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腺病毒介导的RNA干涉对乳腺癌SKBR3细胞HER2的下调及生长抑制效应
目的:探讨采用腺病毒做为载体介导基于RNA干涉的针对高HER2肿瘤的基因治疗的可能性.方法:构建HER2-绿色荧光蛋白融合蛋白表达质粒pHER2-GFP,并与9种针对HER2不同靶序列的siRNA表达质粒分别共转染CHO-K1细胞, 根据荧光蛋白表达量从中筛选出沉默效率高的质粒.将筛选出的质粒转染HER2高表达乳腺癌SKBR3细胞,检测它们对HER2表达的影响.随后, 将siRNA转录单元克隆入腺病毒载体, 成功包装病毒后感染SKBR3细胞, 再次测定其下调HER2的效应及其对细胞生长的影响.结果:2种有效下调HER2表达的质粒被筛选出来.将此2种质粒所含siRNA转录单元包装入腺病毒后仍然保持了原有的基因沉默效应.HER2下调增加了SKBR3细胞中G1期细胞的比例,并且诱导部分细胞凋亡.MTT和细胞长期增殖抑制实验表明腺病毒介导的RNA干涉抑制了SKBR3细胞生长.结论:重组腺病毒介导的RNA干涉能够下调HER2的表达并且对高表达HER2的乳腺癌细胞有生长抑制作用.
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腺病毒细菌重组系统表达Crg-2蛋白的实验研究
目的:利用腺病毒的细菌重组系统表达同时具有免疫趋化及血管抑制活性的趋化性细胞因子Crg-2重组蛋白.方法:首先在大肠杆菌BJ5183中将穿梭质粒pShuttle-cmv/crg-2与AdE1区基因缺失的骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组,筛选后脂质体法转染入具有AdE1区组成性表达的293包装细胞中进行病毒包装、扩增;Western blot检测病毒感染293细胞的蛋白表达;趋化实验检测感染细胞上清对激活T淋巴细胞的趋化活性.结果:穿梭质粒pShuttle-cmv/crg-2与骨架质粒pAdEasy-1重组后,经酶切及PCR鉴定获得重组腺病毒基因组质粒pAd/crg-2;病毒Ad/crg-2经包装并扩增后,用组织培养感染半数剂量法(TCID50)法测定病毒滴度达4×109TCID50/L,感染细胞经Western blot检测有一接近Mr10 000蛋白条带,分泌上清对激活的脾淋巴细胞有明显的趋化作用.结论:采用细菌重组法成功获得重组腺病毒Ad/crg2,可高效表达趋化性细胞因子Crg-2.
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小鼠FasL全长cDNA的克隆与FasL腺病毒载体的构建
目的: 克隆小鼠FasL全长cDNA, 构建FasL腺病毒载体.方法: 从经ConA(5 mg/L)刺激48 h的BALB/c小鼠脾脏单个核细胞中克隆FasL 全长cDNA, 构建以CMV启动子转录调控的含小鼠FasL全长cDNA的穿梭质粒mFasL-pAdTrack.经Pac I酶切后, 与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组.挑选阳性重组子转染HEK-293细胞, 构建CMV启动子转录调控的mFasL重组腺病毒载体.结果: 成功地克隆小鼠FasL全长cDNA, 经PCR、酶切及荧光检测等证实, 成功地构建了重组mFasL腺病毒载体.结论: 重组FasL腺病毒载体的构建为进一步研究FasL在肿瘤和自身免疫性疾病的作用奠定了基础.
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TR基因重组腺病毒载体的构建和鉴定
目的:构建含人硫氧还蛋白还原酶(TR)基因的重组腺病毒载体,探讨TR的抗氧化功能与神经退行性疾病的相关性.方法:从重组质粒pGEM-TR上用内切酶切下编码500个氨基酸的全长TR cDNA片段,并连接穿梭质粒pShuttle,再双酶切pShuttle-TR.将带有CMV启动子的目的片段,插入E1、E3缺失的Adeno-X病毒DNA中,以Adeno-TR DNA通过脂质体转染HEK293细胞,获得重组腺病毒Adeno-TR进行PCR鉴定及病毒滴度测定.用重组腺病毒感染CV1细胞,通过免疫荧光染色与Western blot分别检测重组腺病毒感染的细胞上和裂解液中TR蛋白的表达.结果:重组腺病毒Adeno-TR的病毒滴度为4.4×1011pfu/L.PCR、荧光显微镜证实,以及Western bolt分析,在相对分子质量(Mr)约55 000处均出现特异性条带.结论:成功地构建了重组腺病毒载体,并能介导外源基因TR表达,为进一步研究TR的功能及其与疾病的相关性奠定了基础.
关键词： 人硫氧还蛋白还原酶基因 腺病毒 基因表达载体 -
人LIGHT基因的克隆及其重组腺病毒载体的构建
目的克隆人LIGHT基因,构建其重组腺病毒载体,以研究LIGHT过表达与腺病毒感染对细胞生长的影响.方法用RT-PCR法从人外周血单个核细胞(PBMC)中克隆人的LIGHT全长基因.将LIGHTcDNA克隆到穿棱载体pAdTrack-CMV-LIGHT重组质粒中,经酶切线性化后,将重组质粒pAdTrack-CMV-LIGHT和骨架质粒pAdEasy-1,以电穿孔法共转染大肠杆菌BJ5183,获得重组腺病毒质粒.后,将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒,用荧光显微镜、PCR及Western blot分析LIGHT基因的表达. 结果用RT-PCR法从人的PBMC中,扩增出723bp的cDNA,测序证实为人LIGHT基因.荧光显微镜、PCR及Westernblot证实,LIGHT重组腺病毒可感染293细胞,并在293细胞内进行有效的复制.结论成功地克隆了人LIGHT基因,并构建了其重组腺病毒载体,为进一步研究LIGHT基因的功能提供了条件.
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Ⅴ型腺病毒纤毛基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达
目的克隆腺病毒纤毛基因,为构建腺病毒靶向性载体创造条件.方法应用限制性内切酶酶切技术,酶切腺病毒骨架质粒pAdEasy-1,经多次亚克隆后完成克隆纤毛基因,并构建纤毛基因原核表达载体.用IPTG诱导纤毛蛋白的表达,再用SDS-PAGE和Western blot对其进行分析.结果成功地克隆纤毛基因.质粒pBS/Fiber经限制性内切酶酶切鉴定及测序证实了其正确性.经质粒pQE/Fiber转化的细菌,在IPTG诱导下可表达一种新的蛋白,并于5h表达量高.经Western blot证实,在变性条件下表达蛋白的Mr为62 000,在非变性条件下为186 000.结论已克隆的纤毛基因能在大肠杆菌中表达,并具有三聚体结构,可用于腺病毒载体靶向性构建.
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腺病毒介导的肝癌靶向SEA-CD80基因治疗及免疫学机制的初步研究
目的: 观察肝癌靶向性葡萄球菌肠毒素A (SEA)/CD80基因重组腺病毒载体对肝癌的疗效,并对其免疫学机制进行初步研究.方法: 利用AdEasy腺病毒系统分别构建并制备甲胎蛋白(AFP)启动子和增强子Ⅰ调控的SEA和/或CD80基因重组腺病毒载体, 然后采用瘤体内直接注射的方式对小鼠皮下移植性肝癌进行治疗, 采用RT-PCR和Western blot方法检测腺病毒注射部位的SEA和CD80 mRNA和蛋白的表达情况; 采用ELISpot方法和LDH释放实验分别检测脾脏淋巴细胞中肝癌特异性IFN-γ分泌细胞的频数和细胞毒性T细胞(CTLs)对Hepa1-6细胞的特异杀伤活性; 通过观察荷瘤小鼠经治疗后肿瘤体积的变化及生存时间, 评价重组腺病毒对肝癌的治疗作用.结果: 我们构建的腺病毒能够使SEA和/或CD80 mRNA和蛋白靶向地在肝癌组织中表达; 与空载体组和PBS对照组相比, 双基因组和单基因组分泌IFN-γ的T细胞数量均明显增多, CTL对Hepa1-6细胞的特异性杀伤作用均明显增强, 荷瘤小鼠肿瘤体积明显减小, 生存期明显延长; 双基因组的疗效和对免疫系统的激活作用明显高于单基因组; CD80 和SEA的组之间、空载体和PBS组之间无明显差异.结论: 我们制备的肝癌靶向性重组腺病毒对肝癌有良好的治疗作用, 联合基因治疗优于单个基因治疗.
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肝癌靶向性SEA-CD80基因共表达重组腺病毒载体的构建及表达鉴定
目的:构建肝癌靶向性葡萄球菌肠毒素A(SEA)和CD80基因共表达重组腺病毒载体.方法:首先利用现有的腺病毒穿梭质粒pShuttle和pShuttle-CMV,构建新的不带CMV增强子/启动子而带有polyA加尾信号穿梭质粒,命名为pShuttle2.将AFP增强子、启动子、 SEA及CD80基因分别从已构建的pKS-EP载体和pMD18-T-BIS载体上,分别亚克隆至pShuttle2中,再与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化E.coli BJ5183.以获得的重组子转染HEK293细胞后制备重组腺病毒,然后感染高表达AFP的肝癌细胞系Hepa1-6和不表达AFP的黑色素瘤细胞系B16、成纤维细胞系NIH3T3.采用间接免疫荧光法,激光共聚焦显微镜观察和流式细胞术检测SEA和CD80在细胞膜表面的表达.采用 3H掺入法检测膜表达的SEA诱导淋巴细胞增殖的活性.结果:以制备的重组腺病毒感染肿瘤细胞后,SEA和CD80能够靶向性地共表达在高表达AFP的Hepa1-6细胞膜上,而在不表达AFP的B16、 NIH3T3细胞膜上不表达.结论:成功地构建肝癌靶向性SEA和CD80基因共表达重组腺病毒载体,为进一步研究SEA和CD80在肝癌靶向基因治疗中的联合应用及其抗肿瘤免疫机制奠定了基础.
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具有中和活性抗人类腺病毒单克隆抗体的制备、鉴定及应用
目的:制备具有中和活性抗人类腺病毒(HAdv)单克隆抗体(mAb),并进行鉴定与应用.方法:以活的人类腺病毒3型(HAdv-3)滴鼻免疫BALB/c鼠,用细胞融合技术制备抗HAdv 的mAb细胞株,采用中期分裂相秋水仙素阻抑法对mAb细胞株染色体进行分析;使用鼠mAb亚型鉴定试剂盒进行抗体亚型鉴定,通过ELISA、Western blot和间接免疫荧光技术进行特异性鉴定.建立HAdv-3感染动物模型,用获得的HAdv-3 mAb进行保护性研究.结果:细胞融合率为86%,抗HAdv抗体阳性孔率为51.4%.鉴定1株杂交瘤细胞(1A4),染色体数为98条,抗体亚类属IgG2a/κ,抗体腹水ELISA效价达10~(-5).ELISA、Western blot和间接免疫荧光证实该mAb特异性好.该mAb对HAdv-3感染动物有保护性作用.结论:成功地制备具有中和活性的抗HAdv mAb.该mAb识别的是HAdv六邻体蛋白,对HAdv-3感染动物有保护作用.
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人Qki-5基因重组腺病毒的制备
目的:构建针对Qki-5人重组腺病毒表达载体,并在能在转染该病毒的人乳腺癌细胞株MDA-MB-231中观察到该基因过表达效果.方法:重组腺病毒穿梭载体pShuttle-Qki-5-IRES-EGFP与骨架载体共转化到大肠杆菌BJ5183中,同源重组得到重组腺病毒载体,后者转染HEK293细胞,包装并扩增出病毒颗粒.用获得的病毒感染Qki-5表达较低的人乳腺癌细胞株MDA-MB-231,收集细胞总RNA和总蛋白,采用RT-PCR和Western blot方法检测细胞中基因表达的变化.结果:经限制性内切酶酶切鉴定,证实针对Qki-5基因的重组腺病毒载体构建成功.RT-PCR和Western blot方法证实,在MDA-MB-231细胞中,Qki-5基因在mRNA和蛋白水平均有上升.结论:Qki-5腺病毒载体够建成功并且可以在乳腺癌细胞MDA-MB-231内表达.
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腺病毒介导CTLA4Ig和Iκ-Bα双基因在ECV304细胞中的表达
目的: 通过制备细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4融合蛋白(CTLA4Ig)和核因子的抑制蛋白(Iκ-Bα)双基因共表达腺病毒载体, 检测重组腺病毒在ECV304细胞中的表达. 方法: 将Iκ-Bα和CTLA4Ig通过内部核糖体进入部位(IRES2)连接, 并以基因重组的形式插入腺病毒表达载体, 构建重组腺病毒, 检测 Iκ-Bα和CTLA4Ig在ECV304细胞中的蛋白表达情况及其对炎症介质TNF的调控效应.结果: (1)构建pAdTrack-CMV-CTLA4Ig-IRES2-IκBα, 与pAdEasy在BJ5183重组后转染293, 获得重组腺病毒.(2)PCR鉴定重组腺病毒正确.(3)用重组腺病毒感染体外培养的ECV304后, 该腺病毒可表达Iκ-Bα蛋白及CTLA4Ig蛋白, 且可以下调LPS攻击后TNF-α的产生. 结论: 构建人CTLA4Ig, Iκ-Bα双基因共表达腺病毒载体, 可以有效的抑制炎症因子的表达, 为进一步的CTLA4Ig免疫耐受基因治疗中的抑制, 因NF-κB的过度激活而产生的炎性反应提供研究基础.
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抗病毒蛋白MxA的诱导和检测方法的实验研究
目的研究抗病毒蛋白MxA的表达及其活性.方法用IFNα2b或3型腺病毒(Ad3)分别对WI-38细胞或人外周血单个核细胞(PBMCs)作用12或24 h,并用Western blot法或FACS法,分别对MxA蛋白的表达进行定性和定量检测.采用微量细胞病变抑制法,对重组的MxA和IFNα2b进行抗病毒效应实验.结果 (1) 低浓度的IFNα2b (>1×103 IU/L)和Ad3 (>200 TCID50),均可诱导相应细胞表达MxA;(2) 10 μg/LMxA可抵抗20个TCID50的HSV-I、Polio.V感染Vero细胞、Ad3感染HeLa细胞,抵抗200个TCID50的VSV感染Wish细胞.结论 MxA只能由干扰素(INFα2b)或病毒诱导产生,其具有广谱的抗病毒活性.
关键词： MxA 基因表达调控 INFα2b 腺病毒 微量细胞病变抑制试验 -
肝脏Kupffer细胞摄取清除腺病毒载体的机制
腺病毒载体因其具有广泛趋向性、高效率表达目的基因等优点而成为表达和传递治疗基因的主要候选者.但是,由于它可以快速的经循环系统到达网状内皮系统(特别是Kupffer细胞)被摄取和清除,只有少数碎片能到达靶器官,因此这也成为了腺病毒作为载体应用于基因治疗的主要障碍.该文综述了Kupffer细胞摄取、清除腺病毒这一过程可能存在的机制,为实现腺病毒裁体转基因持久表达提供临床参考.
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5型腺病毒载体与血小板减少的研究进展
腺病毒有两种属性:首先它们是普遍存在的病原体,机会性的引起威胁生命的疾病;其次也可以加工成为有效的转基因载体.然而,在进行腺病毒载体基因治疗时会引起血小板减少,但是其机制仍然不明.该文章的目的 在于总结目前关于5型腺病毒载体基因治疗后导致血小板减少的可能机制,为腺病毒载体的安全应用提供参考.
关键词： 腺病毒 腺病毒载体 柯萨奇腺病毒受体(CAR) 整合素受体 血小板活化因子 -
两种不同方法对轮状病毒和腺病毒抗原检测的比较
目的：比较应用自动粪便前处理系统（简称为仪器法）和手工法对轮状病毒（RV）和腺病毒（AdV）抗原检测的结果。方法收集2014年9月～10月在北京协和医院肠道门诊就诊的腹泻患者粪便标本100份，分别用仪器法和手工法对粪便进行处理后，检测 RV 和 AdV 抗原，并用液相芯片法对阳性标本进行核酸检测验证结果。结果仪器法检测对 RV， AdV 及二者共同感染的抗原阳性率分别是17.0％（17／100），25.0％（25／100）和12.0％（12／100），手工法的抗原阳性率分别是4.0％（4／100），13.0％（13／100）和2.0％（2／100）。以核酸检测结果为金标准，仪器法检测 RV，AdV 及二者共同感染的假阳性率分别是23.5％（4／17），20.0％（5／25）和33.3％（4／12），手工法的假阳性率分别是75.0％（3／4），69.2％（9／13）和50.0％（1／2）。采用配对资料的检验进行χ2统计分析，两种方法检测 RV 和 AdV 总阳性率，RV 的假阳性率和 AdV 假阳性率差异均有统计学意义（χ2＝15.0，52.8和47.5，P 值均＜0.05）；两种方法检测结果一致性较差（Kappa 值为0.25， Kappa 值＜0.4）。结论仪器法检测 RV 和 AdV 抗原阳性率及假阳性率方面均优于手工法，更有利于临床应用。
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HCMV、AdV和HBV抗原在IgA肾病患者肾组织中的表达及其临床意义
目的:探讨IgA肾病患者人巨细胞病毒(HCMV)、腺病毒(AdV)和乙型肝炎病毒(HBV)抗原在其肾组织中的表达及临床意义,为临床预防和治疗IgA肾病提供必要的参考依据.方法:50例患者均采用免疫组织化学技术检测人巨细胞病毒、腺病毒、乙型肝炎病毒抗原,分析检测结果.结果:人巨细胞病毒多表达于肾小球及肾小管;肾小管上皮细胞内腺病毒表达水平较高,且在肾间质及肾小球内存在微量表达;肾小管、肾小球间质破坏程度与人巨细胞病毒抗原表达水平变化有一定的相关性,两者呈现正相关;乙型肝炎病毒在肾小管上皮细胞内的表达水平较高,也有微量表达于肾间质、肾小球内.肾小管、肾小球间质破坏程度与乙型肝炎病毒表达水平变化不相关.结论:临床上尚未具体明确人巨细胞病毒、腺病毒、乙型肝炎病毒抗原在IgA肾病的发生、发展中的具体作用机制,今后仍需加大研究力度.但是,在IgA肾病的发生与发展过程中,人巨细胞病毒、腺病毒、乙型肝炎病毒抗原均发挥着重要的作用,这一结论得到证实.
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腺病毒介导hHO-1基因体外转染骨髓间充质干细胞
目的 以腺病毒(adenovirus.Adv)为载体将人血红素加氧酶(human hemo-oxygenase,hHO)-1基因转染至骨髓间充质干细胞(MSC)中,为干细胞移植联合hHO-1基因治疗心血管疾病奠定实验基础.方法 以密度梯度离心结合贴壁筛选法分离培养骨髓MSC.将携带有hHO-1基凶与绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的腺病毒体外扩增与鉴定后,以不同感染复数(multiplicity ofinfection,MOI)转染MSC.在荧光显微镜下观察转染后CFP的表达,以反转录(RT)-聚合酶链式反应(PCR)法检测目的 基因hHO-1 mRNA在MSC中的表达,4'6'-二乙酰基-2-苯基吲哚(DA-PU染色观察hHO-1基因转染对MSC的影响.结果 将Adv-hHO-1体外扩增、纯化后,经PCR鉴定可得到555 bp的目的 条带.转染后24 h,MSC中即可见GFP的表达,荧光强度随MOI的增加而增强.RT-PCR法检测显示,不同MOI的转染组均有hHO-1 mRNA表达,随MOI的增加其表达强度也逐渐增强(P＜0.05).DAPI染色显示,hHO-1基因转染后,细胞的生长及形态无明显变化.结论 以Adv为载体可成功地将hHO-1基因转染至骨髓MSC中,转染效率随转染滴度的增加而增加,转染后对细胞的牛物学活性尤明显影响.
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Fas配体基因导入对大鼠颈动脉损伤后新生内膜的影响
目的:探讨腺病毒载体介导Fas配体(FasL)基因导入对大鼠颈动脉损伤后新生内膜的影响.方法: 利用重组腺病毒载体将FasL导入大鼠颈动脉球囊损伤的内膜,14 d后观察其对新生内膜形成的影响.结果: 通过腺病毒载体介导导入FasL基因的被球囊损伤的大鼠颈动脉,与Ad-β gal基因的对照组相比较,14 d后损伤血管新生内膜/中膜面积比降低了73%(P<0.01).结论: FasL可抑制新生内膜的增生.
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Survivin启动子驱动腺病毒介导LRIG1基因治疗前列腺癌的体外实验
目的 由于去势抵抗性前列腺癌(CRPC)缺乏有效治疗方法,因此催生了探索新治疗模式的需求,其中靶向基因治疗可能是治疗CRPC的较理想模式;但是CRPC的靶向性基因治疗尚没有受到应有的关注.本课题拟研究Survivin启动子驱动的重组腺病毒Ad-Surp-LRIGl对前列腺癌细胞株的体外治疗效果.方法 用Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl分别感染人前列腺癌细胞PC-3M及人前列腺上皮细胞CRL-11609 RWPE-1,根据报告基因EGFR表达的不同计算病毒的细胞转染率.MTT法评估Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl对PC-3M细胞生长的抑制作用.结果 当MOI=25时,Ad-Surp-LRIGl在PC-3M细胞中的转染效率为81.24%,在CRL-11609 RWPE-1细胞中转染率为0,在两种细胞内的转染率比较差异有显著性意义(χ2=65.18,P=0.000);Ad-LRIGl在PC-3M细胞中的转染效率为77.22%,在CRL-11609 RWPE-1细胞中转染率为71.68%,转染率比较差异无显著性意义(χ2=0.051,P=0.802).Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl在PC-3M细胞中的转染率相比,差异无显著性意义(χ2=0.013,P=0.796).在常规培养1d 后PBS组的细胞生长速度即开始超过Ad-Surp-LRIGl组和Ad-LRIGl组细胞,4 d 后细胞生长速度差异显著(χ2=15.37,P=0.001),而Ad-Surp-LRIGl组和Ad-LRIGl组细胞生长速度无明显差异.结论 Ad-Surp-LRIGl能选择性转染人前列腺癌细胞PC-3M,能明显抑制体外前列腺癌细胞的生长.
关键词： 前列腺癌 腺病毒 Survivin启动子 Lrig1基因 治疗 -
P16基因转染对人膀胱癌细胞生物学特性的影响
目的探讨P16基因修饰后人膀胱癌细胞体外培养生物学特性的变化.方法将携带P16基因的腺病毒体外转染人膀胱癌T24细胞,观察腺病毒对T24细胞的转染效率以及P16基因修饰的T24细胞体外生物学特性的改变.结果在多重感染度(MOI)值为50,转染时间为12h时,能够达到75%～80%的转染效率,并获得目的基因P16蛋白的高效表达.转染P16基因的T24细胞生长明显受到抑制,Fas和MHCI类抗原表达增高.细胞周期分析显示细胞阻滞于G0/G1期的比例明显高于对照组(85%比62%).结论人膀胱癌细胞中外源P16基因的表达不仅直接抑制肿瘤细胞的恶性增殖,还可诱导细胞发生凋亡,同时能增强肿瘤细胞的自身免疫原性.
