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不同砷化合物对人胚肾细胞系HEK-293细胞的毒性研究
目的 观察不同砷化合物诱发人胚肾细胞系HEK-293细胞的细胞毒性与氧化应激作用.方法:将细胞密度为1×1O(5)个/ml的HEK-293细胞分别暴露于As2O3(iAs3+,0～50μmol/L)、Na2HAsO4·7H2O(iAs5+,0～500μmol/L)和C2H6AsO2Na·3H2O(DMA5+,0～500μmol/L)24h,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定细胞生存率,并测定细胞中丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活力.结果 当iAs3+≥1.0μmol/L,iAs5+≥50μmol/L,DMA5+≥400μmol/L时,与溶剂对照相比,HEK-293细胞的生存率均下降,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01);且随着染毒剂量的升高,iAs3+和iAs5+染毒HEK-293细胞的生存率呈下降趋势,而DMA5+染毒HEK-293细胞的生存率呈先上升后下降的趋势.与溶剂对照组比较,50.0μmol/LiAs3+,500μmol/L iAs5+和500.μmol/L DMA5+染毒HEK-293细胞MDA含量升高,1.0、10.0、100.0、200.0 μmol/L iAs3+,100.0、200.0、300.0、500.0μmol/LiA5+,25.0、50.0、500.0μmol/L DMA5+染毒HEK-293细胞SOD水平下降,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01).结论 3种砷化物对HEK-293细胞的细胞毒性依次为iA83+iA85+>DMA5+,砷化合物所诱发的细胞毒性作用机制之一可能与氧化应激有关.
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NELL2基因真核表达载体和microRNA干扰质粒的构建及其体外干预效应的研究
目的 构建大鼠NELL2基因真核表达载体peDNA3.1(-)-NELL2的mieroRNA(miRNA)干扰质粒,观察其转染体外细胞系后对NELL2 mRNA表达的干预效应.方法 从SD大鼠下丘脑组织中提取总RNA,设计特异性引物,采用RT-PCR技术扩增NELL2基因全长cDNA,利用T载体将目的 片段克隆至表达载体peDNA3.1(-),得到重组质粒pcDNA3.1(-)-NELL2.针对NELL2基因分别设计4对pre-miRNA序列,通过T4连接酶克隆至pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA表达载体构建干扰质粒(p-NELL2-miRNA1～4).将p-NELL2-miRNA1～4分别与pcDNA3.1(-)-NELL2共转染人胚肾细胞系(HEK293)(p-NELL2-miRNA1～4干预组).采用Real-Time PCR技术检测转染后48 h细胞NELL2 mRNA表达;以转染peDNA3.1(-)-NELL2细胞作为阳性对照组,以共转染pcDNA3.1(-)-NELL2和阴性对照干扰质粒pre-miRNA-neg细胞作为阴性对照组.结果 酶切和测序鉴定结果表明:重组质粒pcDNA3.1(-)-NELL2和干扰质粒p-NELL2-miRNA的片段大小与预计相符,且克隆序列正确.Real-Time PCR结果显示:干预组细胞NELL2 mRNA表达显著低于阳性和阴性对照组(P＜0.05或P＜0.01).结论 成功构建NELL2基因真核表达载体及其microRNA干扰质粒.证实干扰质粒对HEK293细胞NELL2 mRNA表达具有特异性的抑制效应.
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G－四链体的形成与稳定对miR－24表达的调控作用
目的：研究旨在探讨G－四链体的形成与稳定对miR－24表达调控作用，为非编码RNA的调控提供新的思路。方法：圆二色光谱、分子核磁、硫酸二甲酯保护实验、电离电喷雾质谱。野生型（G4）和富G序列突变型（NG4）的miR－24过表达腺病毒的构建，人胚肾细胞系（HEK－293A）转染，富G序列敲除SD大鼠的构建，qRT－PCR等实验方法。结果：圆二色光谱证明miR－24－1上游能形成G－四链体并提示其具有平行链构象特征；分子核磁、硫酸二甲酯保护实验等技术证实该 G－四链体具有多层四分体平面结构。病毒转染实验表明，G－四链体在稳定性配基的诱导与稳定作用下能抑制miR－24成熟体的表达。该段富G序列敲除的SD大鼠，心脏组织的miR－24表达水平显著高于野生型SD大鼠。结论：miR－24－1上游富G序列能够形成平行链G－四链体结构，该G－四链体结构的形成与稳定能够抑制miR－24的表达水平。
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反义阻断hREV3基因表达抑制MNNG诱发的非定标性突变的发生率
目的:REV3基因是酵母中发现的具有跨损伤修复活性的DNA聚合酶,参与真菌易误性复制后修复通路.本研究采用反义核酸技术建立hREV3基因表达阻断的人胚肾细胞系,研究它与非定标突变形成的关系.方法:1.hREV3基因片段从pBS-hREV3反向重组入载体pMAMneo-amp 构建真核反义诱导表达质粒.2.重组质粒转染HEK293细胞,G418全培养基筛选建立hREV3基因表达阻断细胞系.
