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数字PCR在肿瘤基因突变检测中的应用
研究肿瘤的有效遗传特性和表观遗传改变需要高灵敏度和特异性的检测工具。然而，无论从灵敏度还是特异性上，传统的检测技术无法满足其所需水平。数字PCR（ dPCR）突破传统检测的瓶颈达到稀有突变检测中前所未有的准确性。其通过将一个样本分成百万到千万份，分配到不同反应单元且保证每一反应单元只包含一个目标分子的原理，得到绝对定量的数据。 dPCR结合商业化的微流控技术，这种基于微滴原理的dPCR逐渐成为检测癌症患者的重要工具，其应用范围从肿瘤异质性检测到患者体液检测，尤其适用于液体活检分析。（中华检验医学杂志，2016，39：150-153）
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基于PCR原理富集低丰度DNA突变的检测技术
检测生物样本中低丰度的DNA突变或微量等位基因,在癌症、产前诊断及传染病等领域都有很重要的应用价值.近年来发展起来的基于PCR原理富集低丰度DNA突变的常用实验技术,包括低变性温度下的复合PCR (COLD-PCR)、改良型完全富集COLD-PCR (ice-COLD-PCR)、温度耐受性PCR (TT-PCR)、肽核酸钳PCR (PNA-mediated PCR)、野生型阻滞扩增PCR (WTB-PCR)以及数字PCR(digital PCR)等,其基本原理、发展进程以及各自的优缺点各有不同.富集低丰度DNA突变的PCR技术在疾病检测中有一定应用价值.
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基于PCR的少量突变检测技术的应用
随着现代分子生物学和分子遗传学的发展,现代医学对少量突变的检测提出了更高的要求.近年来基于PCR原理相继发展了多种少量突变检测技术,包括扩增阻滞突变系统、PCR夹技术、焦磷酸解激活的聚合反应技术、低变性温度共扩增PCR技术、数字PCR技术等,这些技术已经或者必将使遗传病的分子诊断、肿瘤监测、无创性产前诊断等进入一个全新的阶段.现将此类技术的基本原理及优缺点综述如下,以期为该类技术的应用提供借鉴.
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非小细胞肺癌患者功能性驱动基因突变的临床意义
目的 探讨非小细胞肺癌(NSCLC)患者功能性驱动基因表皮生长因子受体(EGFR)、间变淋巴瘤激酶(ALK)、Kirsten鼠肉瘤病毒癌基因(KRAS)和B-Raf原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(BRAF)基因的突变状况.方法 选择2009年1月至2016年6月安徽省铜陵市人民医院及安徽省立医院呼吸科、胸外科、肿瘤科诊治的经病理诊断为NSCLC患者,共203例(其中铜陵市人民医院117例,安徽省立医院86例),收集患者的外科手术肿瘤组织标本和淋巴结活检、肺穿刺活检、气管镜活检和胸腔积液沉渣标本,应用突变扩增阻滞系统(ARMS)进行EGFR、KRAS和BRAF基因突变检测和免疫组化法进行ALK基因分析,采用χ2检验分析基因的突变率及其与临床特征的关系.结果NSCLC患者EGFR、ALK、KRAS和BRAF基因的突变率分别为51.23％(104/203),4.88％(8/164),10.69％(17/159)和1.26％(2/159).EGFR基因阳性突变率女性组66.67％(58/87)高于男性组36.21％(42/116),腺癌组48.80％(81/166)高于鳞癌组33.33％(7/21),非吸烟组63.38％(90/142)高于吸烟组16.39％(10/61),差异有统计学意义(χ2=18.45,113.13,37.69;均P<0.05).而EGFR基因突变状况与标本来源类型如手术、淋巴结活检、肺穿刺活检、气管镜活检和胸腔积液沉渣标本间差异无统计学意义(χ2=3.91,P>0.05).ALK基因突变状况与性别、病理类型、吸烟状态之间均差异无统计学意义(χ2=0.00,0.86,0.55;均P>0.05).KRAS基因突变状况与性别、病理类型、吸烟状态之间均差异无统计学意义(χ2=3.63,2.13,2.36;均P>0.05).此外BRAF基因突变均为男性、吸烟患者.检测中发现3例19,21外显子EGFR双突变;1例EGFR和ALK双突变.结论 NSCLC患者EGFR基因突变率高,其次为KRAS、ALK、BRAF基因. EGFR基因突变以女性、不吸烟、腺癌为优势人群, EGFR与ALK双突变可共存.
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早发糖尿病患者线粒体DNA tRNA Leu(UUR)突变的研究
目的探讨天津地区早发糖尿病(DM)患者线粒体DNA tRNALeu(UUR) 3243 A→G突变的发生率及其相关性. 方法随机选取无亲缘关系、发病年龄≤45岁的DM患者348例,对照组207名,收集相应临床资料,提取外周血基因组DNA, 以聚合酶链反应、限制性内切酶片段长度多态性及克隆的方法检测线粒体基因tRNALeu(UUR) 3243 A→G突变,并进行家系研究. 结果 DM组发现2例3243 A→G突变,检出率为0.6%,有家族史的DM患者中发生率为1.2%.对照组未发现此突变.3243 A→G突变先证者呈典型的线粒体DM表现,其家庭成员的临床表型和基因突变异质性不一致. 结论 tRNALeu(UUR)3243 A→G突变在天津地区发病年龄≤45岁的DM患者中检出率低,在合并其他线粒体病的患者中发生率较高;该突变异质性比例在有丝分裂组织中可能随年龄增加而减小.
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肺癌组织p53基因突变与肿瘤耐药基因表达的相关性及其临床意义
目的探讨p53基因突变与肿瘤耐药基因表达状况及肺癌耐药的关系.方法应用免疫组织化学法检测66例肺癌及其癌旁组织的突变型P53蛋白及耐药相关蛋白的表达水平.其中31例肺癌及其癌旁组织应用聚合酶链测定-单链构象多态性(PCR-SSCP)-银染法及逆转录-聚合酶链测定(RT-PCR)法检测p53基因第5～8外显子突变情况及各种耐药基因的mRNA表达水平;12例应用三磷酸腺苷-肿瘤化疗敏感实验(ATP-TCA)检测肺癌细胞对诺维本、卡铂、依托泊苷、表柔比星、5-氟尿嘧啶、博莱霉素的敏感性.结果突变型P53蛋白与P糖蛋白(Pgp)、多药耐药相关蛋白 (MRP1)、谷胱甘肽-S-转移酶π (GST-π)的表达状况存在着相关性(r分别为:0.47、0.33、0.44,P均<0.05);ATP-TCA结果显示突变型P53蛋白的表达状况及其与Pgp、MRP的共表达均和诺维本及卡铂的耐药相关(P均<0.05).结论肺癌组织耐药相关蛋白的表达与p53基因突变有关,突变型P53蛋白的检出可以预示内源性耐药的存在,恢复野生型P53蛋白的功能可能有助于逆转耐药.
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高通量测定技术检测结核分枝杆菌耐利福平的研究
目的基于焦磷酸测序(pyrosequencing)技术,建立耐利福平结核分枝杆菌快速检测方法,并探讨其临床应用价值.方法设计一对聚合酶链反应(PCR)引物,其中一引物经生物素化修饰,PCR扩增含耐药决定区一297 bp 长的rpoB基因片段,借用链亲和素包被磁珠纯化单链PCR产物.设计2个正向测序引物,运用pyrosequencing技术对耐药决定区进行序列测定.通过对一系列10倍稀释的结核分枝杆菌H37Rv标准株DNA进行分析,评价所建立方法的检测敏感性.通过对已知耐药表型的结核分枝杆菌临床分离株进行分析,评价所建立方法的检测特异性.结果 PCR扩增后,可在2 h内得到耐药决定区序列.所建立方法的检测灵敏度为 50 fg DNA/反应.在所分析的利福平敏感株中均未检测到耐药决定区突变,而在耐利福平菌株中均检测到耐药决定区突变.结论所建立的方法具有自动化程度高和结果准确等特点,适用于对耐利福平结核分枝杆菌进行快速高通量检测.
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高分辨率熔解曲线技术快速筛查结核分枝杆菌pncA基因突变
目的 应用高分辨率熔解曲线(HRM)技术建立快速检测MTB对吡嗪酰胺的耐药性.方法 收集深圳市慢性病防治中心2007-2009年耐药监测项目中的临床分离菌株,用基因测序法检测pncA基因突变情况,选取49株突变型菌株和78株野生型菌株作为研究对象,建立HRM检测pncA基因突变方法,并应用于吡嗪酰胺耐药性评估.以BACTEC MGIT 960结果为金标准,评价HRM的应用价值.结果 49株突变型菌株中HRM检测出48株突变,1株双突变位点误判为野生型,78株野生型菌株中HRM检测出6株突变型.BACTEC MGIT 960药敏方法测定结果,127株临床分离株中吡嗪酰胺耐药62株,敏感65株；HRM检测62株耐药株中有53株耐药,65株敏感株中有64株敏感.以BACTEC MGIT 960为药物敏感性的金标准,其敏感度为85.5％ (53/62),特异度为98.5％(64/65),Youden指数为0.840.结论 HRM检测吡嗪酰胺耐药性与BACTEC MGIT 960法有很好的一致性,具有快速、简便的优点,有较好的临床应用前景.
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囊性纤维化一例报告并文献复习
目的探讨囊性纤维化的发病特点、诊断和治疗方法.方法结合收治的1例女性,14岁囊性纤维化患者的临床资料及国内外已正式发表的16例中国人囊性纤维化患者的临床特点、诊断方法和转归进行综合分析.结果本例患者表现为反复呼吸道感染,伴副鼻窦炎和中耳炎;影像学显示肺上叶为主的支气管扩张,汗液电解质Na+ (126.6±5.4)mmol/L、Cl-(108.9±3.3) mmol/L,均增高(正常值均<60 mmol/L),胰腺功能正常.文献报道的患者中,男7例,女9例;确诊年龄6个月～25岁;明确死亡11例,9例死亡年龄小于13岁;临床表现均有反复肺部感染,伴营养不良14例,病变累及肝脏出现黄疸4例;诊断主要根据临床表现、汗液电解质检查和尸检,其中4例经基因分析发现囊性纤维化穿膜传导调节因子(CFTR)有突变,均为少见突变. 结论中国人囊性纤维化临床表现与白种人表现相似,但是CFTR基因突变部位可能与白种人不同.
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利福布汀抗结核分枝杆菌活性及其耐药性与rpoB基因突变关系的探讨
目的 比较利福平和利福布汀的体外抗MTB活性,分析其交叉耐药性,评价利福平和利福布汀耐药性与rpoB突变的关系.方法 采用微量平板Alamar Blue检测(MABA)法,检测利福平和利福布汀对MTB临床分离菌株168株的抗菌活性,并对其rpoB基因核心区进行DNA序列测定.两组间基因突变率的比较采用x2检验.结果 66株利福平敏感菌株均对利福布汀敏感( MIC≤0.125 mg/L),未检测到rpoB基因耐药决定区存在突变；102株利福平耐药菌株中有76株同时对利福布汀耐药( MIC ＞0.5 mg/L),交叉耐药率为74.5％(76/102);26株MIC≤4 mg/L的利福平耐药菌株仍对利福布汀敏感(MIC≤0.5 mg/L)；516、526和531位点的氨基酸改变与利福平和利福布汀耐药均有关,而511和533位点的氨基酸改变可能仅与利福平耐药有关,利福布汀耐药菌株的rpoB基因突变率(92.1％,70/76)显著高于利福布汀敏感菌株(23.9％,22/92),差异有统计学意义(x2=78.12,P＜0.05).结论 对利福平低度耐药(MIC≤4 mg/L)的MTB仍对利福布汀敏感.MTB的rpoB基因突变可用于利福平耐药性检测,且对检测利福布汀的耐药性也有参考意义.
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脂蛋白脂酶Ser447Ter基因变异与脑卒中
目的探讨脂蛋白脂酶(LPL)基因Ser447Ter变异与我国脑卒中发病危险的关系.方法对119例脑卒中患者及77例非心脑血管病患者采用聚合酶链反应-限制片段长度多态性,观察LPL基因Ser447Ter变异在脑卒中患者中的分布,判断发病危险性.结果脑梗死组CG型频率显著低于对照组;脑出血组CG型频率与对照组比较无差异;CG型携带者发生脑梗死的危险显著低于CC型.结论LPL基因Ser44Ter变异与脑梗死发生有关,与脑出血无关,LPLSer447T可能是脑梗死低危性的基因标记.
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多基因变异对早发冠心病危险的协同作用
早发冠心病(coronary heart disease,CHD)是指冠心病的发生年龄较小(男性＜55岁,女性＜65岁)而言.按照遗传学规律,一种疾病发生的越早,其与遗传的关系越密切.研究发现一级亲属中有CHD早发(60岁以前)的个体发生CHD的危险增加2～10倍,且亲属CHD发生越早,该个体罹患CHD的危险越高;心肌梗死患者一级亲属的心肌梗死发生率是正常对照组的2～4倍,并且发现心肌梗死患者发病愈早,其一级亲属发病的可能性愈大.目前认为CHD是多基因疾病,随着人类基因组计划的迅速发展,对CHD相关基因的定位和识别和从基因水平阐明CHD,尤其是早发CHD的发病机制成为医学界关注的热点.下面仅就与CHD,特别是与早发CHD有关基因变异作一简要综述.
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表皮生长因子受体基因突变在晚期非小细胞肺癌二线治疗中作用的研究
目的 探讨表皮生长因子受体(EGFR)基因突变在晚期非小细胞肺癌(NSCLC)二线治疗中的指导意义.方法 对2005年12月至2009年12月住我院的139例既往至少接受过1次含铂化疗且近1次化疗后肿瘤进展或复发的NSCLC的病理组织行EGFR基因检测,根据检测的结果把患者分为EGFR突变型口服吉非替尼组(31例)和EGFR野生型口服吉非替尼组(50例)及EGFR野生型口服吉非替尼组(50例).对3组患者进行临床特征、病理、疗效、生存期、体力状况评分(PS)、毒副反应及生活质量的分析.结果 女性、腺癌、非吸烟者的EGFR突变率高于对应组;突变型吉非替尼组、野生型吉非替尼组(62.0%,31例)和野生型多烯紫杉醇组中位无进展生存期(分别为2.8、2.0和2.5个月)、中位生存时间(分别为8.9、7.1和7.8个月)比较,差异有统计学意义(H值分别为11.198、16.991,均P＜0.01).突变型吉非替尼组、野生型吉非替尼组PS评分的变化分别为96.8%(30例)和62.0%(31例),差异有统计学意义(x2=12.583,P＜0.01).野生型吉非替尼组(62.0%,31例)和野生型多烯紫杉醇组(66.0%,33例)化疗PS评分变化比较,差异无统计学意义(x2=0.878,P＞0.05).结论 表皮生长因子受体基因突变可作为指导晚期NSCLC二线治疗的重要指标.
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线粒体DNA ND1基因nt3394 T→C突变与老年人2型糖尿病
目的了解线粒体烟酰胺腺嘌呤脱氧核苷酸(NADH)脱氢酶第一亚单位(ND1)基因中3394位点T→C突变与我国老年人2型糖尿病的关系. 方法收集无血缘关系的208例老年2型糖尿病患者,同时以180例无糖尿病家族史的老年糖耐量正常者作为对照,用聚合酶链反应扩增、限制性内切酶HaeⅢ消化进行点突变筛选. 结果发现9例患者存在线粒体DNA ND1基因 3394位点T→C突变(4.3%),非糖尿病者中仅有1例突变(0.6%),两组比较差异有显著性(P<0.05). 结论线粒体DNA ND1基因中3394位点T→C突变可能与我国老年人2型糖尿病的发病有关.
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浙江地区汉族人线粒体DNA ND1基因T3394C突变与老年2型糖尿病
目的 探讨线粒体DNA ND1基因T3394C突变与老年2型糖尿病的关系. 方法 采用聚合酶链反应(PCR)产物直接测序法对340例无血缘关系的2型糖尿病患者(其中老年糖尿病组90例,非老年糖尿病组250例)和265例健康对照者(老年健康对照组130例,非老年健康对照组135例)的血细胞线粒体DNA进行突变位点检测,并用DNASTAR和Antheprot 5.0软件分析突变位点. 结果 老年糖尿病组、老年健康对照组和非老年糖尿病组分别检出5例、1例和2例T3394C突变.T3394C突变在老年糖尿病组和老年健康对照组之间分布差异有统计学意义(P＜0.05),在老年糖尿病组和非老年糖尿病组之间分布差异也有统计学意义(P＜0.05).蛋白质结构预测显示T3394C突变引起ND1蛋白二级结构改变. 结论 线粒体DNA ND1基因T3394C突变可能与老年2型糖尿病的发生有关.
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新突变致复合杂合子家族性高胆固醇血症家系的基因检测
目的 对临床诊断为遗传性高胆固醇血症纯合子患者所在家系成员的相关基因进行突变检测和分析,探讨该病的分子诊断方法 和发病的可能分子机制.方法 以该家系中3代共6人的基因组DNA为模板,用PCR对低密度脂蛋白受体(LDLR)基因的全部18个外显子和启动子以及载脂蛋白B-100(Apo B-100)基因3500-3531区域进行扩增,琼脂糖凝胶电泳鉴定后对PCR产物直接测序.测序结果 与GeneBank中该基因的正常序列对比找出突变,结合该家系成员临床表型证实突变.结果 在ApoB-100的3500-3531区域未发现突变,而在先证者LDLR基因的第4外显子发现新的点突变685delA杂合性腺嘌呤缺失和386A＞G杂合错义突变,其父存在685delA杂合性腺嘌呤缺失,其母存在386A＞G杂合错义突变.结论 证实家系先证者是存在LDLR突变的复合杂合子,发现的新的LDLR基因突变位点386A＞G和685delA分别来源于父系和母系的遗传,可能是该家系发病的分子基础.
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血管生长素基因突变与中国汉族家族性肌萎缩侧索硬化的关系
目的 通过对31个中国汉族家族性肌萎缩侧索硬化(FALS)家系先证者进行血管生长素(ANG)基因突变检测,探讨中国汉族FALS与ANG基因突变的关系.方法 采集2009年至2012年北京大学第三医院神经内科确诊的31个肌萎缩侧索硬化(ALS)家系的临床资料.利用PCR技术和直接测序的方法,检测各家系先证者的ANG基因是否存在变异.结果 31个ALS家系均呈常染色体显性遗传.全部31例先证者未发现存在ANG基因单核苷酸多态性(SNP)和突变.结论 ANG基因的SNP及突变在中国汉族FALS患者中可能非常少见.
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家族性高胆固醇血症患者低密度脂蛋白受体基因新突变一例
目的分析中国家族性高胆固醇血症(FH)患儿低密度脂蛋白受体(LDL-R)基因突变的情况,并为在婴幼儿时期此病的症前筛查提供确诊方法.方法以患儿及其父母的基因组DNA为模板,首先用聚合酶链反应(PCR)扩增该基因的启动子和全部18个外显子,然后用单链构象多态性(SSCP)方法分析PCR产物,后对电泳结果异常者进行DNA测序.结果在1个家系中检测出患儿和其父亲LDL-R基因的一种新突变,即在第4外显子的444位碱基发生杂合突变(T→A),相应的氨基酸由半胱氨酸变成终止密码子,其母亲LDL-R基因正常.结论 LDL-R基因此位点的突变可引起FH,PCR-SSCP方法可用于筛查出的高危人群的确诊.
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家族性高胆固醇血症患者低密度脂蛋白受体基因复合纯合突变一例
目的检测家族性高胆固醇血症(FH)患者低密度脂蛋白受体(LDL-R)基因点突变,分析基因型与临床表型间的关系,探讨其分子病理机制.方法以1例临床诊断为FH纯合子患儿及其父母的基因组DNA为模板,用降落 PCR方法,在同一程序中分别对LDL-R基因的启动子和全部18个外显子片段进行扩增,琼脂糖凝胶电泳检测,扩增产物直接进行核苷酸序列分析,并检索FH突变数据库(www.ucl.ac.uk/fh).此外采用PCR-限制性内切酶技术,检测载脂蛋白(Apo)B100基因Q3500R突变,以排除家族性Apo B100缺陷症.结果该患儿及其父亲第4外显子发生Cys122→Tyr(C122Y)杂合错义突变,同时患儿及其母第9外显子发生Thr383→Ile(T383I)杂合错义突变,因此该患儿LDL-R基因第4、9外显子各存在一个杂合突变,上述突变尚未在FH突变数据库见到.未检测出患儿及其父母Apo B100 Q3500R突变.结论此患儿为LDL-R基因存在C122Y、T383I复合纯合突变并分别来自其父母;以上两位点突变可引起FH;是FH患者LDL-R基因的一种新突变类型.
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重庆地区22个STR基因座突变分析
目的 观察和分析22个STR基因座(AGCU身份鉴定系统的EX22试剂盒)在重庆汉族人群亲子鉴定中的突变现象,探索STR基因座的突变规律.方法 采用AGCU EX22试剂盒对1596例支持存在亲权关系的案例(三联体563例,二联体1033例)筛查出含等位基因突变事件,统计各STR基因座的突变率、突变等位基因的来源、突变步数及重复单位增加或减少情况,分析突变相关因素的特点.结果 22个被检测的STR基因座中有20个座观察到突变,共观察到53次突变,其中一步突变49次(3.08％),二步突变1次(0.06％),三步突变3次(0.19％),D2S441和TPOX点位未观察到突变.各基因座的突变率介于0.05％～0.42％,平均突变率约0.1289％.来源于父系的突变与来源母系的突变比例约16.67:1,具有统计学差异(P<0.001).增加重复单位和减少重复单位的突变事件比值为1.5:1.结论 STR基因座突变是亲子鉴定中较为常见的现象,当出现1或2个基因座不符合遗传学的规律时,需要加测其他检测系统,并计算突变基因座PI值及所检测的基因座的累计父权指数值,用于明确鉴定意见.另外应不断积累STR基因座突变数据,选择符合重庆人群的遗传特点及具有高鉴别能力的STR基因座的遗传标记,以保证鉴定结果的准确可靠.
