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脂多糖通过调节iNOS表达影响人卵巢癌SKOV3/DDP细胞顺铂耐药性的研究
目的 观察脂多糖诱导的SKOV3/DDP细胞内分泌型一氧化氮合酶(iNOS)表达变化对人卵巢癌SKOV3/DDP细胞株顺铂耐药性的影响,并初步探讨机制.方法 体外培养SKOV3/DDP细胞,分为对照组、顺铂组、脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)组和联合用药组共4组,对照组给予常规不加血清培养基,顺铂组给予10 μg/ml顺铂,LPS组给予浓度为1 μg/ml的LPS,联合用药组给予10 μg/ml顺铂和1μg/ml LPS,均作用24 h.MTT法检测各组细胞活力;蛋白免疫印迹法观察各组iNOS表达;流式细胞术检测各组细胞凋亡情况;间接免疫荧光法观察各组细胞激活型Caspase-3表达.结果 联合用药组细胞活力明显低于顺铂组(P＜0.05);顺铂组与对照组iNOS表达差异无统计学意义(P＞0.05),LPS组和联合用药组iNOS表达水平明显高于对照组(P＜0.05),且联合用药组高于LPS组(P＜0.05);流式细胞术结果显示联合用药组细胞凋亡率明显高于顺铂组(P＜0.05),且通过间接免疫荧光法显示联合用药组细胞激活型Caspase-3表达高于顺铂组(P＜0.05).结论 LPS能够降低人卵巢癌SKOV3/DDP细胞顺铂耐药性,这可能与其提高SKOV3/DDP细胞内iNOS表达水平有关.
关键词： 脂多糖 顺铂耐药性 iNOS SKOV3/DDP细胞 -
miR-218抑制卵巢癌细胞A2780对顺铂耐药性的实验研究
目的 研究miR-218抑制卵巢癌细胞A2780对顺铂耐药性的影响及可能机制.方法 实时定量PCR检测A2780及顺铂耐药细胞株A2780/DDP中miR-218的表达,转染miR-218 inhibitors和mimics改变A2780及A2780/DDP细胞中miR-218的表达,MTT法检测转染前后细胞对顺铂的敏感性,并分析Wnt2B蛋白表达的改变.结果 与A2780细胞相比,miR-218在A2780/DDP中的表达明显降低.A2780细胞转染miR-218 inhibitors 后,细胞对顺铂的敏感性降低,Wnt2B蛋白表达明显增强；而A2780/DDP细胞转染miR-218 mimics后,细胞对顺铂的敏感性增强,Wnt2B蛋白表达明显减少.结论 miR-218可能通过靶向Wnt2B抑制卵巢癌细胞A2780对顺铂的耐药性.
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PINK1在人卵巢癌细胞系SKOV3增殖及顺铂诱导细胞死亡中的作用
目的 研究线粒体丝苏氨酸蛋白激酶PINK1(PTEN induced putative kinase 1)在卵巢癌细胞生长增殖中的作用,及其表达在顺铂诱导细胞死亡中的作用.方法 转染并用G418筛选稳定表达pcDNA3.1-PINK1及pcDNA3.1的SKOV3细胞系,细胞设3组:正常培养组、转染空质粒pcDNA3.1组,过表达PINK1组.采用实时定量PCR检测各组细胞PINK1 mRNA的表达,MTT和流式细胞仪检测各组细胞生长增殖及细胞周期分布情况.观察PINK1在顺铂(DDP)诱导卵巢癌细胞死亡中的作用,并检测耐药基因MDR1、MRP1以及ABCG2在各处理组中的表达水平.结果 过表达PINK1的SKOV3细胞系PINK1 mRNA的表达水平显著高于正常培养组及转染空质粒pcDNA3.1组细胞(P＜0.05).过表达PINK1组较其他两组细胞增殖率显著提高,细胞进入S和G2/M期比例增加(P＜0.05).过表达PINK1显著抑制了10 μmol/L和20 μmol/L顺铂诱导细胞死亡,并诱导了耐药基因MDR1、MRP1和ABCG2的表达升高.结论 上调PINK1的表达可促进卵巢癌细胞增殖,降低细胞对顺铂作用的敏感性并诱导耐药基因的表达.
关键词： 线粒体丝苏氨酸蛋白激酶PINK1 卵巢癌 细胞增殖 顺铂耐药性 -
汉黄芩苷通过抑制PI3K/Akt/Nrf2/ARE通路逆转SGC7901/cDDP细胞耐药性
本研究旨在观察汉黄芩苷对人胃癌顺铂 (cisplatin, cDDP) 耐药细胞株SGC7901/cDDP耐药性的影响, 并探讨其分子机制.采用浓度梯度递增法构建SGC7901/cDDP细胞;CCK-8法检测汉黄芩苷和cDDP对SGC7901/cDDP细胞活性的影响;Chou-Talalay中效分析法对两药的联合效应进行评价;流式细胞术检测活性氧 (reactive oxygen species, ROS) 含量和细胞凋亡;sh RNA干扰技术抑制Nrf2基因表达;Western blot检测Nrf2、NQO1、GST-π、MRP1、cleaved Caspase-3、p-Akt和Akt的蛋白水平.结果显示, 汉黄芩苷与顺铂单独作用或二者联用48 h均可剂量依赖性地抑制SGC7901/cDDP细胞活力 (P<0.05);当抑制率超过16％时, 二者联用呈协同效应;SGC7901/cDDP细胞的p-Akt、Nrf2和MRP1蛋白水平显著高于其亲代SGC7901细胞 (P<0.05);汉黄芩苷与PI3K抑制剂LY294002均可抑制SGC7901/cDDP细胞Akt磷酸化 (P<0.05), 增加ROS含量 (P<0.05), 下调Nrf2蛋白水平 (P<0.05), 上调cleaved Caspase-3蛋白水平 (P<0.05), 终导致细胞凋亡 (P<0.05);但抗氧化剂NAC可减轻汉黄芩苷诱导的氧化应激和细胞凋亡 (P<0.05);汉黄芩苷与沉默Nrf2基因均可使SGC7901/cDDP细胞NQO1、GST-π和MRP1蛋白水平下降 (P<0.05) .以上结果表明, 汉黄芩苷可在体外增强SGC7901/cDDP细胞对cDDP的敏感性, 这可能与其抑制PI3K/Akt/Nrf2/ARE通路, 从而增强cDDP的毒性作用并触发氧化应激损伤有关.
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长非编码RNA BANCR逆转非小细胞肺癌细胞株顺铂耐药的研究
目的:研究长非编码RNA BANCR对人非小细胞肺癌耐顺铂细胞株A549/DDP耐药性的影响及其可能的作用机制.方法:应用实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测耐顺铂细胞株A549/DDP及其亲本细胞株A549中BANCR的表达差异,发现BANCR在A549/DDP细胞中显著低表达.在A549/DDP细胞中过表达BANCR,分别应用MTT法、克隆形成实验、流式细胞术检测过表达后A549/DDP细胞对顺铂药物敏感性,细胞增殖能力,联合顺铂处理后细胞凋亡变化;Western blot检测过表达BANCR后A549/DDP细胞p53的表达变化.结果:BANCR在A549/DDP细胞中的表达量显著低于A549细胞(P＜0.05),在A549/DDP细胞中过表达BANCR可产生以下效应:相较于对照组,顺铂对A549/DDP/BANCR细胞的半数抑制浓度(half inhibition concentration,IC50)减低(P＜0.05),A549/DDP/BANCR细胞的增殖能力减弱,A549/DDP/BANCR经过顺铂处理后细胞凋亡增多(P＜0.05).Western blot结果显示,与空白对照组比较,过表达BANCR的A549/DDP细胞p53表达水平明显升高.结论:BANCR可能通过诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖,上调p53蛋白表达而逆转A549/DDP细胞对DDP的耐药性.
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Twist 在低氧微环境中对宫颈癌 Hela 细胞顺铂耐药的作用及可能机制
目的：耐药是影响宫颈癌患者的化疗效果及预后的主要原因。探讨Twist在低氧微环境中宫颈癌Hela细胞顺铂耐药的作用及可能机制。方法将Hela细胞分无药对照组、常氧A组（不含CoCl2）、低氧A组（加入含终浓度为150μmol／L CoCl2的培养基），6 h后分别向常氧A组、低氧A 组加入不同浓度梯度顺铂（10－3、10－4、10－5、10－6、10－7 mol／L），24 h后加MTT，测IC50及生长抑制率。以二氯化钴（CoCl2）处理Hela细胞模拟低氧微环境；MTT法筛选低氧条件下顺铂的适作用浓度及时间；设置常氧B组、顺铂组、低氧B组、低氧顺铂组，免疫荧光法和Western blot 法检测Twist、MDR1的表达情况。结果 MTT结果示：常氧A组顺铂IC50为10－5．3 mol／L，低氧A组顺铂IC50为10－4．5 mol／L。当顺铂浓度≥10－5 mol／L时，常氧A组、低氧A组对Hela细胞抑制率较0 mol／L顺铂差异具有统计学意义（P＜0．05），且常氧A组与低氧A组抑制率差异有统计学意义（P＜0．05）。当作用时间≥24 h时，常氧A组、低氧A组对Hela细胞抑制率较0 h时差异具有统计学意义（P＜0．05），且常氧A组与低氧A组抑制率差异有统计学意义（P＜0．05）。免疫荧光结果示：顺铂组、低氧B组、低氧顺铂组Hela细胞中Twist蛋白表达（20．81±2．07、24．25±4．51、33．14±4．24）较常氧B组（13．08±2．39）显著增高（P＜0．05），MDR1蛋白表达（35．26±8．41、60．13±22．32、76．00±9．96）亦较常氧B组（29．57±12．80）增高（P＜0．05）；低氧B组及低氧顺铂组Twist与MDR1表达呈正相关（r＝0．639，P＜0．05）。 Western blot结果示：顺铂组、低氧B组、低氧顺铂组Hela细胞中Twist蛋白表达（0．777±0．066、0．786±0．010、0．990±0．052）较常氧B组（0．631±0．015）增高（P＜0．05），MDR1蛋白表达（0．923±0．038、0．896±0．015、1．049±0．037）亦较常氧B组（0．661±0．085）增高（P＜0．05；低氧B组及低氧顺铂组Twist与MDR1表达呈正相关（r＝0．686，P＜0．05；r＝0．546，P＜0．05）。结论低氧条件下Hela细胞对顺铂的敏感性下降，可能是低氧激活Twist，上调MDR1表达从而引起宫颈癌Hela细胞耐药。
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PDTC通过抑制NF-κB途径增强A549细胞对顺铂的敏感性
目的 探讨PDTC (Pyrrolidine dithiocarbamate)对顺铂耐药的作用及机制.方法 收集对数生长期的A549细胞,分为四组:对照组、PDTC组、DDP组、PDTC+DDP组.应用MTT法检测细胞的增殖抑制率,实时荧光定量PCR方法检测NF-κB mRNA的表达水平,Western blot检测各组NF-κB p65的含量.结果 培养48h和72h,DDP组与PDTC+DDP组细胞增殖抑制率明显高于对照组(P<0.05),并且PDTC+DDP组细胞增殖抑制率明显高于DDP组(P<0.05);PDTC组NF-κB mRNA的表达及蛋白表达量明显低于对照组(P<0.05),而DDP组则明显高于对照组(P<0.05),而PDTC+DDP组较DDP组明显降低(P<0.05).结论 PDTC能够增强顺铂的化疗敏感性,其耐药机制可能与其通过抑制NF-κB的表达及活化有关.
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顺铂耐药人胃癌细胞SGC-7901的耐药特性的研究
目的：研究人胃癌细胞SGC-7901顺铂耐药后的细胞特性的变化。方法用彗星实验( SCGE)观察SGC-7901与胃癌细胞顺铂耐药细胞株( SGC-7901/DDP)的DNA损伤修复的能力,观察SCGE检测图像的尾长评定DNA的修复能力；通过观察胃腺癌 SGC-7901细胞和 SGC-7901/DDP的形态学不同,比较SGC-7901和SGC-7901/DDP自身变化；用细胞划痕的方法检测 SGC-7901/DDP 和 SGC-7901的迁移能力,通过对其迁移能力的观察,初步评价两株肿瘤细胞的侵袭能力；MTT法分别检测临床常用化疗药物5-氟尿嘧啶、依托泊苷、表阿霉素、多西紫杉醇、奥沙利铂对SGC-7901/DDP的敏感性和IC50,观察这些药物对SGC-7901/DDP的敏感性和交叉耐药性。结果人胃腺癌 SGC-7901/DDP 较 SGC-7901的SCGE图像的尾长短,SGC-7901/DDP的DNA损伤修复能力比SGC-7901强,表明顺铂耐药与其DNA损伤修复能力密切相关；SGC-7901/DDP和SGC-7901的形态不同, SGC-7901/DDP SGC-7901体积较小、核分裂较多；通过用细胞划痕的方法观测到SGC-7901/DDP较SGC-7901的迁移能力变差；SGC-7901/DDP对5-氟尿嘧啶、依托泊苷、表阿霉素、多西紫杉醇、奥沙利铂有不同程度的交叉耐药性,其 IC50较SGC-7901明显增加。结论人胃癌细胞 SGC-7901对顺铂耐药可使DNA损伤修复能力增强,并具有多重耐化疗药性,但其细胞的迁移能力减弱。
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RNA干扰沉默黏蛋白1基因表达对食管癌细胞株Eca109顺铂耐药性的影响
目的 观察RNA干扰沉默黏蛋白1(MUC1)表达,食管癌细胞株Eca109在顺铂作用下的增殖差异,探讨MUC1表达与肿瘤顺铂耐药性的关系.方法 设计靶向MUC1基因的慢病毒载体pGC-LV-MUC1小干扰RNA(siRNA),并以感染复数(MOI)=100转染人食管癌细胞株Eca109,用荧光显微镜检测绿色荧光蛋白(GFP)表达,用Western blot方法检测细胞内MUC1蛋白含量,验证siRNA对MUC1基因抑制作用.设置浓度梯度0、5、15、30、45、60 μmol/L,分别作用0、12、24、48 h,应用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞抑制率,计算顺铂半数抑制浓度(IC50).用Western blot检测细胞内凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)、bcl-2相关X蛋白(bax)的表达,验证凋亡通路激活.结果 与对照组比较,转染了重组慢病毒颗粒pGC-LV-MUC1 siRNA的Eca109细胞(实验组)内MUC1蛋白水平(0.566±0.202比1.252±0.323,t=3.119,P=0.036);顺铂作用12h实验组IC50(μmol/L)(66.860±4.749比30.203 ±0.341,t=13.335,P=0.000)明显下降;顺铂作用24 h实验组细胞IC50(μmol/L)明显下降(13.710±0.617比33.680±1.737,t=18.759,P=0.000);实验组凋亡相关蛋白bcl-2表达减少(0.551±0.190比1.416±0.139,t=6.362,P=0.003),bax的表达增加(0.553±0.055比1.345±0.155,t=8.335,P=0.001).结论 人食管癌细胞株Eca109沉默MUC1基因表达,可以导致细胞对顺铂耐药性下降.MUC1基因可能通过抑制凋亡激活途径,增加食管癌细胞对顺铂的耐药.
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CXCR4介导的鼻咽癌细胞系CNE2对顺铂耐药性的研究
目的:通过建立鼻咽癌顺铂耐药细胞系CNE2/DDP,研究CXCR4在耐药机制中的作用.方法:采用药物浓度逐步递增的方法建立顺铂耐药细胞系CNE2/DDP,利用MTT实验、RNA干扰技术、microRNA过表达技术、荧光定量PCR和蛋白免疫印迹等分析CXCR4在CNE2/DDP顺铂耐药机制中的作用,并同时对其下游的目的基因进行研究.结果:①鼻咽癌顺铂耐药细胞系CNE2/DDP中CXCR4基因的表达水平升高,当降低了CXCR4 siRNA表达水平后,CNE2/DDP的顺铂耐药能力减弱;②CNE2/DDP中的let-7a表达水平降低,而bcl-2的表达水平升高.当利用let-7a mimics过表达let-7a后,bcl-2的表达水平下降,CNE2/DDP耐药能力减弱;③CXCR4 siRNA降低CXCR4的表达水平后,let-7a的表达水平上升.结论:首次发现CNE2/DDP的耐药能力较CNE2明显增强,IC50值增加了至少5倍,并且通过调控let-7a的表达,进而影响凋亡抑制基因bcl-2的表达来实现其对CNE2顺铂耐药能力的调节.
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上调miR-100降低宫颈癌细胞侵袭和迁移及顺铂耐药性
[目的]在宫颈癌Hela、Siha细胞中上调miR-100后,研究细胞侵袭及迁移功能及顺铂耐药性变化并探讨其机制.[方法]将miR-100 mimic通过lipomax试剂转染至宫颈癌细胞Hela、Siha中,细胞主要分为两组:NC组,为空白对照;mir100组,为上调miR-100后的细胞.transwell法观察细胞侵袭性,划痕实验观察迁移性;WB测定上皮间质变相关蛋白E-Cadherin、Snail、Vimintin及MMP2、uPA的表达;CCK8法测定顺铂耐药性.[结果]①两系宫颈癌细胞上调miR-100后,细胞的侵袭、迁移性降低;②上调miR-100后的宫颈癌细胞中上皮相关分子E-Cadherin表达上调,间质表型分子Snail、Vimintin表达下调,MMP-2表达无差异,uPA表达下降;③不同浓度顺铂作用(P＜ 0.001)及是否转染mir-100 siRNA (P＜ 0.001)对细胞存活率的改变均具有显著统计学意义,且浓度因素与处理因素间相对独立;在Siha细胞中得出相同结论(P＜ 0.001).HelaNC、Hela 100细胞株顺铂IC50(μmol/L)分别为:8.19±0.34、5.38±0.47,SihaNC、Siha 100的IC50分另为8.86±0.92、6.19±0.23,P＜ 0.05.[结论l miR-100在宫颈癌细胞Hela及Siha中通过降低上皮间质变过程起抑制侵袭和转移的作用,该功能可能与uPA的改变有关.上调miR-100可降低宫颈癌细胞对顺铂的耐药性.
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人肺腺癌A549细胞系干细胞样细胞的培养检测及其抗顺铂能力的研究
目的:从人肺腺癌A549细胞系中培养获得含干细胞样细胞的球细胞(Sphere细胞),检测相关标志物表达及其对顺铂的耐药性.方法:采用含特定生长因子的无血清培养基诱导A549细胞的Sphere细胞形成,用亲脂荧光染料标记技术和免疫荧光法检测Sphere细胞中干细胞的存在,用流式细胞术检测干性标志物CD133,OCT4,CD56,CD117在Sphere细胞中的表达,用CCK8法检测顺铂处理后A549细胞及Sphere细胞的耐药性,并计算IC50.结果:A549细胞的Sphere细胞中含不对称分裂的干性标志物阳性细胞,且多种干性标志物表达比例升高,对顺铂耐药性也显著提高(P<0.05).结论:人肺腺癌细胞系A549细胞在特定培养条件下可形成富集了干细胞样细胞的Sphere细胞,并对顺铂的抵抗能力增强.
