(FLICE-inhibitory protein)腺病毒表达载体并观察该载体在大鼠肺血管内皮细胞(PVEC)中的表达情况,为研究FLIP蛋白的抗凋亡作用打下基础. 方法:利用含有大鼠FLIP基因的原始载体,通过Admax腺病毒包装系统,构建表达大鼠FLIP基因的重组腺病毒Ad-FLIP;原代培养并鉴定大鼠PVEC.利用成功构建的重组腺病毒Ad-FLIP感染大鼠PVEC.通过逆转录酶一多聚酶链反应(reverse tran-seriptase-polymerase chain reaction,RT-PeR)和Western Blot分别检测经重组腺病毒Ad-FLIP感染后大鼠PVEC及对照组细胞中FLIP基凶mRNA和蛋白表达水平. 结果:成功构建含有大鼠FLIP基因的重组腺病毒Ad-FIJP;经Ⅷ因子间接免疫荧光鉴定原代培养大鼠PVEC纯度达90%以上;大鼠PVEC经重组腺病毒Ad-FLIP感染后24 h即检测到FLIP mRNA和蛋白表达水平明显增高. 结论:重组腺病毒Ad-FLIP可有效提高大鼠PVEC中FLIP基因的表达水平.
