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RNA干扰技术的研究进展
RNA干扰已经成为敲除特定基因表达的重要工具.将一段双链RNA序列导入机体或细胞中,使具有同源序列的基因表达受到抑制,由于这是一种在RNA水平上的基因表达抑制,也称之为RNA干扰,简称RNAi.该项技术的优点在于不仅可用于研究基因的功能,还可以研究药物干预的候选染色体或者筛选疫苗的靶基因[1].在哺乳动物细胞,RNAi技术已经成为研究基因功能的有利工具,并有望在今后对疾病的治疗中发挥重要作用[2].本文对RNAi技术的研究进展综述如下.
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FAK siRNA质粒表达载体的构建及其对肺巨细胞癌细胞FAK基因表达的抑制
目的应用RNA干扰技术,构建针对FAK的siRNA表达载体,抑制肺巨细胞癌细胞BE-1中FAK的表达.方法依据设计siRNA的原则,针对人FAK的mRNA序列,设计并合成编码siRNA的两条寡核苷酸序列,经退火成互补双链,再克隆到pSilencerTM2.1-U6真核表达载体中构建重组体pSilencerFAK,进行测序鉴定.然后转染重组体至BE-1细胞中,经G418筛选,以空质粒转染为对照,获得稳定转染克隆,运用Western印迹检测FAK基因的表达.结果测序证实目的寡核苷酸片段已被克隆到pSilen-cerTM2.1-U6载体中,pSilencer-FAK转染细胞后,FAK基因在蛋白水平的表达量受到明显抑制.结论成功构建了针对人FAK的siRNA表达载体,通过转染BE-1细胞,可有效抑制细胞中FAK的表达,为后续研究以及肺癌的基因治疗奠定了基础.
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BRCA1基因CpG岛甲基化所致转录抑制作用具有位点特异性
表遗传(Epigenetics)是一种可遗传的,非DNA序列改变的,能引起基因表达水平的异常.DNA的甲基化是影响表遗传的主要因素,与基因表达抑制、基因功能缺失有关.许多抑癌基因如p16、Rb、BRCA1等,通过DNA的甲基化而失活,成为某些肿瘤和遗传性疾病发病的重要机制之一.但是,并不是所有的胞嘧啶5′甲基化与基因表达下降有关.研究表明,基因转录抑制可能与基因启动子和第一外显子区域特别是CpG岛的甲基化有关.基因的CpG岛序列长度在200 bp以上,在此区域内存在许多的CpG位点.如BRCA1基因的CpG岛即在-567～+44 bp序列内存在30个CpG位点,并都有可能发生胞嘧啶的甲基化修饰.这些位点的甲基化是否都与转录抑制有关,有没有影响基因转录和表达的特异性、关键CpG位点存在?不同作者对不同基因研究的结果不一致,甲基化的作用方式至今还未得到解决,因此影响甲基化效应的有效分析,甚至可能导致错误结果.Rice(Carcinogenesis,2000,21(9):1761-1765.)对21例乳腺癌患者BRCA1基因CpG岛中30个CpG位点的甲基化情况和基因转录水平进行研究,提出CpG岛甲基化与基因转录抑制有关.我们对该数据用方差分析、多因素线性回归模型重新进行分析研究,探讨BRCA1基因CpG岛区域各CpGs位点的甲基化与基因转录水平的关系,以阐明CpG甲基化对转录抑制的作用方式.方差分析显
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Skp2 siRNA表达载体构建及其对喉鳞状细胞癌细胞Skp2基因表达的抑制作用
目的:应用RNA干扰技术.构建针对Skp2的siRNA表达载体,抑制喉鳞状细胞癌细胞Skp2基因的表达.方法:根据设计siRNA的原则,针对人Skp2的mRNA序列,设计并合成编码siRNA的2条寡核苷酸序列,经退火成互补双链,再克隆到真核表达载体pGPU6/Neo中构建重组体pGPU6Skp2,转化DH5α菌株,提取质粒进行酶切鉴定后,进行序列测定.然后转染重组质粒至Hep2细胞中,应用流式细胞术检测Skp2基因的表达.结果:将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,经酶切和测序鉴定确实为所需序列.pGPU6Skp2转染细胞后,Skp2基因在蛋白水平的表达量受到明显抑制.结论:成功构建了针对人Skp2的siRNA表达载体,通过转染Hep2细胞,可有效抑制细胞Skp2的表达,为后续基因治疗研究奠定了实验基础.
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支链氨基酸代谢缺陷促进心衰的发生发展
心力衰竭是严重危害国人健康与生命的重大疾病，目前有效治疗手段缺乏，因此对心衰病理机制进行研究，发现新的诊疗方法具有重要意义。我们研究在国际上首次发现支链氨基酸代谢异常与心衰的发生和发展紧密相关。在野生型小鼠心衰过程中，支链氨基酸代谢酶的基因表达受到抑制，导致支链氨基酸代谢缺陷，代谢中间产物支链酮酸累积。更为重要的是，这些现象也在人的衰竭心脏中得到证实。进一步的研究发现支链氨基酸代谢酶的基因表达抑制受到转录因子KLF15调控。在基因敲除小鼠模型中，支链氨基酸代谢缺陷损伤心脏的收缩功能并促进了心衰的发展。支链酮酸可以抑制线粒体氧化磷酸化，在心脏中诱发氧化应激并干扰糖脂代谢。因此病理状态下心脏中的支链氨基酸代谢异常可能会进一步促进心衰的发生和发展，形成一个正向恶性反馈环。这一研究发现了心衰发生发展的新机制，为心衰的诊断和治疗提供了新的潜在靶点。
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cDNA微矩技术用于脓毒症小鼠肺组织中差异性表达基因的检测
目的:本文在小鼠盲肠结扎一穿孔引起的混合感染性脓毒症模型上,首次采用了cD NA微矩阵 (基因芯片)检测技术,研究脓毒症中肺组织在脓毒症后早期(6 h)和晚期(12 h)的基因表达的改变,以期从基因水平上揭示脓毒症性急性肺损伤的发病机制并为进一步寻找其新的防治手段打下基础.方法:(1)小鼠混合感染性脓毒症的构建:以小鼠CLP ,构建混合感染性脓毒症模型.(2)CLP后肺组织中差异性表达基因的检测:小鼠分为脓毒症组(A组)及假手术对照组(B组):分别于CLP后6 h、12 h摘取全肺,-70℃保存待测;检测:采用上海联合基因公司提供的含2304个小鼠cDNA克隆杂交点的MCEG 20S型基因芯片;各组不同时点的肺组织标本经RNA提取、mRNA纯化后,经逆转录反应分别合成标记以Cy5(A组)或Cy3(B组)荧光素的cDNA探针;各时点的A、B两组探针混合后分别与上述基因芯片杂交,经严格洗脱后用Sc anArray 5000型激光共聚焦扫描仪:以两种不同波长分别对芯片进行扫描,得到芯片的荧光信号强度数据;以Image3.0软件分析各时点两组间的荧光值之比(R).R＞2.0为表达上调,R ＜ 0.5为表达下调.结果:(1)CLP后小鼠肺组织均出现典型的急性肺损伤的病理改变.24 h生存率为40%;48 h的生存率为7.5%;72 h的生存率为5%.(2)在CLP后6 h和12 h, 共筛选出80个与假手术对照组相比出现差异性表达的已知功能基因,其中表达上调和下调者各40个;CLP后6 h有23个已知基因出现差异性表达,其中上调者12个,下调者11个;CLP 后12 h,有75个已知基因出现差异性表达,其中表达上调者39个,下调者36个;(3)对以上差异性表达基因按其功能予以聚类分析,发现脓毒症引起的急性肺损伤涉及到肺组织中一系列功能基因的表达改变,其中包括免疫相关基因、急时相反应与热休克反应相关基因、抗氧化反应基因、细胞骨架相关基因以及多种细胞代谢和信息传递相关基因.它们对脓毒症的病理生理的演变,可能起了重要的作用.(4)通过对本试验所发现的差异性表达的基因的生物信息学分析,遴选出了具有进一步研究价值或潜在治疗作用的基因.结论:脓毒症中,一系列与炎性反应和细胞免疫相关的基因表达增高.同时热休克反应、抗氧化反应以及与细胞能量代谢和骨架结构相关的基因表达抑制,这可能是脓毒症病理生理改变进行性加重的原因 .利用基因芯片技术可高效率、大规模地检测脓毒症、AL和MODS时基因表达的改变,高通量筛选与脓毒症发生和发展相关的基因,有利于从分子水平上澄清脓毒症的病理生理机制,比较不同的干预治疗效果,寻找新的治疗目标和治疗药物.
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反义阻断hREV3基因表达抑制MNNG诱发的非定标性突变的发生率
目的:REV3基因是酵母中发现的具有跨损伤修复活性的DNA聚合酶,参与真菌易误性复制后修复通路.本研究采用反义核酸技术建立hREV3基因表达阻断的人胚肾细胞系,研究它与非定标突变形成的关系.方法:1.hREV3基因片段从pBS-hREV3反向重组入载体pMAMneo-amp 构建真核反义诱导表达质粒.2.重组质粒转染HEK293细胞,G418全培养基筛选建立hREV3基因表达阻断细胞系.
