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DC-CIK与CIK体外培养对包含HBV基因的HepAD38细胞的杀伤效果研究
目的:研究乙型肝炎病毒抗原致敏的树突状细胞(DC)和CIK细胞共同培养后对HepAD38细胞(含整合HBV基因组)的杀伤作用.方法:从乙肝患者外周血中提取外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),平均分为两组,研究组培养DC,培养DC第5天加入乙肝抗原并收获DC,然后加入CIK细胞,培养出DC-CIK细胞;对照组单独培养CIK细胞.两组在培养15 d后分别收获DC-CIK细胞与CIK细胞,同时作为效应细胞,把含有乙肝病毒的HepAD38细胞作为靶细胞,分别在5:1、10:1的效靶比时进行杀伤试验,使用LDH释放法测定杀伤活性,并用荧光扩增法检测杀伤试验后培养基内HBV-DNA水平.结果:研究组的DC-CIK细胞的5:1效靶比时的平均杀伤率为(54.4±6.3)%、10:1效靶比时的平均杀伤率为(71.5±4.5)%,均明显高于对照组CIK细胞的(42.4±3.0)%、(59.4±4.5)%,差异均有统计学意义(P<0.05).研究组的DC-CIK细胞5:1效靶比时的培养基内的HBV-DNA平均为(1.20±0.30)×106/mL、10:1效靶比时的培养基内的HBV-DNA平均为(1.64±0.60)×107/mL,均明显高于对照组CIK细胞的(0.90±0.23)×106/mL、(1.28±0.23)×107/mL,差异均有统计学意义(P<0.05).结论:CIK细胞与DC-CIK细胞对HepAD38细胞均具有杀伤效果,而且随着效靶比的升高,杀伤效果增强.同时,乙肝抗原致敏的DC诱导出的特异性CIK细胞(DC-CIK细胞),能够有效提高CIK细胞对乙肝病毒感染的HepAD38细胞的杀伤作用,其杀伤作用可能与DC被乙肝抗原致敏后诱导出特异性CIK,增强各自疗效有关.
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灵猫方对HepG2.2.15和HepAD38细胞La蛋白表达的影响
目的 研究灵猫方对HepG2.2.15和HepAD38细胞cccDNA、pgRNA、sRNA和La-mRNA抑制作用,探讨灵猫方抗乙肝病毒(HBV)的作用机制.方法 制备灵猫方水提物,500 mg/L和1 000 mg/L灵猫方水提物分别干预HepG2.2.15和HepAD38细胞,以0.9％ NaCl溶液作为空白对照组,6d后收集培养液上清,ELISA法检测HBsAg和HBeAg水平;收集细胞提取总RNA,RT-PCR法检测细胞内cccDNA、pgRNA、sRNA和La mRNA表达水平.结果 与空白对照组比较,灵猫方组的HepG2.2.15和HepAD38细胞的HBsAg和HBeAg分泌水平明显降低,细胞内cccDNA、pgRNA、sRNA和La mRNA表达水平明显降低(P≤ 0.01).结论 灵猫方可能通过抑制HepG2.2.15和HepAD38细胞内La蛋白的表达而促进pgRNA、sRNA和cccDNA的降解,从而抑制HBV的复制.
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顺铂通过CREB1诱导乙肝病毒再激活的实验研究
目的:探索顺铂诱导乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)再激活的机制.方法:将稳定表达HBV的肝癌细胞系Hep-AD38分为2组,即磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)对照组及顺铂(Cisplatin)处理组,分别检测cAMP应答元件结合蛋白质-1 (cAMP responsive element binding protein 1,CREB1)、乙肝病毒蛋白表达(·HBsAg、HBcAg)及病毒复制水平(HBVDNA、HBV mRNA);同样在成功构建稳定敲低CREB1 (shCREB1)的HepAD38细胞中,同正常表达HBV的肝癌细胞系Hep-AD38进行对照,检测经顺铂处理后的HBV复制水平(HBV DNA、HBV mRNA)及蛋白表达水平(HBsAg、HBcAg).结果:稳定表达HBV的肝癌细胞系HepAD38中,Western blot检测显示,与PBS对照组相比,Cisplatin处理组中CREB1相对表达量为1.355±0.049(P=0.010);HBsAg蛋白相对表达量为1.679±0.060(P=0.003);HBcAg蛋白相对表达量为1.488±0.047(P=0.005).qRT-PCR结果显示经顺铂处理后,HBV DNA绝对表达量为249.600±54.400(P=0.006);HBV mRNA相对表达量为3.084±0.256(P=0.000);以上结果表明在HepAD38细胞中乙肝病毒蛋白表达水平以及病毒复制水平较PBS对照组明显上调,均具有统计学差异;与此同时,选择转入shCREB1质粒的HepAD38细胞,即shCREB1细胞,以及转入对照质粒且能正常表达CREB1的Hep-AD38细胞,即shControl细胞,2种细胞组内均设置PBS对照组和Cisplatin处理组,分别检测乙肝病毒蛋白表达以及病毒复制水平.qRT-PCR结果显示,HBV DNA在shControl细胞的Cisplatin处理组相对表达量为518.300±3.458;而在shCREB1细胞的Cisplatin处理组相对表达量为265.300±3.125 (P=0.000);HBV mRNA在shControl细胞的Cisplatin处理组相对表达量为2.713±0.318;而在shCREB1细胞的Cisplatin处理组相对表达量为1.263±0.056(P=0.000).Western blot分析显示shControl细胞的Cisplatin处理组中的HBsAg、HBcAg相对表达量分别为1.254±0.001、2.238±0.041;而在shCREB1细胞的Cisplatin处理组中的HBsAg、HBcAg相对表达量分别为1.121±0.036(P=0.021)、1.681±0.015(P=0.000).结论:顺铂可以通过CREB1促进乙肝病毒复制水平以及蛋白表达水平上调.
关键词： cAMP应答元件结合蛋白质-1 乙肝病毒 HepAD38 顺铂
