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苯对C3H/He小鼠骨髓细胞转录组表达的影响:基于转录组测序技术
[目的]应用转录组测序(RNA sequencing,RNA-seq)技术,研究苯对小鼠骨髓细胞转录组表达和信号通路的影响,为苯对小鼠骨髓细胞毒性的可能作用机制提供科学线索.[方法]将C3H/He小鼠随机分为苯暴露组[160mg/(kg·d)]与对照组[0mg/(kg·d)],每组10只,以皮下注射的方式染毒,每周5次,连续4周.分离小鼠的骨髓细胞,应用RNA-seq技术对苯暴露和对照组小鼠的骨髓细胞进行转录组测序,并对测序结果进行基因差异表达、基因功能与信号通路富集以及基因共表达分析.[结果] RNA-seq结果显示,苯染毒后共有227个基因的表达发生明显变化,其中122个基因下调,105个基因上调.基因功能与信号通路富集分析结果显示,这些差异基因主要富集在免疫、凋亡、代谢、氧化应激、造血谱系等功能和通路上.差异基因共表达分析显示,调控度大于10的基因有14个,其中Ccr9、Xafl、Flt3、Cd72分别是细胞免疫、细胞凋亡、造血细胞谱系、造血细胞分化等通路上的重要基因.[结论]苯暴露可导致小鼠骨髓细胞基因表达谱发生变化,可引起小鼠骨髓细胞免疫、凋亡、代谢、氧化应激、造血谱系等功能与通路发生变化,其中Ccr9、Xaf1、Flt3、Cd72可能起关键性调控作用.
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斑蝥素酸镁对人肝癌细胞株SMMC-7721转录组的影响
目的 通过RNA-seq分析斑蝥素酸镁对肝癌细胞转录组的影响,为阐明斑蝥素酸镁对肝癌细胞增殖的抑制效应提供分子信息,以期为临床上利用斑蝥素酸镁治疗肝癌提供相关理论基础.方法 体外培养的肝癌细胞株SMMC-7721,用不同浓度(0、0.895、1.790、2.685 μmol/L)的斑蝥素酸镁干预48 h后,利用MTT检测细胞抑制率;采用illumina Hiseq2500测序平台对1.790μmol/L处理组和对照组(0μmol/L)进行RNA-seq分析;根据RNA-seq结果,利用qRT-PCR检测了磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)等基因的表达水平.结果 不同浓度(0.895、1.790、2.685 μmol/L)的斑蝥素酸镁干预48 h后,与对照组(0μmol/L)比较,均能显著抑制SMMC-7721细胞增殖(t=33.48、90.30、151.01,P＜0.01).通过RNA-seq分析,斑蝥素酸镁干预后,共导致150个基因表达发生显著变化,82个基因显著下调(P＜0.01),68个基因显著上调(P＜0.01),这些差异基因涉及Ribosome、Hippo signaling pathway、MAPK signaling pathway、PI3K signaling pathway、mTOR signaling path-way等通路,影响肝癌细胞的增殖、代谢及凋亡;通过qRT-PCR检测,1.790 μmol/L斑蝥素酸镁能够显著降低PI3K、Akt及ERK1/2的转录水平,抑制细胞增殖.结论 通过RNA-seq检测及分析,PI3K、AKT和ERK信号通路的抑制可能在斑蝥素酸镁抑制肝癌细胞增殖中发挥作用.
关键词： 斑蝥素酸镁 肝癌细胞SMMC-7721 转录组 差异表达基因 RNA-seq -
应用生物信息学方法识别卵巢癌重要基因
目的:上皮细胞卵巢癌是目前常见的妇科恶性肿瘤之一,其发病率每年都在升高.本次研究识别的重要基因能够预测上皮细胞卵巢癌患者的预后,阐释上皮细胞卵巢癌的发病机制.方法:本研究利用4对上皮细胞卵巢癌及其癌旁正常组织的转录组测序(RNA-Seq)数据进行差异基因的筛选,并应用Gene Ontology (GO)进行富集分析,在TCGA(The Cancer Genome Atlas)在线数据库中进行预后评估.结果:识别865个差异表达基因,通过功能注释识别13个有意义的GO类型,包括转录调控(regulation of transcription)、细胞黏附(cell adhesion)和生物黏附(biological adhesion).结合卵巢癌TCGA在线数据库,发现2个重要基因(FBXO5和CTNNB1)在高表达时,不利于上皮细胞卵巢癌患者的生存;并且在独立的另外20对上皮细胞卵巢癌及其癌旁正常组织的样本中,采用PCR证实了这2个基因的差异表达情况.结论:本研究识别出的重要基因有助于更好地了解上皮细胞卵巢癌的发生和发展机制,可能成为预后判断的生物标志物.
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基于多维蛋白质组学的孤儿受体NR2F2功能研究
目的 采用多维蛋白质组学对孤儿受体NR2F2 (chicken ovalbumin upstream promoter transcription factorⅡ)进行系统生物学的功能探索.方法 在肺癌细胞系A549中构建NR2F2过表达的稳定株,通过转录因子快速鉴定模型(catTFREontips,TOT)、RNA-seq和全蛋白质谱(protein profiling-MS)等方法寻找NR2F2调控的转录因子(transcription factors,TFs)及其下游靶基因(target genes,TGs),通过对这些TFs和TGs的GO/KEGG功能分析,研究NR2F2的功能.通过实时定量PCR (real time quantitative PCR,RT-qPCR)和Western blot验证上述NR2F2下游靶基因.结果 多维蛋白质组学数据的整合分析表明,NR2F2能够上调免疫调控相关的转录因子活性,同时下调TGF-β信号通路相关转录因子如SMAD2/3/4/5,以及细胞周期相关转录因子的转录活性.对全蛋白质谱和RNA-seq数据的功能聚类分析表明,NR2F2能够促进NF-κB等免疫相关通路的上调,抑制细胞周期信号通路;细胞周期相关的蛋白质CCND3 (cyclinD3)、CCNA (cyclinA)、CDKN1A (P21)和TP53均受到显著的负调控.结论 NR2F2对免疫信号通路和细胞周期信号通路起一定的调控作用;采用多维蛋白质组学和生物信息学相结合的手段能够快速明确探索一个功能不清晰的分子.
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金线莲转录组测序及其黄酮类合成相关基因分析
首次采用RNA-seq高通量测序技术对不同种植时期的金线莲进行转录组测序,并通过Q-PCR和HPLC对其结果进行验证和分析.转录组测序共获得金线莲51370条基因,并注释到Nr、GO、Swiss-Prot、KEGG和KOG数据库,根据同源序列比对,与油棕和海枣的同源性高.通过比较不同生长时间的金线莲转录组,分析其差异基因主要集中在黄酮类生物合成相关基因,运用Q-PCR对6个黄酮类生物合成相关基因(反式肉桂酸4-单加氧酶、咖啡酰辅酶A O-甲基转移酶、查尔酮合成酶、黄酮醇合成酶、莽草酸O-羟基肉桂酰转移酶、黄酮类3′,5′-羟化酶)表达量进行验证;并结合HPLC对相应的金线莲样品中6种主要黄酮类成分(芦丁、异槲皮苷、水仙苷、槲皮素、山柰酚和异鼠李素)进行含量测定.结果表明6种主要黄酮类成分含量随着金线莲黄酮类合成基因的表达量的升高而增加,并结合转录组数据,绘制出金线莲中黄酮类成分的生物合成途径.此研究为金线莲黄酮合成关键基因及黄酮类成分生物合成提供重要的遗传信息,同时为其药用价值开发提供依据.
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中枢神经系统退行性病变研究中RNA-seq技术的应用
RNA测序技术(RNA-seq)作为近年兴起的研究方法,已被应用于各种疾病的研究,尤其在二代测序(NGS)技术引进后,RNA-seq在中枢神经系统(CNS)研究中的应用也日益受到关注.文章就RNA-seq的发展及其在一些中枢神经系统退行性病变中的研究进行综述.主要以帕金森病、阿尔兹海默症及亨廷顿氏病为例介绍基于RNA-seq的转录组学研究在中枢神经系统疾病中的应用,同时对其在预测中枢神经系统疾病药物治疗靶点研究的前景进行展望.
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ANLN和FBXO5基因在肺鳞状细胞癌中的表达量及预后影响
目的 肺鳞状细胞癌是目前常见的恶性肿瘤之一,其发病率每年都在升高.本次研究识别的重要基因能够预测肺鳞状细胞癌患者的预后,阐释肺鳞状细胞癌的发病机理.方法 本研究用4对肺鳞状细胞癌以及匹配的正常组织实施转录组测序(RNA-Seq),筛选差异表达的基因,并实施基因功能分析和预后评估.结果 共识别了821个差异表达的基因,并发现12个有显著富集的功能类型,包括Cell adhesion、Reg-ulation of transcription,Biological adhesion等.结合肺癌The Cancer Genome Atlas(TCGA)数据库发现了两个重要基因(FBXO5和ANLN),ANLN低表达或FBXO5高表达时能够显著降低肺鳞状细胞癌患者的生存情况,并且在独立的20对样本中通过PCR证实两个基因存在差异表达.结论 此次研究识别的重要基因能够使我们更好地理解肺鳞状细胞癌的发展机理,也许能作为预后诊断的生物学标记.
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SRSF1基因在非小细胞肺癌中的表达及其对预后的影响
目的 非小细胞肺癌是目前常见的恶性肿瘤之一,其发病率逐年升高.本次研究识别的重要基因能够预测非小细胞肺癌患者的预后,阐释其发病机理.方法 本研究利用9对非小细胞肺癌以及匹配的正常组织实施转录组测序(RNA-Seq),筛选差异表达的基因,并对基因功能和预后进行评估.结果 共识别了821个差异表达的基因,并发现12个显著富集的功能类型,包括Cell adhesion、Regulation of transcription,Biological adhesion等.结合非小细胞肺癌The Cancer Genome Atlas(TCGA)数据库鉴定到一个重要基因(SRSF1),SFSR1高表达非小细胞肺癌患者的生存时间显著缩短,并且在独立的20对样本中通过PCR证实该基因存在差异表达.结论 SFSR1基因在非小细胞肺癌有高表达,与患者的预后有关.
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RNA-Seq技术在白念珠菌致病机理研究中的应用
本文介绍了白念珠菌及其所致疾病的特点,阐述了白念珠菌致病机制的复杂性和转录组测序(RNA-Seq)技术的优势,回顾了RNA-Seq技术在白念珠菌致病机理研究中的应用情况,分析了以往研究中存在的不足,展望了此类研究未来的可能发展趋势.总之,RNA-Seq技术的不断改进并用于白念珠菌致病机理的深入研究将会带来令人瞩目的成就.
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基于 RNA-Seq 的羊种布鲁氏菌新转录本与非编码 RNA 鉴定
目的：对羊种布鲁氏菌的转录本进行测序，鉴定基因组中新的转录本和非编码RN A。方法提取羊布鲁氏菌的总RNA ，去除rRNA后连接接头逆转录成cDNA ，PCR扩增后进行测序，以羊布鲁氏菌16M的基因组序列为参照对测序得到的reads进行比对作图，通过生物信息学方法进行新转录本和非编码RN A的鉴定。结果测序数据分析显示，reads在基因组上覆盖度较好。与现有注释基因相比，有773个基因的5′或3′端在基因组的原有位置基础上发生了延伸，并发现了16个新的转录本。根据测序结果，共鉴定出241条候选的非编码RNA （sRNA ），进一步的RT‐PCR验证结果显示，预测的sRNA在体外条件下有表达。结论布鲁氏菌基因组中存在除了预测以外的新的转录本，布鲁氏菌中存在非编码RN A且在不同条件下有差异表达。
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基于RNA-seq技术的宫颈癌与癌旁组织差异表达基因分析
目的 探讨宫颈癌的发病机制.方法 应用RNA-seq技术分析3对宫颈癌及癌旁组织转录组,利用生物信息方法对差异基因进行基因本体(GO)分析和通路富集性分析.结果 在宫颈癌组织中发现1755个差异表达基因,其中758个基因表达上调,997个基因表达下调.功能富集分析表明,差异基因富集于细胞粘附、DNA损伤有关的信号通路上.且宫颈癌组织中发现RAB22A-BCAS1等融合基因.结论 细胞粘附信号通路、RAB22A-BCAS1融合基因可能与宫颈癌的发生机制有关.
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miR-424和miR-503对人直肠癌细胞系增殖的影响
目的 探讨miR-424和miR-503对人直肠癌细胞株SW620和SW480细胞增殖的影响,并筛选其靶基因.方法 直肠癌细胞株SW620和SW480分为SW480组、SW480 miR-424组、SW480-miR-503组、SW620组、SW620-miR-424组、SW620-miR-503组;SW480组和SW620组细胞正常培养,SW480-miR 424组、SW480 miR-503组、SW620-miR-424组和SW620-miR-503组细胞分别采用慢病毒载体pSLIK-Zeo构建miR-424和miR-503直肠癌细胞系;SW620细胞系各组于不同培养时间进行细胞计数并绘制细胞生长曲线;采用荧光定量PCR法检测SW480组、SW620组细胞中miR-424和miR-503表达水平;采用RNA-seq法筛选miR-424和miR-503的靶基因,并采用Western blot对靶基因进行验证.结果 miR-424和miR-503在SW480细胞中呈高表达,在SW620细胞中呈低表达;SW480组miR-424-3p(9.572±2.171)、miR-424-5p(13.891±1.124)和miR-503(6.792±1.412)表达水平高于SW620组(1.026±2.874、1.103±0.411、0.984±0.847),差异有统计学意义(P＜0.01);各时间点SW620-miR-424组和SW620-miR-503组细胞数量均少于SW620组(P＜0.01),SW620 miR-503组少于SW620-miR-424组(P＜0.01);RNA-seq测序分析结果显示,SW620和SW480细胞共有1 413个差异表达基因,其中有50个肿瘤标志物,WEE1蛋白为极高表达者,miR-424和miR-503均可与WEE1的3'UTR序列结合,且miR-424的结合能力高于miR-503;SW620组细胞WEE1蛋白表达水平(8.69±3.24)高于SW480组(5.94±2.37) (P＜0.01),SW480-miR-424组和SW480-miR-503组细胞WEE1蛋白表达水平(2.19±1.72、3.45±2.16)明显低于SW480组(P＜0.01),SW620-miR 424组和SW620-miR-503组细胞WEE1蛋白表达水平(4.31±2.63、5.37±3.25)明显低于SW620组(P＜0.01).结论 miR-424和miR-503抑制细胞周期检查点激酶WEE1的表达,进而调节细胞的增殖能力,参与肿瘤发生、发展过程.
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基于RNA-seq的杜氏盐藻全转录组测序与分析
目的:利用RNA-seq技术对杜氏盐藻细胞的全部转录本进行测序、功能分析.方法:提取杜氏盐藻总RNA,反转录得cDNA,在Illumina平台上进行测序,经拼接、组装、聚类后获得全部unigene,并将所得unigene与数据库比对,对其进行功能注释和分类.结果与结论:共得到197 295个unigene,将获得的unigene与NR、SWISS-PROT、CDD、KEGG和TREMBI数据库进行比对,有89 800个unigene获得注释.其中95 767个unigene映射到GO的不同功能节点;5 710个unigene获得COG注释,并分为22个功能分类;9 497个unigene获得了KEGG注释,映射到282条信号通路.所得杜氏盐藻的转录组信息为今后相关研究与应用提供了丰富的资源和线索.
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基于RNA-seq分析黄曲霉毒素B1诱导大鼠肝癌的可变剪接事件
目的 探讨黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)诱发大鼠致肝癌的可能机制及其阻断肝癌分子机制的可变剪接事件.方法 构建AFB1诱发大鼠致肝癌模型,提取大鼠肝组织总RNA,采用Illumina HiSeq 2000测序平台对大鼠肝组织进行RNA-seq测序,以大鼠基因组数据为参考,纳入目前已知的具有多种可变剪接存在的332个参考基因,鉴定和分析大鼠基因组的可变剪接基因,并对具有差异表达的可变剪接基因进行GO分类的生物过程(biological process,BP)富集分析.结果 RNA-seq测序结果显示,未成癌组与对照组有18个基因的可变剪接模式存在较大差异,差异基因主要富集在刺激反应功能上;成癌组与对照组有37个基因的可变剪接模式存在差异,差异基因主要富集在刺激反应和细胞增殖调节功能上;成癌组与未成癌组有32个基因的可变剪接模式存在明显差异,差异基因主要富集在细胞增殖调节功能上.成癌组发现7个与细胞增殖调节相关基因的可变剪接模式发生异常,其中成癌组、未成癌组和对照组IgfI、Carm1、Tcfe2a基因的可变剪接模式存在显著差异.结论 IgfI、Carm1、Tcfe2a基因的可变剪接改变可能在AFB1诱导大鼠肝癌形成过程中发挥重要作用.
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犀角地黄汤对脓毒症大鼠脾脏组织基因表达的影响
目的 采用RNA-seq技术检测犀角地黄汤干预后脓毒症大鼠脾脏组织基因的表达变化,从基因水平探究其可能的作用机制.方法 将45只清洁级健康雄性Wistar大鼠采用随机数字表法等分为对照组、脓毒症组、犀角地黄汤干预组.脓毒症组采用盲肠结扎穿孔术(CLP)进行建模.犀角地黄汤干预组大鼠除了CLP外,并于术前2天给予中药胃饲(胃饲量即浓煎剂总ml数/60×6.25×2),每天2次,于每天上、下午各给药1次;术后连续胃饲2天.对照组仅行开腹、关腹,不予盲肠结扎穿孔.3组术毕均肌肉注射平衡液5 ml/kg;术后24 h取脾组织提取RNA后采用RNA-seq进行基因检测,应用计算机软件分析比较3组大鼠脾组织基因表达的变化及涉及的相关通路.结果 大鼠建模后24 h,相对于对照组,脓毒症大鼠脾脏组织基因表达上调数为1030个,下调数为935个;犀角地黄汤干预组大鼠脾脏组织基因表达上调数为972个,下调数为1149个.犀角地黄汤干预组大鼠基因改变涉及的通路有Th17细胞分化相关通路、TNF信号传导相关通路、IL-17信号传导相关通路、细胞因子-细胞因子相互作用相关通路.结论 犀角地黄汤可能主要通过调节T h17细胞分化相关通路、T N F信号传导相关通路、IL-17信号传导相关通路、细胞因子-细胞因子相互作用相关通路的信号表达,进而缓解脓毒症大鼠的炎症反应.
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通过RNA-seq初步考察铜绿假单胞菌噬菌体PaP3对宿主转录组的全局性调控
目的 定性定量地考察铜绿假单胞菌噬菌体PaP3在感染宿主菌PA3后对宿主转录组的全局性调控作用.方法 利用高通量链特异性的RNA-seq对PaP3感染宿主菌PA3后5个时间点(5 min、10 min、20 min,30 min、80 min)的转录本进行深度测序,并以铜绿假单胞菌PAO1株及噬菌体PaP3基因组序列为参照,通过生物信息学对检测数据做定性定量的分析.结果 以未感染噬菌体的细菌为对照,在铜绿假单胞菌PA3被噬菌体PaP3感染后的不同时间点共检测到5 536个差异表达基因,共归属于27条PseudoCAP功能注释,KEGG Pathway显著性富集分析发现差异表达基因共涉及45条代谢路径.此外,在5个样本中还预测出1 438个新转录本及1 329个新的候选sRNA,发现19种已注释的sRNA及91种新的候选sRNA出现差异表达.结论 噬菌体PaP3可能通过抑制宿主菌PA3转录调节相关基因而对宿主的转录组进行全局性的调控,这为深入理解噬菌体与宿主相互作用的机制奠定了基础,也为探索噬菌体通过细菌与人体免疫系统的相互作用提供了多方面多层次的信息.
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小鼠出生后嗅球发育的基因表达差异及其特征分析
目的:通过研究小鼠嗅球全基因表达差异来寻找嗅球生后发育基因变化及其特征,为嗅球发育及相关研究提供参考依据.方法:分别取新生及成年野生型小鼠完整嗅球并独立进行RNA-seq分析,对全基因测序结果进行差异表达分析并通过检测成年与新生小鼠嗅球中差异表达基因(DEGs),利用Gene Ontology、DAVID及KEGG等数据库,结合qPCR的实验方法对部分差异表达基因进行验证,进一步分析差异表达基因在生物学上的影响.结果:成年小鼠和新生小鼠嗅球存在大量差异表达基因,其中Tfap2e,Neurod6和Tbr1等基因表达下调,同时Zfp365,Elt4以及Omp等基因表达上调,DEGs参与多种信号通路.结论:小鼠嗅球在出生后仍然处于不断发育的过程当中,这些差异表达基因主要影响细胞内代谢,细胞的分裂、分化、成熟及细胞间信号传递.
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先天性纯红细胞再生障碍性贫血斑马鱼模型相关microRNA的组学研究
目的：探讨先天性纯红细胞再生障碍性贫血（DBA）相关 microRNA 的表达特征及其调控机制。方法利用 morpholino 技术建立核糖体蛋白基因 Rps19表达不足的 DBA 斑马鱼模型和Rps19与 p53同时表达不足的斑马鱼模型，利用新一代高通量测序（RNA-seq）技术，研究 DBA 斑马鱼模型的 microRNA 表达谱的特征及 p53在其中的调控作用。结果Rps19 MO 的斑马鱼胚胎的循环血细胞明显减少，且尾部呈现出向腹侧弯曲的异常形态。而在 p53敲低之后，斑马鱼的形态异常得到了一定程度的恢复。通过对 microRNA 表达谱的比较分析发现，在 Rps19不足的斑马鱼胚胎中约1/4的 microRNA 表达量显著偏低，这些异常表达的 microRNA 可能影响到斑马鱼的正常发育过程。而在 p53敲低之后，部分 microRNA 的表达恢复到正常水平。终确定了47个在 DBA 发病过程中可能受 p53调控的 microRNA。结论DBA 斑马鱼模型的 microRNA 普遍低表达，其中部分 microRNA 受到 p53的表达水平的调控。
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RNA-Seq在老年神经退行性疾病研究中的应用
阿尔茨海默病及帕金森病是老年人常见的两种神经退行性疾病,但其发病机制及治疗是研究的热点.随着高通量测序技术的进步及成本的下降,RNA-Seq也成为神经退行性疾病机制研究及生物标志物发现的有力手段.RNA-Seq相对于microarray具有高灵敏度、高准确性、高重复性以及噪声低等优势,在阿尔茨海默病及帕金森病研究中有较为广泛的应用,包括检测差异表达基因,可变剪接、新长链非编码RNA预测分析和miRNAs调控等,但是容易受病理复杂性及样本等因素影响.目前阿尔茨海默病及帕金森病转录组研究相比于癌症等还不够深入,在临床诊断及治疗应用还面临较大挑战.但是随着新技术及新方法 的发展,RNA-Seq将进一步推动神经退行性相关疾病的研究和临床转化.
