PNS对体外高糖培养的大鼠系膜细胞凋亡的影响及机制

目的:观察PNS对体外高糖培养的鼠系膜的作用,探求PNS对体外高糖培养的大鼠系膜细胞凋亡的影响及机制.方法:在大鼠肾小球系膜细胞系HBZY-1体外培养的基础上,进行实验分组.检测不同浓度的葡萄糖、PNS和胰岛素对细胞增殖、细胞凋亡及Bd-2和Bax蛋白表达的影响.结果:(1)高糖组在24h、48h、72h时段的吸光度值均较正常对照组增高,尤以48h增高明显,在72h时呈下降趋势(P＜0.05);高渗甘露醇组与正常对照组相比差异无显著性(P＞0.01);PNS组与高糖组比较,当PNS浓度为0.5 nmol/L时,吸光度值无显著差异(P＞0.05);当PNS浓度等于或大干10nmol/L时,吸光度值显著下降(P＜0.05),系膜细胞的增殖明显受到抑制.结论:PNS和胰岛素合用能够抑制高糖诱导的系膜细胞Bax蛋白、Bd-2蛋白的过表达,使Bax蛋白表达下降、Bel-蛋白表达增加;提示PNS具有抗凋亡作用,通过影响Bcl-2/Bax基因表达减少大鼠肾小球系膜细胞凋亡.PNS和胰岛素合用对肾脏有保护作用.其作用机制部分可能是通过减少细胞凋亡及影响凋亡相关基因实现的.

建中理劳汤含药血清对TGF-β1诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖及基质金属蛋白酶表达的影响＊

目的：通过观察建中理劳汤含药血清对转移生长因子-β1（TGF-β1）诱导的大鼠肾小球系膜细胞（HBZY-1）增殖、基质金属蛋白酶及其抑制酶表达的影响，探讨建中理劳汤治疗慢性肾衰纤维化的机制。方法：体外培养HBZY-1细胞，制备理劳汤含药血清，实验分为空白对照组、TGF-β1诱导组、空白血清组、建中理劳汤低、高剂量组和尿毒清组，通过乳酸脱氢酶（LDH）检测方法观察含药血清对HBZY-1细胞的毒性作用；通过CCK8方法观察各组HBZY-1细胞形态和增殖的情况；通过ELISA方法检测各组HBZY-1细胞中基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9及其抑制酶TIMP-1、TIMP-2表达的情况。结果：建中理劳汤含药血清对HBZY-1细胞无毒性作用（P>0.05）；与模型组相比，建中理劳汤可明显抑制TGF-β1诱导的HBZY-1细胞的增殖（P<0.05）；建中理劳汤可明显增加MMP-2、MMP-9的表达（P<0.05），同时抑制TIMP-1、TIMP-2的表达（P<0.05）。结论：建中理劳汤含药血清可明显抑制TGF-β1诱导的大鼠肾小球系膜细胞的增殖，并通过影响基质金属蛋白酶及其抑制酶的表达改善慢性肾衰纤维化。

滋肾通络方含药血清对高糖诱导的大鼠系膜细胞增殖的影响

目的:从细胞水平观察滋肾通络方含药血清对体外培养的大鼠肾小球系膜细胞(Glomerular Mesangial Cells,GMCs)增殖的影响,探讨其在糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)防治中的可能机制.方法:体外培养培养大鼠肾小球系膜细胞株,利用噻唑蓝(3-[4,5-dimethylthylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyltetrazolium broide,MTT)比色法动态观察各组含药血清作用下各组GMC不同时间点的增殖情况.结果:与正常组相比,高糖+LPS能明显刺激体外培养的GMC增殖,而与模型组相比,滋肾通络方含药血清能明显抑制GMC增殖.结论:高糖+LPS可促进GMC增殖,滋肾通络方含药血清能明显抑制高糖+LPS条件下GMC增殖,从而发挥预防和治疗肾小球硬化,进而延缓DN的进展.

温脾汤对LPS诱导的体外培养系膜细胞增殖影响的研究

目的:探讨温脾汤药物血清对原代培养大鼠系膜细胞增殖的影响.方法:分离培养原代大鼠肾小球系膜细胞,以LPS诱导系膜细胞增殖,设立正常对照组、大剂量含药血清组、uan中剂量含药血清组、小剂量含药血清组.分别以酶标仪和流式细胞仪检测细胞增殖和细胞周期情况.结果:不同浓度的LPS均能刺激大鼠系膜细胞体外增殖,在24h、48h、72h各时相均以LPS3(1μg/ml)刺激强度高.同时加入温脾汤药理血清后,可见药理血清对LPS诱导的MC增殖具有不同程度的抑制作用,各时相点均以大剂量含药血清抑制效果为明显.进一步的研究表明,温脾汤药物血清能够增加系膜细胞G1期细胞百分数,降低S期细胞百分数,表明药物作用可使细胞分裂停滞在S期.结论:温脾汤药物血清能够明显抑制LPS诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖.

前列腺素E1改善高糖联合肿瘤坏死因子α损伤肾小球系膜细胞株细胞及机制研究

目的 观察前列腺素E1(PGG)对高糖联合TNF-α诱导的大鼠肾小球系膜细胞株(HBZY-1)损伤的影响及机制.方法 将HBZY-1细胞分为正糖(NG)组、高糖+TNF-α(HT)组、高糖+ TNF-α+不同浓度PGE1(HTP1～5)组,采用MTT法测定细胞增殖,ELISA与RT-PCR法测定细胞上清液中单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、转化生长因子-β1(TGF-β1)以及白介素-6(IL-6)蛋白含量及mRNA表达,细胞免疫荧光法测定核因子-κB p65(NF-κB p65)核转位.结果 高糖联合TNF-α促进HBZY-1增殖,增加MCP-1、TGF-β1蛋白与mRNA,以及IL-6mRNA的表达(P＜0.05),同时促进NF-κBp65的核转位;1 ng/ml的PGE1可抑制上述作用(P＜0.05).结论 PGE1通过抑制NF-κB通路来抑制高糖联合TNF-α诱导的HBZY-1增殖,降低MCP-1、TGF-β1蛋白与基因,以及IL-6基因表达.

结缔组织生长因子siRNA抑制高糖诱导的大鼠系膜细胞合成结缔组织生长因子及Ⅰ型胶原的表达

目的 研究针对结缔组织生长因子(CTGF)的小干涉RNA(siRNA)对高糖诱导大鼠系膜细胞(RMC)合成CTGF及Ⅰ型胶原(collagen type Ⅰ)的抑制作用.方法 设计并合成针对CTGF的siRNA.以含有不同浓度葡萄糖(5、10、15、20、25 mmol/L)的培养基培养RMC.将CTGFsiRNA转染至高糖(25 mmol/L)环境刺激的RMC中,以RT-PCR和western blot检测siRNA对RMC合成CTGF及Ⅰ型胶原的影响.结果 随着培养液中葡萄糖浓度的不断升高(高浓度为25 mmol/L),RMC合成CTGF及Ⅰ型胶原明显增加,转染针对CTGF的siRNA后,CTGF及Ⅰ型胶原的合成较对照组明显减弱,与正常葡萄糖浓度组水平相当.结论 针对CTGF的siRNA能明显抑制高糖诱导的RMC合成CTGF及Ⅰ型胶原.

全反式维甲酸可增强大鼠系膜细胞uPA和MMP-2表达

目的研究全反式维甲酸对体外培养大鼠系膜细胞Upa和MMP-2表达的影响，探讨全反式维甲酸抗肾小球硬化的机制。方法分别应用Northernblot、Westernblot和酶谱法检测全反式维甲酸对培养大鼠系膜细胞Upa和MMP-2表达的影响。结果ATRA可促进系膜细胞uPA和MMP-2蛋白表达，提高其酶活性，并增强MMP-2mRNA表达。结论ATRA可增强大鼠系膜细胞的uPA和MMP-2表达，为进一步阐明ATRA拮抗肾小球硬化机制提供了直接的实验依据。

大鼠肾脏系膜细胞转染人TGF-β1基因可增强MMP-2表达

目的研究转化生长因子-β1(TGF-β1)对培养的大鼠肾小球系膜细胞(MsC)基质金属蛋白酶-2(MMP-2)表达的影响.方法采用Lipofectin将人TGF-β1基因转染培养的大鼠MsC,经Northern blot鉴定其转染成功否;又分别应用Northern blot.Western blot.酶谱分析法检测阳性表达人TGF-β1的MsC MMP-2 mRNA、蛋白及酶活性变化.结果成功获得稳定过表达人TGF-β1的大鼠MsC克隆(MTG1),该细胞克隆的MMP-2 mRNA.蛋白表达及其酶活性均获增强.结论 TGF-β1可增强MsC MMP-2 mRNA、蛋白表达,并提高其酶活性,这为进一步阐明TGF-β1在肾小球硬化发生机制中的作用提供了重要的实验手段和依据.

CTGF的特异性siRNA抑制大鼠系膜细胞高表达PAI-1

目的 研究针对结缔组织生长因子(CTGF)的小干扰RNA (siRNA)对高糖诱导大鼠系膜细胞(RMC)合成血浆纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的抑制作用.方法 取体外培养的RMC接种于含不同浓度的葡萄糖的6孔板中,设计并合成针对CTGF的siRNA (CTGF siRNA)并转染至高糖环境刺激的RMC中.利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测CTGF mRNA及PAI-1 mRNA在RMC中的表达,利用western blot法检测CTGF蛋白质及PAI-1蛋白质在RMC的表达.结果 随着培养液中葡萄糖浓度的升高PAI-1 mRNA及PAI-1蛋白质在RMC中的表达明显增加,转染CTGFsiRNA后,明显减少.结论 CTGFsiRNA能明显抑制高糖诱导的RMC合成PAI-1.

咪唑立宾对急性Thy1肾炎大鼠细胞周期调控蛋白Cyclin D1的抑制作用

目的 探讨咪唑立宾对急性Thy1肾炎大鼠肾小球系膜细胞增殖的抑制作用及其对细胞周期调控蛋白Cyclin D1的影响.方法 54只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、Thy1肾炎模型组和咪唑立宾组各18只.模型组与咪唑立宾组尾静脉注射OX-7细胞上清浓缩液制备急性Thy1肾炎模型,对照组注射等量生理盐水.注射后6h灌胃给药,对照组与模型组给予蒸馏水,咪唑立宾组给予咪唑立宾20 mg/kg,连续给药7d后,检测3组24 h尿蛋白定量,采用PAS染色评估肾脏组织病理改变,应用RT-PCR法检测Cyclin D1基因表达情况,应用Western blot法检测Cyclin D1蛋白表达情况.结果 模型组24 h尿蛋白定量、肾小球内细胞数、Cyclin D1 mRNA及Cyclin D1蛋白表达水平均明显高于对照组和咪唑立宾组(P＜0.05).结论 咪唑立宾通过调控细胞周期调节蛋白Cyclin D1抑制急性Thy1肾炎大鼠系膜细胞增殖,减少尿蛋白.

建中理劳汤含药血清对TGF-β1诱导大鼠系膜细胞HBZY-1纤维化的作用机制的研究

目的 通过体外细胞实验探讨建中理劳汤含药血清对TGF-β1诱导大鼠系膜细胞HBZY-l纤维化过程中TGF-β/Smad信号通路的调控作用.方法 采用PCR、Western Blot方法观察建中理劳汤含药血清对TGF-β1诱导大鼠系膜细胞HBZY-1纤维化过程中Smad-2、Smad-3、Smad-7 mRNA及蛋白表达的影响;通过Western Blot方法检测5.5 μg/L的TGF-β1诱导HBZY-1细胞不同时间p-Smad2、p-Smad3蛋白的表达影响;Western Blot检测建中理劳汤大鼠含药血清对TGF-β1诱导30min后的HBZY-1细胞p-Smad2、p-Smad3蛋白的表达影响.结果 与正常组相比,TGF-β1组中p-Smad2、p-Smad3蛋白表达显著升高,Smad-7表达明显降低(P＜0.05);而与TGF-β1组相比,加入建中理劳汤含药血清后,p-Smad2、p-Smad3蛋白表达显著降低,Smad-7表达明显升高(P＜0.05).结论 建中理劳汤含药血清对TGF-β1诱导大鼠系膜细胞HBZY-1纤维化过程中TGF-β/Smad信号通路起调控作用,可能是其抗纤维化形成的机制之一.

阻断ERK途径对PTH培育的大鼠系膜细胞上清的TGF-β1的影响

目的探讨阻断ERK途径对甲状旁腺素(PTH)培育大鼠系膜细胞上清的TGF-β1的影响.方法 采用酶联免疫吸附(ELISA)法观察PTH培育大鼠系膜细胞上清以及预先阻断ERK途径后上清液中其TGF-β1的变化.结果 PTH10-8 mol/L培育的大鼠系膜细胞的上清的转换生长因子β1呈现时间依赖性增加(12～48 h),而ERK信号途径抑制剂能够抑制PTH培育的大鼠系膜细胞上清的TGF-β1浓度,在一定的范围内呈剂量(5～50μmol/L)及时间(12～48 h)依赖性.结论 ERK信号途径对PTH培育的大鼠系膜细胞上清液的TGF-β1的有影响,这可能对探讨慢性肾衰的高PTH血症对机体的毒性作用,特别是高PTH血症可能对肾小球系膜细胞外基质的形成甚至肾小球硬化的形成机制有一定的理论价值.

消渴颗粒剂对大鼠系膜细胞TGF-β1表达的影响

消渴颗粒剂对大鼠系膜细胞增殖和TGF-β1表达的影响

目的:观察消渴颗粒剂对高糖刺激后系膜细胞增殖和TGF-β1表达的影响,以探讨消渴颗粒剂治疗糖尿病肾病的机理.方法:培养正常大鼠系膜细胞,经相差显微镜、扫描电镜观察,免疫细胞化学染色actin和desmin染色均为阳性,证实为系膜细胞后,进行实验.高浓度葡萄糖刺激系膜细胞,加入中药含药血清后,用MTT法和激光共聚焦显微镜分别观察消渴颗粒剂含药血清对高糖刺激后系膜细胞增殖和TGF-β1表达的影响.

金雀异黄素对血小板源生长因子刺激下大鼠系膜细胞周期调节蛋白的影响

金雀异黄素(genistein)可影响多种细胞尤其肿瘤细胞的细胞周期调节蛋白的表达而调控细胞的增殖与凋亡,并通过调节细胞外基质(ECM)降解系统酶的活性影响基质的积聚.我们的前期实验已证实血小板源生长因子(PDGF-BB)可诱导体外培养的大鼠系膜细胞(MC)增殖,金雀异黄素可呈浓度依赖性抑制其增殖[1].既然细胞增殖的调控是在细胞周期水平上进行,而细胞周期又由细胞周期调节蛋白来调控,本实验我们拟研究金雀异黄素如何影响细胞周期调节蛋白的表达终达到抑制细胞增殖的效应,为金雀异黄素在肾病中的应用提供实验依据.

肝细胞生长因子对大鼠肾小球系膜细胞表达基质金属蛋白酶及纤连蛋白的影响

肝细胞生长因子(HGF)能通过促进肾小管上皮细胞(TEC)合成基质金属蛋白酶(MMPs)而激活基质降解途径来减缓肾小管间质纤维化的进展[1].但HGF是否能通过促进MMPs表达来延缓肾小球硬化目前尚未见到相关报道,因此我们拟通过研究HGF对大鼠系膜细胞(MC)表达MMP-2、-9以及纤连蛋白(FN)的变化以探讨HGF对ECM的异常代谢可能的作用.

低密度脂蛋白对大鼠系膜细胞产生血管内皮生长因子的影响

贝前列素钠对高糖条件下大鼠系膜细胞细胞外基质代谢的影响

目的：探讨前列环素类似物贝前列素钠（BPS）对高糖条件下大鼠系膜细胞细胞外基质代谢的影响及其可能的机制。方法将实验分为对照（NG）组、高糖（HG）组和高糖联合不同浓度BPS组（0.5、1、2、5μmol/L）。体外培养系膜细胞，收集24、48 h时细胞培养上清液，Elisa法测转化生长因子β1（TGFβ1）、纤维连接蛋白（FN）及基质金属蛋白酶-2（MMP-2）蛋白的表达；提取细胞总蛋白，免疫印迹法测Smad3磷酸化蛋白的表达。结果与NG组相比，HG培养24及48 h细胞TGFβ1、FN蛋白表达均显著增加（P<0.01），MMP-2蛋白表达量显著下降（P<0.01）；细胞培养24、48 h后，与HG组相比，HG+1μmol/L BPS组、HG+2μmol/L BPS组及HG+5μmol/LBPS组细胞TGFβ1蛋白表达量均显著降低（P<0.01）；HG+2μmol/L BPS组、HG+5μmol/L BPS组细胞FN蛋白表达量均显著降低（P<0.01）；HG+2μmol/L BPS组及HG+5μmol/L BPS组细胞MMP-2蛋白表达量均显著增加（P<0.05）；HG组细胞Smad3磷酸化蛋白表达较NG组显著增加（P<0.01）；与HG组相比，HG+2μmol/L BPS组与HG+5μmol/L BPS组细胞Smad3蛋白磷酸化水平显著下降（P<0.05）。结论BPS可能通过抑制TGFβ1/Smad3通路活性对高糖条件下系膜细胞ECM代谢起到了保护性的调节作用。