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类鼻疽伯克霍尔德菌sRNA伴侣蛋白Hfq的表达与纯化
目的 构建重组原核表达质粒,对类鼻疽伯克霍尔德菌分子伴侣Hfq蛋白进行高效表达和纯化. 方法 PCR扩增类鼻疽伯克霍尔德菌hfq基因并克隆至pMD19-T克隆载体中,测序验证后,用Nde I和Xho I双酶切pMD19T-hfq与pET30a(+),将目的基因片段插入含His标签序列的原核表达载体PET30a(+)中,构建重组表达质粒pET30a(+)-hfq,并转化至大肠埃希菌BL21 (DE3),IPTG诱导目的基因表达,采用SDS-PAGE与Western blot对表达蛋白进行鉴定,通过Ni2+螯合柱对目的蛋白进行纯化. 结果 PCR扩增出正确的hfq基因片段,大小为237 bp,与预期值相符.亚克隆质粒与原核表达质粒载体连接后进行双酶切鉴定,重组质粒pET30a(+)-hfq构建正确.重组质粒转化DE3后经IPTG诱导5h,从细菌裂解液中检测到Hfq融合蛋白,分子质量单位(Mr)约为9.4×103.通过Ni2+螯合柱纯化,获得单一SDS-PAGE条带的目的蛋白. 结论 hfq基因原核表达质粒构建成功,Hfq在大肠埃希菌中成功表达,得到Ni2+柱层析获得的高纯度的sRNA伴侣蛋白Hfq,为进一步筛选与该蛋白有相互作用的sRNA及sRNA功能研究奠定了基础.
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细菌sRNA的结构和作用机制及生物学功能
细菌非编码小RNA(sRNA)是一类长度约为50~500个核苷酸,在细菌基因组中被转录但不翻译为蛋白质的RNA分子.sRNA开始于一段能折叠成稳定茎环结构的序列,终止于不依赖Rho的转录终止子.sRNA活力主要受控于其胞内的水平.sRNA通过感应外界环境条件变化,参与转录后基因的表达调控,影响和调节细菌的多种生理功能,包括物质代谢、群体感应、生物膜形成、外膜蛋白形成、质粒复制、致病力、耐药性和应激反应等.本文从细菌sRNA的概念、结构特征、分类、作用机制、作用特点及生物学功能等方面进行阐述.
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大肠杆菌基因组水平蛋白质-RNA相互作用初步研究
目的：初步研究大肠杆菌中基因组水平的蛋白质-RNA相互作用（ protein-RNA interactions，PRI）。方法通过RNA酶消化细菌裂解液，提取与蛋白质相互作用的RNA片段，构建cDNA文库，进行高通量测序，并通过生物信息学分析获得与蛋白质结合的转录本。结果获得了与蛋白质结合的3193条转录本，涉及2234个mRNA、47个sRNA（small regulatory RNAs）、39个tRNA、11个rRNA以及862个基因间区（intergenic region， IGR）。结论初步获得大肠杆菌中与蛋白质相互作用的转录本信息，为进一步开展PRI研究提供了支持。
关键词： 蛋白质-RNA相互作用 sRNA 大肠杆菌 MCA -
链霉素对结核分枝杆菌sRNA表达影响的研究
目的：研究链霉素对结核分枝杆菌非编码sRNA表达量的影响，探讨sRNA是否参与细菌与药物的相互作用。方法基于结核分枝杆菌标准菌株H37Rv的高通量测序结果，选出表达量估计值较高的4个sRNA作为研究对象，根据链霉素的小抑菌浓度（MIC）对标准菌株H37Rv进行不同浓度和不同时间的链霉素诱导，提取各组菌液的总RNA，通过实时定量逆转录聚合酶链反应（ qRT－PCR）检测4种sRNA在各组中的表达量，比较不同抑菌浓度和不同时间的链霉素作用下sRNA的表达量差异。结果当链霉素浓度在1／2MIC时对结核分枝杆菌的生长产生明显抑制作用；在4种sRNA中，MTS2823表达量高，F6表达量相对较低；MTS1338在4MIC浓度的链霉素处理18 h即出现表达上调；在4MIC浓度链霉素作用6 d后，MTS1338和mcr11表达量分别出现（4．80±1．14）倍和（2．91±0．86）倍上调，而MTS2823表达下调。在各组药物处理组中F6表达量的变化均不明显。结论链霉素对结核分枝杆菌sRNA的表达可产生促进或抑制作用，提示sRNA可对某些基因进行转录后调控，促进或拮抗链霉素对结核分枝杆菌的作用。
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细菌sRNA伴侣蛋白Hfq的研究进展
细菌sRNA能调节不同的功能,从结构调节到催化作用,影响生物体中各种各样的加工过程,包括RNA加工,mRNA稳定性,翻译,蛋白质稳定性和蛋白质分泌.小RNA(sRNA)通过多种机制发挥作用,其中许多需要RNA伴侣蛋白Hfq辅助.它们通过与靶RNA结合而参与到不同的RNA反应中.本文对sRNA伴侣蛋白Hfq的作用机制进行了综述.
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基于SVM方法构建细菌sRNA靶标预测模型
目的:为实验方法鉴定细菌sRNA靶标和研究sRNA功能提供生物信息学支持.方法:首先以实验证实的132个sRNA与靶标相互作用数据为训练集,其中包含46个阳性数据和86个阴性数据;其次,以实验证实的22个阳性数据和随机生成的1 700个阴性数据为测试集;后以RNA二级结构谱等特征为变量,运用支持向量机(SVM)方法构建sRNA靶标预测数学模型.结果和结论:构建的模型对训练集的敏感性和特异性均为100%,对测试集的敏感性和特异性分别为72.73%和80.65%.所构建的数学模型为实验发现sRNA靶标提供了生物信息学支持.
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灵猫方对HepG2.2.15和HepAD38细胞La蛋白表达的影响
目的 研究灵猫方对HepG2.2.15和HepAD38细胞cccDNA、pgRNA、sRNA和La-mRNA抑制作用,探讨灵猫方抗乙肝病毒(HBV)的作用机制.方法 制备灵猫方水提物,500 mg/L和1 000 mg/L灵猫方水提物分别干预HepG2.2.15和HepAD38细胞,以0.9％ NaCl溶液作为空白对照组,6d后收集培养液上清,ELISA法检测HBsAg和HBeAg水平;收集细胞提取总RNA,RT-PCR法检测细胞内cccDNA、pgRNA、sRNA和La mRNA表达水平.结果 与空白对照组比较,灵猫方组的HepG2.2.15和HepAD38细胞的HBsAg和HBeAg分泌水平明显降低,细胞内cccDNA、pgRNA、sRNA和La mRNA表达水平明显降低(P≤ 0.01).结论 灵猫方可能通过抑制HepG2.2.15和HepAD38细胞内La蛋白的表达而促进pgRNA、sRNA和cccDNA的降解,从而抑制HBV的复制.
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伤寒沙门菌sRNA S2959增强细菌动力和生物膜形成能力
目的 研究伤寒沙门菌小RNA(sRNA)S2959对细菌动力以及生物膜形成能力的影响.方法 利用Red重组系统制备伤寒沙门菌sRNA S2959缺陷株(△S2959),同时制备sRNA S2959缺陷株的空载体株(△S2959-pBAD)和回补株(△S2959-pS2959)等相关菌株.通过sRNA S2959缺陷株和野生株的生长曲线实验观察sRNA S2959缺失后对细菌生长的影响;通过细菌sRNA S2959缺陷株、空载体株、回补株的泳动能力实验和生物膜实验观察sRNA S2959对细菌动力以及生物膜形成能力的影响;再用定量PCR(qPCR)方法检测细菌鞭毛相关基因在sRNA S2959相关菌株中的表达水平.结果 成功制备sRNA S2959缺陷株和回补株;sRNA S2959缺陷株和野生株在LB和TSB液体培养基中的生长曲线无明显差异;与野生株相比,sRNA S2959缺陷株的泳动能力和生物膜形成能力下调(P<0.05),而回补株的泳动能力和生物膜形成能力较缺陷株显著增加(P<0.05);qPCR结果显示,高表达sRNA S2959后,细菌鞭毛相关基因(flhD、fliA和fljB)的mRNA水平分别上调大约4、3和6倍.结论 伤寒沙门菌sRNA S2959促进鞭毛的表达,进一步上调伤寒沙门菌动力以及生物膜的形成能力.
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一种改良的鉴定原核生物非编码RNA的方法
目的:构建一种鉴定原核生物非编码RNA(又称sRNA)的方法模型.方法:以鼠疫耶尔森菌为模型,基于非编码RNA的cDNA文库构建,改良RNA片段分离方法、获取全长RNA序列的RACE技术及rRNA去除方法,再应用RNA印迹法(Northern blot)对文库结果进行验证.结果:同目前常用的检测原核生物sRNA方法相比较,本改良方法更易于获得真实可信和全长的sRNA分子.结论:获得了一种较完整、片段覆盖范围较广的原核生物非编码RNA的鉴定方法.
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细菌sRNA功能、预测及鉴定方法的研究进展
生物体中除了mRNA、tRNA、rRNA三种我们熟知的RNA外,还存在大量的非编码RNA (non-coding RNA).它们隐藏于基因组内的信息层,有学者称之为基因组内“暗物质”,不可见却执行着新层次调控基因表达的功能[1].研究者在对非编码RNA的研究中发现了大量具有转录后调控功能的非编码小RNA,如MicroRNAs(miRNAs)、Small interfering RNAs(siRNAs)、Piwi-interacting RNAs (piRNAs)、ScanRNAs (scnRNAs)等.其中,长度40至500个核苷酸的非编码RNA通常定义为small RNA (sRNA).sRNA广泛存在于细菌、古生菌和真核生物体内.
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基于 RNA-Seq 的羊种布鲁氏菌新转录本与非编码 RNA 鉴定
目的：对羊种布鲁氏菌的转录本进行测序，鉴定基因组中新的转录本和非编码RN A。方法提取羊布鲁氏菌的总RNA ，去除rRNA后连接接头逆转录成cDNA ，PCR扩增后进行测序，以羊布鲁氏菌16M的基因组序列为参照对测序得到的reads进行比对作图，通过生物信息学方法进行新转录本和非编码RN A的鉴定。结果测序数据分析显示，reads在基因组上覆盖度较好。与现有注释基因相比，有773个基因的5′或3′端在基因组的原有位置基础上发生了延伸，并发现了16个新的转录本。根据测序结果，共鉴定出241条候选的非编码RNA （sRNA ），进一步的RT‐PCR验证结果显示，预测的sRNA在体外条件下有表达。结论布鲁氏菌基因组中存在除了预测以外的新的转录本，布鲁氏菌中存在非编码RN A且在不同条件下有差异表达。
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细菌sRNA与抗菌药物的药理作用及耐药性
非编码微小RNA即microRNA在细胞生长、增殖、分化、凋亡等生命过程中起重要的调控作用,几乎参与所有疾病的病理生理过程,为近年研究的热点课题。原核细胞也存在非编码RNA,称为小RNA ( small non-coding RNA,sRNA)。 sRNA作为一种应答元件,通过与靶mRNA碱基互补配对抑制靶基因mRNA翻译或(和)降解mRNA,在转录后水平调控细菌多种功能,影响细菌生长与繁殖[1,2]。虽然sRNA的发现(1967年)早于microRNA(1993年),但其功能研究却晚于后者。新近研究发现,细菌sRNA与抗菌药物的作用和耐药性密切相关。
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通过RNA-seq初步考察铜绿假单胞菌噬菌体PaP3对宿主转录组的全局性调控
目的 定性定量地考察铜绿假单胞菌噬菌体PaP3在感染宿主菌PA3后对宿主转录组的全局性调控作用.方法 利用高通量链特异性的RNA-seq对PaP3感染宿主菌PA3后5个时间点(5 min、10 min、20 min,30 min、80 min)的转录本进行深度测序,并以铜绿假单胞菌PAO1株及噬菌体PaP3基因组序列为参照,通过生物信息学对检测数据做定性定量的分析.结果 以未感染噬菌体的细菌为对照,在铜绿假单胞菌PA3被噬菌体PaP3感染后的不同时间点共检测到5 536个差异表达基因,共归属于27条PseudoCAP功能注释,KEGG Pathway显著性富集分析发现差异表达基因共涉及45条代谢路径.此外,在5个样本中还预测出1 438个新转录本及1 329个新的候选sRNA,发现19种已注释的sRNA及91种新的候选sRNA出现差异表达.结论 噬菌体PaP3可能通过抑制宿主菌PA3转录调节相关基因而对宿主的转录组进行全局性的调控,这为深入理解噬菌体与宿主相互作用的机制奠定了基础,也为探索噬菌体通过细菌与人体免疫系统的相互作用提供了多方面多层次的信息.
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大鼠软骨生成过程表达的小分子 RNA 生物信息学分析
目的：分析大鼠软骨形成过程中小分子 RNA(sRNA)表达谱变化及其基因功能,探讨软骨细胞增殖与分化的机制。方法取新生、断乳、性成熟3个时间节点的雌性 SD 大鼠股骨头软骨构建 sRNA 文库,Solexa 测序平台鉴定软骨组织全部 sRNA 序列表达,所得的全部清洁序列与 SD 大鼠基因组信息比对,并做生物信息学分析。结果3个文库筛选出与基因组序列完全匹配序列,分别对应着217921条(41.23%)、196650条(38.74%)、245436条(41.54%)unique sRNA 序列。长度为20~24 nt 的 sRNA 占比：d 0为71.94%、d 21为72.85%、d 42为86.39%；其中,长度为22 nt的 sRNA 约占清洁序列的一半。文库序列分布特征,符合高质量 sRNA 文库的特征。超过总数62%的清洁序列来自于成熟 miRNA 序列,但在3个文库中的占比却仅仅只有0.69%、0.78%和0.63%。约60%的unique sRNA 序列无法与 miRBase 20.0和 Rfam9.1匹配。结论3个 sRNA 文库的 miRNA 这种分布模式,可能暗示着有功能不同或者来源各异的 miRNA,参与了对骨骼发育和骨形成关键阶段软骨细胞增殖与分化的调控。
