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RNAi功能及应用
RNA干涉(RNA interference,RNAi)是将双链RNA(dsRNA)导入细胞引起特异基因mRNA降解的一种细胞反应过程,它是转录后基因沉默(PTGS)的一种.这一过程已经在包括拟南芥,线虫和真菌等多种模式生物中得到揭示.RNAi具有高效性和高度特异性,在维持基因组稳定、基因表达调控,保护基因组免受外源核酸侵入等方面发挥重要生物学作用.RNAi作为基因沉默的一个工具,RNAi作为基因沉默的一个工具,已被广泛用于基因功能研究.基因治疗和新药研究与开发等方面.
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EB病毒潜伏膜蛋白LMP1编码基因沉默对NF-kB表达的影响
目的:探讨EBV阳性胃上皮细胞中潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)基因沉默对NF-kB转录表达的影响.方法:以稳定表达LMP1的EBV阳性胃上皮细胞系作为靶细胞,采用化学合成的siRNA特异性沉默LMP1,用RT-PCR和Westem-blotting分别检测其在不同时间段mRNA和蛋白水平特异性沉默效果;Western blotting及免疫酶染色法检测LMP1基因沉默对NF-kB转录表达及核转移的影响.结果:siRNA在mRNA和蛋白水平可特异性沉默LMP1的表达,且有时间效应关系;Westem blotting及免疫酶染色法检测结果显示LMP1沉默可干扰NF-kB表达,导致靶细胞核内NF-kB水平下降,细胞浆内水平升高,而NF-kB总蛋白有下降趋势.结论:LMP1基因特异性沉默能够影响NF-kB表达,抑制其核转移.
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RNA干涉(RNAi)抑制宫颈癌细胞SiHa中E7基因表达的实验研究
目的 探讨HPV16 E7特异性小干涉RNA(siRNA)表达栽体对宫颈癌 SiHa 细胞E7基因的抑制作用.方法 构建 HPV16 E7 特异性表运载体,利用脂质粒转染 SiHa 细胞,用RT-PCR及Western blot检测其对E7 mRNA及蛋白的影响.结果 两条siRNA均能有效抑制 E7 mRNA 的转录表达,其中以pshRNA-HPV16 E71作用效果明显,在转染后72 h,对E7 mRNA和蛋白的抑制率分别为 78.4%和57.6%.结论 HPV16 E7 siRNA表达载体对宫颈癌SiHa细胞E7基因的表达有抑制作用.
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水溶性脂聚体可运载N-甲基-D-天冬氨酸受体2B小干涉RNA治疗慢性炎性疼痛
目的 慢性炎性疼痛的基因治疗缺乏安全且高效的载体,本实验探讨了低分子量聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)和胆固醇组成的水溶性脂聚体(water-soluble lipopolymer,WSLP)运载N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基(N-Methyl-D-aspartic acid receptor 2B,NR2B)小干涉RNA(small interfering RNA,siRNA)治疗大鼠慢性炎性疼痛的可行性. 方法 将WSLP直接与靶向NR2B的siRNA连接形成WSLP/siRNA复合物,乱序siRNA作为对照(WSLP/scRNA)；然后检测鞘内注射WSLP/siRNA对完全弗氏佐剂(freund's adjuvant complete,CFA)炎性痛模型大鼠脊髓背角(spinal cord doral horn,SCDH)NR2B蛋白表达的影响,并且测定鞘内注射此复合物后炎性痛大鼠机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT)及热缩足反射持续时间(thermal withdrawal duration,TWD)的变化. 结果 WSLP/siRNA注射后3d,炎性疼痛大鼠SCDH NR2B蛋白水平的表达与CFA组比较显著下降58％(P＜0.01),WSLP/scRNA及PEI/siRNA注射后NR2B的表达无明显变化(P＞0.05).WSLP/siRNA鞘内注射后3、4d及5d炎性痛大鼠的MWT [(3 d:(9.2±1.3)；4 d:(9.8±1.2)；5 d:(9.5±1.2)]较CFA组[(3 d:(4.6±1.2)；4 d:(4.9±1.8)；5 d:(5.0±1.8)]显著增高(P＜0.01),TWD[(3 d:(3.27±0.32)s；4 d:(3.83±0.49)s；5 d:(3.57±0.33)s]较CFA组[(3 d:(6.71±0.45)s；4 d:(6.97±0.54)s；5 d:(6.63±0.38)s]显著缩短(P＜0.01),WSLP/scRNA及PEI/siRNA均无此治疗作用(P＞0.05). 结论 WSLP可有效运载siRNA抑制CFA所致慢性炎性痛大鼠NR2B的过度表达,从而对炎性疼痛大鼠具有治疗作用.
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水溶性纳米凝脂聚合物运载siRNA沉默PC12细胞N-甲基-D-天冬氨酸受体1基因的实验研究
目的 探讨离体条件下水溶性纳米凝脂聚合物(water-soluble lipopolymer,WSLP)运载小干涉RNA(small interference RNA,siRNA)沉默N-甲基-天冬氨酸受体1(N-methyl-D-aspartate receptor 1,NMDAR1)基因的可行性,为在体条件下研究WSLP运载siRNA沉默NMDAR1治疗慢性疼痛等疾病打下基础.方法 先合成WSLP并与NMDAR1 siRNA连接成WSLP/siRNA复合物,观察其在血清中的稳定性及其对PC12细胞的毒性；然后将PC12细胞通过随机数字表法分为阴性转染组(单纯siRNA转染PC12细胞)、对照转染组(WSLP/乱序siRNA复合物转染PC12细胞)及WSLP转染组(WSLP/siRNA转染PC12细胞),通过实时-聚合酶链反应(real time polymerase chain reaction,RT-PCR)和免疫蛋白印迹法(western-blot)检测各组NMDAR1转录水平及蛋白水平基因表达的变化.结果 WSLP/NMDAR1/siRNA在血清中的稳定性高,对PC12细胞几乎无毒性.与阴性转染组(0.69±0.18、4.36±1.02)相比,WSLP转染组(0.35±0.21、1.96±0.48)转录水平NMDAR1的基因表达降低50％,蛋白表达水平降低55％,差异均有统计学意义(P＜0.01),阴性转染组和对照转染组(0.640.13、4.32±1.09)之间的基因表达水平差异无统计学意义.结论 离体条件下WSLP可有效运载siRNA沉默NMDAR1基因的表达.
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RNA干扰技术在消化系肿瘤基因治疗中的应用
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由内源性或外源性双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)所诱发,高度特异性降解细胞内同源mRNA,使基因沉默的现象.这种现象发生在转录后水平,故又称为转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS)[1].
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银杏内酯B通过激活孕烷X受体诱导CYP3 A4的表达
目的：研究银杏内酯B（ginkgolide B）对CYP3A4的诱导作用，进一步验证是否通过激活孕烷 X 受体实现对CYP3A4 mRNA和蛋白水平的诱导表达。方法用不同浓度银杏内酯 B 处理 LS174T 细胞，通过 Q-PCR 法检测CYP3A4 mRNA表达变化，进一步利用本实验室构建的PXR-CYP3A4稳定转染HepG2工程细胞株，结合荧光素酶报告基因技术，显示检测银杏内酯B对PXR的转录激活活性的影响。蛋白质免疫印迹法检测CYP3 A4蛋白水平表达的变化；利用siRNA技术敲低PXR的mRNA表达，检测在PXR低表达的条件下银杏内酯B对CYP3A4 mRNA和蛋白水平表达影响。结果银杏内酯B可以浓度依赖性的使CYP3 A4基因及蛋白表达水平上调，报告基因结果显示，银杏内酯B能够浓度依赖性的增强PXR的转录激活活性，在PXR低表达的条件下，银杏内酯B对CYP3 A4诱导作用明显低于正常表达组PXR。结论以上表明银杏内酯B 通过激活PXR受体，促进其转录激活活性进而诱导CYP3 A4表达上调，同时对PXR自身的表达无明显影响。
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RNA干涉及其应用
目的综述RNA干涉可能的作用机制及其在基因功能研究和基因治疗等方面的应用前景与展望.方法通过检索国内外文献资料进行分析、整理、总结.结果RNA干涉是由特定双链RNA(dsRNA)引起的转录后基因沉默现象.RNA干涉在基因功能研究和疾病基因治疗中已初步显示了其巨大优势.结论RNA干涉将是基因功能研究和疾病基因治疗的革命性工具.
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下调TPH2重组慢病毒载体的构建及鉴定
目的 构建色氨酸羟化酶(TPH)-2基因小干涉RNA的重组慢病毒载体.方法 在TPH-2 mRNA序列中选择1个特异性靶序列,体外合成对应发卡样DNA片段,经退火后,将其定向克隆入siRNA载体,获得重组质粒pU6 -MCS-CMV-TPH2-shRNA,后者与慢病毒试剂共转染293细胞,同源重组产生Lentivirus-TPH2-siRNA.经聚合酶链反应(PCR)鉴定目的基因的表达并测定病毒滴度.结果 PCR表明Lentivirus-TPH2-siRNA构建正确,病毒滴度为3×108 TU/rnl.结论 获得的Lentivirus-TPH2-siRNA可以用于转基因瘙痒治疗的实验研究.
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RNA干涉及其在肿瘤研究中的应用
RNAi是双链RNA介导的转录后基因沉默的过程,是一种高效的高特异性抑制基因表达的新途径.通过双链小干涉RNA(siRNA)与一系列蛋白质结合形成siRNA诱导的沉默复合体(RISC)并活化,然后,RISC对靶基因进行识别、降解.与反义方法相比,siRNA具有更好的抑制效果.RNAi的应用将为癌症的基因治疗提供新的方法.
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纳米凝脂聚合物运载siRNA沉默PC12细胞NMDAR1基因的实验研究
目的 探讨离体条件下水溶性纳米凝脂聚合物(water soluble lipopolymer,WSLP)运载小干涉(siRNA)沉默PC12细胞NMDAR1基因的可行性.方法 在先前合成了WSLP的基础上,将合成的WSLP与siRNA连接形成WSLP/NMDAR1/siRNA.实验分为3组:阴性转染组,只用NMDAR1/siRNA转染PC12细胞;对照转染组,WSLP与乱序siRNA结合后转染PC12细胞;WSLP转染组,用WSLP与siRNA/NMDAR1结合转染PC12细胞.使用RT-PCR和Western-blot技术检测其对PC12细胞NMDAR1的基因表达的影响.结果 RT-PCR和Westernblot结果表明WSLP/NMDAR1/siRNA可显著抑制PC12细胞NMDAR1的表达.结论 WSLP在离体条件下可有效运载siRNA沉默NMDAR1基因.
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Tat-LK15运载nNOS siRNA治疗慢性炎性疼痛的实验研究
目的：慢性疼痛如炎性疼痛的基因治疗缺乏安全且高效的载体，本实验探讨了细胞穿透肽Tat-LK15介导siRNA 干扰大鼠脊髓背角 nNOS 表达进而治疗慢性炎性疼痛的可行性。方法：参照前期实验，检测鞘内注射 Tat-LK15／siRNA 对完全弗氏佐剂（ CFA ）炎性痛模型大鼠脊髓背角（ SCDH ） nNOS 蛋白表达的影响，并测定鞘内注射此复合物后炎性痛大鼠机械缩足反射阈值（ MWT ）及热缩足反射持续时间（ TWD ）的变化。结果：Tat-LK15／siRNA 注射后3 d ，炎性疼痛大鼠 SCDH nNOS 蛋白水平的表达下降51％（P ＜0．01），Tat-LK15／scRNA 注射后 nNOS 的表达无明显变化。 Tat-LK15／siRNA 鞘内注射后3、7、14及21d 炎性痛大鼠的 MWT 显著增高，TWD 显著缩短（P ＜0．01），Tat-LK15／scRNA 无此治疗作用。结论：Tat-LK15可有效运载 siRNA 抑制 CFA 所致慢性炎性痛大鼠 nNOS 的过度表达，从而对炎性疼痛大鼠具有治疗作用。
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WSLP运载siRNA抑制炎性疼痛大鼠脊髓背角NMDA受体1基因表达的可行性
目的:探讨低分子量聚乙烯亚胺(PEI)和胆固醇组成的水溶性脂聚体(WSLP)运载siRNA抑制炎性疼痛大鼠脊髓背角(SCDH) N-甲基-D-天冬氨酸受体功能亚基(NR1)基因表达的可行性及其对炎性疼痛大鼠机械性痛阈值的影响.方法:将WSLP直接与靶向NR1的siRNA连接形成WSLP/siRNA复合物,乱序siRNA作为对照(WSLP/scRNA)；然后分别检测鞘内注射WSLP/siRNA对炎性痛模型大鼠SCDH NR1转录水平及蛋白水平表达的影响,并且测定鞘内注射此复合物后炎性痛大鼠50％机械性痛阈值的变化.结果:WSLP/siRNA注射后3d,炎性疼痛大鼠SCDH NR1转录水平表达下降41％(P＜ 0.01),蛋白水平的表达相应下降58％(P＜0.01),WSLP/scRNA及PEI/siRNA注射后NR1转录水平及蛋白水平的表达无明显变化.WSLP/siRNA鞘内注射后3、7、14及21 d炎性痛大鼠的50％机械性痛阈值显著增高(P＜0.01),WSLP/scRNA及PEI/siRNA均无此作用.结论:WSLP可有效运载siRNA抑制慢性炎性痛大鼠NR1的过度表达,从而治疗炎性疼痛大鼠痛觉过敏.
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小鼠肝脏特异的微RNA在HeLa细胞中的转染与表达
目的观察miR-122在HeLa细胞内表达情况.方法将构建的miR-122真核表达质粒pAVU6+27-mir122以电穿孔法转染HeLa细胞,经G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,通过Northern杂交和点杂交验证miR-122在HeLa细胞中的表达.结果阳性转染细胞与小鼠肝脏细胞Northern杂交及斑点杂交均出现放射自显影,而转染空质粒的HeLa细胞则无放射显影.结论 miR-122在HeLa细胞中获得正确表达.
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小鼠肝脏特异的微RNA真核表达载体的构建及鉴定
目的利用分子克隆技术,构建微RNA(microRNA,miRNA)真核细胞载体.方法人工合成小鼠肝脏特异的微RNA(miR-122)前体基因序列,并添加酶切位点及polyT转录终止序列,经退火处理后形成双链结构,插入小干涉RNA(small interfering RNA,siRNA)表达载体pAVU6+27中,经酶切鉴定和测序证实后,构建成为miR-122真核表达载体(pAVU6+27-mir122).结果合成的基因序列完全正确并成功克隆到真核表达载体pAVU6+27上.结论 miR-122真核表达载体的构建,为进行真核细胞转染及miR-122表达的研究奠定了基础.
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多发性骨髓瘤特异的APE1siRNA在KM3细胞中的转染与表达
目的观察APE1siRNA在KM3细胞内表达情况.方法将构建的MM特异APE1siRNA表达质粒pSilecer K-IE-IgP APE1siRNA与eGFP以脂质体共转染KM3细胞,经G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,通过Western blot分析验证APE1siRNA在KM3细胞中的表达.结果 MM特异APE1siRNA表达质粒与eGFP共转染,转染效率约为38%～48%,且APE1siRNA转染细胞较对照组能有效敲除APE1基因表达.结论 APE1siRNA在KM3细胞中获得正确表达.
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腺病毒介导的RNA干涉对乳腺癌SKBR3细胞HER2的下调及生长抑制效应
目的:探讨采用腺病毒做为载体介导基于RNA干涉的针对高HER2肿瘤的基因治疗的可能性.方法:构建HER2-绿色荧光蛋白融合蛋白表达质粒pHER2-GFP,并与9种针对HER2不同靶序列的siRNA表达质粒分别共转染CHO-K1细胞, 根据荧光蛋白表达量从中筛选出沉默效率高的质粒.将筛选出的质粒转染HER2高表达乳腺癌SKBR3细胞,检测它们对HER2表达的影响.随后, 将siRNA转录单元克隆入腺病毒载体, 成功包装病毒后感染SKBR3细胞, 再次测定其下调HER2的效应及其对细胞生长的影响.结果:2种有效下调HER2表达的质粒被筛选出来.将此2种质粒所含siRNA转录单元包装入腺病毒后仍然保持了原有的基因沉默效应.HER2下调增加了SKBR3细胞中G1期细胞的比例,并且诱导部分细胞凋亡.MTT和细胞长期增殖抑制实验表明腺病毒介导的RNA干涉抑制了SKBR3细胞生长.结论:重组腺病毒介导的RNA干涉能够下调HER2的表达并且对高表达HER2的乳腺癌细胞有生长抑制作用.
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针对MAGE-1基因RNAi在恶性胶质瘤SHG-44细胞中的作用研究
目的构建抑制黑色素瘤抗原-1(MAGE-1)的siRNA表达载体,鉴定其在人恶性胶质瘤细胞系SHG-44细胞中对MAGE-1基因表达的干涉作用.方法化学合成2对编码短发夹RNA序列的靶向MAGE-1基因寡核苷酸链,克隆到经BglⅡ、HindⅢ双酶切的pSUPER载体上,重组构建RNA干涉 (RNAi)质粒载体.利用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)、流式细胞术和荧光显微镜,检测经稳定转染后SHG-44细胞中MAGE-1的表达,以了解siRNA的干扰效果. 结果重组构建的pSUPER-MAGE-1载体经双酶切电泳及插入基因片段序列分析,表明寡核苷酸链成功插入到预计位点,并且序列与预期完全一致.稳定转染后G418筛选出的SHG-44多克隆细胞MAGE-1的表达经RT-PCR、流式细胞术和荧光显微镜检测,2对siRNA均有较明显的干涉作用. 结论成功构建了针对MAGE-1基因的siRNA表达载体,抑制SHG-44细胞中的MAGE-1分子的表达.
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LMP1基因沉默对EBV阳性上皮细胞凋亡和增殖影响
目的 探讨化学合成小干涉RNA(siRNA)对Epstein-Barr病毒(EBV)潜伏膜蛋白1(LMP1)阳性胃上皮(GT38)细胞LMP1编码基因表达的抑制作用,以及对细胞增殖和凋亡的影响.方法 化学合成靶向LMP1 mRNA不同位点的3对siRNA,分别转染GT38细胞,选择干扰效果佳的siRNA进行实验研究,行RT-PCR、Hochest 33258荧光染色及流式细胞术分析.结果 RT-PCR结果显示,3对靶向LMP1的siRNA均能抑制GT38细胞LMP1的转录表达,以靶向LMP1 mRNA 649位点的siRNA作用效果强.Hochest 33258荧光染色可见siRNA649作用后的GT38细胞发生凋亡.流式细胞分析显示,siRNA649作用24、72以及120 h后的细胞其细胞周期无明显改变.RT-PCR检测结果表明,转染siRNA649的靶细胞Bcl-2的表达水平降低.结论 靶向LMP1的特异性siRNA可以有效抑制LMP1的转录表达,进而可能通过抑制Bcl-2的表达诱导靶细胞凋亡.GT38细胞系可作为研究LMP1生物活性及其在EBV相关肿瘤发生中所起作用的理想的靶细胞.
关键词： Epstein-Barr病毒 潜伏膜蛋白1 RNA干扰 小干涉RNA 细胞凋亡
