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间充质干细胞对移植物抗宿主病预防作用的Meta分析
目的:评价间充质干细胞(MSC)在造血干细胞移植(HSCT)后对移植物抗宿主病(GVHD)预防作用的疗效.方法:检索PubMed数据库(1950年1月-2014年3月)、EMbase数据库(1970年1月-2014年3月)、Cochrane图书馆临床对照试验数据库(CENTRAL,2014年第4期)、中国生物医学文献数据库(CBM,1978年1月-2014年3月);对纳入文献的参考文献进一步扩大检索.所纳入随机对照试验(RCT)依据Cochrane风险偏倚评价工具进行质量评价.采用RevMan 5.1软件进行统计分析,评价MSC对GVHD预防作用的疗效.结果:共纳入3篇英文文献,纳入HSCT患者117例,其中MSC组56例,对照组61例.Meta分析结果显示:MSC未能降低急、慢性GVHD发生率(RR:0.44,95％ CI:0.08-2.51,P=0.35;RR:0.85,95％ CI:0.54-1.33,P=0.47);MSC未增加原发病复发率及巨细胞病毒感染率(RR:1.52,95％ CI:0.63-3.68,P=0.35;RR:1.05,95％ CI:0.72-1.53,P=0.78);MSC未改善病人总体生存率(RR:1.06,95％ CI:0.79-1.43,P=0.71).结论:MSC可能对GVHD有一定预防作用,但由于尚缺乏大样本的RCT证据支持,MSC对GVHD的预防作用尚不能作出后结论,需更多大样本、高质量的RCT研究才能得出肯定性结论.
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间充质干细胞通过CCL5/CCR5信号途径促进骨肉瘤Saos-2细胞迁移和生长
目的 研究人间充质干细胞(hMSC)对骨肉瘤Saos-2 细胞迁移与增殖的影响及其机制.方法 取传代培养的hMSC 和Saos-2 细胞,分别制备hMSC 条件培养基(MSC-CM)和Saos-2 细胞条件培养基(Saos-2-CM).采用免疫荧光细胞化学方法 和双抗体夹心ELISA 方法 分别检测hMSC CCL5 趋化因子的表达及其表达水平,蛋白质免疫印迹方法 检测Saos-2 细胞CCR5 因子的表达.按条件培养基的不同将Saos-2 细胞分为4 组:含10% 胎牛血清的α-MEM 培养基(阴性对照)、Saos-2-CM(阳性对照)、MSC-CM、含24 ng/ml 兔抗人CCL5 抗体的MSC-CM(MSC-CM/anti-CCL5 Ab),应用Transwell实验和噻唑蓝(MTT)法分别检测hMSC 对Saos-2 细胞迁移与增殖能力的影响.实验均重复3 次.结果 免疫荧光细胞化学方法 和双抗体夹心ELISA 检测显示,hMSC CCL5 因子表达阳性且其表达水平为3.68 pg/ml.蛋白质免疫印迹检测显示,Saos-2 细胞CCR5因子表达阳性.Transwell 实验和MTT 检测结果 显示,MSC-CM 能明显促进Saos-2 细胞的迁移与增殖,而MSC-CM/anti- CCL5 Ab 组Saos-2 细胞的迁移与增殖能力均明显下降,2 组间差异均有统计学意义(分别为P < 0.01,P < 0.05).结论CCL5/CCR5 信号途径在hMSC 促进Saos-2 细胞迁移与增殖过程中发挥关键作用,抑制CCL5 趋化因子的表达可明显降低Saos-2 细胞的迁移与增殖能力.
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再生障碍性贫血患者骨髓间充质干细胞转化生长因子β1及Smad3表达下调的发病学意义
目的 研究骨髓间充质干细胞(MSC)中转化生长因子β1(TGF-β1)与Smad3的表达下调与再生障碍性贫血(再障)发生的可能关系.方法 取20例重型再障患者骨髓MSC,分离制备出Flk1+CD34-MSC后进行以下试验:①体外定向诱导MSC向脂肪细胞分化,倒置显微镜观察成脂分化情况,油红O染色法鉴定脂肪细胞,用实时荧光定量PCR检测分化过程中脂蛋白酯酶(LPL)基因的表达;②用蛋白质印迹法检测MSC中TGF-β1及Smad3的表达,用ELISA检测MSC分泌TGF-β1的能力;③观察不同剂量(0、5、10、15、20 ng/ml)TGF-β1对再障患者骨髓MSC成脂分化和增殖的影响.以7名健康成人的骨髓MSC相应检测为对照.结果 再障患者骨髓MSC经4 d培养后即分化为脂肪细胞,而健康成人骨髓MSC中仅见少量细胞出现脂肪滴.再障患者MSC培养4和8 d时LPL基因表达水平分别为0.091±0.028、0.142±0.033,均高于健康成人骨髓MSC(分别为0.021±0.011及0.049±0.010,均P＜0.01);而TGF-β1及Smad3表达水平明显低于健康成人骨髓MSC,TGF-β1分泌水平(3.4 μg/L±0.9 μg/L)也明显低于健康成人骨髓MSC(11.6 μg/L±1.2 μg/L,P＜0.01).在向脂肪细胞分化过程中,仅加入5 ng/ml的TGF-β1即可明显抑制再障患者骨髓MSC向脂肪细胞定向诱导分化,同时促进其增殖.结论 再障患者骨髓MSC中TGF-β1及Smad3表达水平的显著下调可能参与了再障的部分发病环节.
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异常行为量表评估干细胞治疗儿童孤独症的临床疗效及效度评价
目的 探索脐血单核细胞( CBM NCs)与脐带间充质干细胞(UCMSCs)治疗儿童孤独症的初步疗效,并对异常行为量表(ABC)的效度进行评价.方法 选取2009年3月- 2009年9月在山东省交通医院住院行干细胞治疗的儿童孤独症患者23例,分为CBMNCs+康复训练治疗组(脐血组)和CBMNCs联合UCMSCs+康复训练治疗组(混合组)；选取在济南明天儿童康复中心行康复训练治疗的儿童孤独症患者14例为对照组.治疗组患者共接受4次干细胞治疗,每周1次,分别收集患者基线、首次治疗后2、4、8、16、24周的儿童孤独症评定量表(CARS)及ABC评分结果,评价干细胞治疗儿童孤独症的临床疗效,并检验ABC量表评价儿童孤独症临床疗效的效度.结果 ①混合组、脐血组与对照组ABC评分在随访时间内均有一定程度的下降,24周时下降百分比分别为59.9%、38.0%、17.4%,三组间ABC评分比较差异具有统计学意义(P＜0.05);②ABC分项分析:嗜睡、刻板行为因子6个月时混合组与脐血组和对照组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.05);混合组评分( 16.00±7.92,9.33±5.81)明显低于脐血组( 24.14±9.65,17.07±9.93)和对照组( 30.54±5.03,17.31±4.05);③ABC评分与CARS评分呈正相关,6个月时,两者之间相关系数r= 0.87 (P＜0.001).结论 应用干细胞联合康复训练治疗儿童孤独症疗效显著高于单纯康复训练治疗;对于ABC量表中嗜睡与刻板行为因子分析,三组都有显著改善,且CBMNCs联合UCMSCs+康复治疗组的疗效好；ABC量表在评价儿童孤独症临床疗效时具有较高的效度.
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IL-12双亚基共表达载体的构建及其在人骨髓间充质干细胞中的表达
目的 构建人IL-12(hIL-12)p40和p35双亚基真核共表达载体并转染人骨髓间充质干细胞(hMSC).方法 根据hIL-12 p40和p35亚基全长cDNA序列分别设计合成引物行PCR扩增,将扩增所得p40和p35片段采用overlap PCR法拼接,获得的rhIL-12融合基因与pGEM-T Easy质粒连接,将鉴定正确的pGEM-T/rhIL-12重组质粒克隆至pcDNA3.1(+)真核表达质粒中,构建pcDNA3.1(+)/rhIL-12真核表达载体,并进行测序鉴定.将鉴定正确的pcDNA3.1(+)/rhIL-12经脂质体介导转染hMSC,同时以转染pcDNA3.1(+)空质粒作为对照组,在倒置显微镜下观察细胞生长形态;在转染后第4天采用蛋白质印迹法检测细胞培养上清液中rhIL-12融合基因的表达:另分别在转染后第2、4、6、8、10、12、14天,采用ELISA方法检测细胞培养上清液中rhIL-12融合基因的表达水平.结果 PCR扩增结果显示特异性扩增出p40(1000 bp)、D35(600 bp)、rhIL-12(1600 bp)片段,均与预期DNA表达片段大小一致.pcDNA3.1(+)/rhIL-12测序显示克隆的rhIL-12基因序列与报告序列完全相同.倒置显微镜下观察,可见转染pcDNA3.1(+)/rhIL-12的hMSC生长形态和生长速度与对照组hMSC相比均无明显差异.蛋白质印迹和ELISA检测显示,转染pcDNA3.1(+)/rhIL-12的hMSC培养上清液中可见rhIL.12融合蛋白的持续表达:而对照组中均未检测到rhIL-12融合蛋白表达.结论 成功构建了hIL-12 p40和p35双亚基真核共表达载体pcDNA3.1(+)/rhIL-12,为利用hIL-12进行非病毒载体抗肿瘤基因治疗奠定了基础.
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梗死心肌组织裂解液对鼠骨髓间充质干细胞诱导分化作用的体外研究
目的 探讨梗死心肌组织裂解液对骨髓间充质干细胞(MSC)向心肌细胞分化的诱导作用.方法 取SD大鼠梗死区心肌组织及其周围区域正常心肌组织分别制备梗死心肌组织裂解液和正常心肌组织裂解液;用Balb/c小鼠骨髓细胞进行MSC培养,取生长较好的第2代MSC制备MSC贴片,分别用DMEM培养基(空白对照组)、加入正常心肌组织裂解液的DMEM培养基(正常心肌组织裂解液组)和加入梗死心肌组织裂解液的DMEM培养基(梗死心肌组织裂解液组)培养.取各组培养14 d的MSC,透射电镜下观察细胞超微结构;并进行免疫细胞化学染色,观察α-肌动蛋白(actin)、心肌特异性转录因子4(GATA-4)、心肌特异性肌球蛋白重链(MHC)、心肌特异性肌钙蛋白T(cTnT)、心肌特异性肌钙蛋白I(cTnI)、心肌增强因子2(MEF-2)、连接蛋白(Cx)43和Cx45的表达情况.结果 超微结构观察显示空白对照组细胞器结构正常;正常心肌组织裂解液组细胞内未见明显的肌丝样结构;而梗死心肌组织裂解液组部分细胞内可见细小的肌丝样结构.免疫细胞化学染色分析显示,空白对照组MSC不表达心肌细胞特异性蛋白;正常心肌组织裂解液组MSC仅表达α-actin;而梗死心肌组织裂解液组MSC表达α-actin、GATA-4、MHC、cTnT、cTnI和MEF-2等心肌特异性标志蛋白,但不表达Cx43和Cx45.结论 梗死心肌组织裂解液可以诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化.
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脐带来源间充质干细胞的制备及其质量检定
目的：研究脐带来源间充质干细胞（UC-MSCs）的扩增工艺及质量检验方法，提出质量控制标准，为临床研究提供合格的干细胞产品。方法新鲜脐带去羊膜及血管，剪碎，组织块放入无菌培养皿，在培养箱进行脐带间充质干细胞培养、扩增。细胞培养至 P3代，按照《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则》（征求意见稿）进行干细胞质量的全面检定。检定内容包括无菌检测，支原体检测，人源特定病毒及猪源病毒检测，内毒素检测，细胞形态、细胞数及细胞活率检测，染色体核型分析，干细胞免疫表型检测，STR 图谱分析，免疫抑制活性检测及分化能力检测。结果按照标准化流程对18根脐带进行了 UC-MSCs 的分离、纯化及培养，获得一致性较好的干细胞。通过对干细胞进行质量检定，很好地控制了干细胞的质量。干细胞活性在冻存前≥90%，冻存复苏后≥80%；该工艺生产的脐带MSC 产品无细菌、人源特定病毒及猪细小病毒、支原体等微生物污染，内毒素检测阴性；干细胞免疫表型检测 CD90、CD105呈阳性，阳性率不低于95%；CD31、CD34、HLA-DR呈阴性，阳性率不高于2%；染色体核型分析为46XX 或46XY，无缺失及插入突变；STR 图谱分析证实干细胞为单一人来源；UC-MSCs 具有成脂及成骨分化潜能；UC-MSCs能抑制异源淋巴细胞增殖。结论按本工艺及标准制备的 UC-MSCs 符合《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则》的质量控制标准，为同类干细胞制备及检定过程标准化提供了实验依据。
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细胞生长因子对正常氧和低氧条件下犬骨髓间充质干细胞迁移的影响
目的观察比较正常氧和低氧环境下，不同细胞生长因子对犬骨髓间充质干细胞迁移的影响。
方法抽取犬骨髓，采用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞并进行培养。在倒置显微镜下观察细胞的形态变化；取第3代细胞利用流式细胞术检测其表型特征；加入碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子和胰岛素样生长因子-1，在正常氧和低氧条件下行迁移和划痕实验来观察细胞趋化能力。
结果细胞迁移情况与氧环境及细胞生长因子的存在和种类均有关联。碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子和胰岛素样生长因子-1均能促进骨髓间充质干细胞的迁移，碱性成纤维细胞生长因子较其他细胞生长因子显示出更强的促进迁移作用，这种作用在低氧环境下更为明显。
结论低氧环境下骨髓间充质干细胞的迁移能力较正常氧环境下更强，碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子和胰岛素样生长因子-1的存在均有利于骨髓间充质干细胞的迁移。 -
雌激素对人脐带来源间充质细胞骨架和超微结构的影响
目的 研究在17β-雌二醇(E2)作用下人脐带间充质干细胞骨架、超微结构的形态学变化,并分析其骨架蛋白的表达情况及其可能的机制.方法 用三酶法分离培养人脐带问充质干细胞,流式细胞仪检测所得细胞表型.E2处理48 h后,用激光共聚焦显微镜观察肌动蛋白和纽蛋白的表达情况;用透射电子显微镜观察细胞超微结构的变化.结果 分离得到的人脐带间充质干细胞纯度达到95%以上;E2对肌动蛋白的形成和分布没有影响,但使纽蛋白的分布集中于核周:在E2作用下,人脐带问充质干细胞出现老化,自噬体增多,线粒体出现代偿性增加.结论 E2能改变人脐带间充质干细胞的细胞骨架和超微结构,从而可能影响其功能.
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不同代次人胎盘间充质干细胞的生物活性比较研究
目的旨在观察不同代次人胎盘间充质干细胞（PMSCs）体外培养的生物学特性和体外诱导分化潜能，为间充质干细胞临床应用安全性及有效性提供实验依据。方法无菌条件下获取人足月胎儿胎盘组织，通过 II 型胶原酶消化法分离 PMSCs，在常规培养条件下培养至第9代，倒置相差显微镜观察 P0、P3、P6、P9代次的间充质干细胞细胞形态；MTT 活细胞计数法检测细胞生长增殖能力；流式细胞术分析细胞周期及表面标志物的阳性表达率。同时进行成脂、成骨、成软骨诱导分化，诱导14 d 后分别进行油红 O 染色、茜素红 S 染色、Masson 染色鉴定，观察并比较不同代次 PMSCs 的多向诱导分化能力。结果 PMSCs 具有很强的贴壁能力，主要呈纺锤梭形，不同代次的 PMSCs 有不同的体外增殖能力，以 P0、P3代较强；均高表达 CD73、CD90、CD105，低表达 CD14、CD34、CD45和 CD20。细胞周期中 G0/G1期细胞所占比例 P0为90.95%、P3为88.97%、P6为85.93%、P9为67.89%，诱导分化实验显示，P6、P9代细胞多向诱导分化能力逐渐降低。结论提示在选择胎盘间充质干细胞作为种子细胞时，应注意选择适宜的扩增代数，以便既能保证足够的细胞数目又能保留细胞佳的分化能力。
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低氧环境对脐带间充质干细胞相关细胞因子表达的影响
目的：观察低氧环境对人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）分泌血管内皮生长因子（VEGF）、肝细胞生长因子（HGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、基质衍生因子-1（SDF-1）、干细胞因子（SCF）、胰岛素样生长因子（IGF-1）和粒细胞集落刺激因子（G-CSF）表达的影响。方法将第3代 hUCMSCs 分别置于20% O2（常氧组）和5% O2（低氧组）环境中培养，于8、24、32、48、56、72 h ELISA 法检测培养前及培养后上清液中 HGF、IGF-1、SDF-1、VEGF、bFGF、SCF、G-CSF 的浓度。结果低氧组培养上清液中 HGF、SDF-1、SCF、G-CSF 的浓度于培养后72 h 明显高于常氧组（P <0.05）；VEGF 的浓度于培养后56 h 明显高于常氧组（P <0.05）；bFGF 浓度于培养后32 h 明显高于常氧组（P <0.05）；IGF-1浓度在培养后较常氧组无明显变化（P >0.05）。结论脐带间充质干细胞培养后可持续表达细胞因子VEGF、HGF、IGF、bFGF、SCF、SDF-1和 G-CSF，且5%低氧培养环境可促进 VEGF、HGF、bFGF、SCF、SDF-1和G-CSF 的表达，但对 IGF-1表达无影响。
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MSCs-FGF2基因治疗对急性肺损伤小鼠的保护作用
目的：研究间充质干细胞-纤维母细胞生长因子2（MSCs- FGF2）基因治疗对脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠的保护作用。方法40只雄性 C57/B6小鼠随机分为对照组、急性肺损伤组、MSCs组、MSCs-FGF2组，每组10只。应用脂多糖建立小鼠急性肺损伤模型，观察4组小鼠肺组织病理改变、计算肺损伤评分、计算肺组织湿重与干重比值，计数支气管肺泡灌洗液（BALF）中中性粒细胞数量，实时 PCR方法检测小鼠肺组织 FGF2 mRNA表达，Western印迹法测定小鼠肺组织 FGF2蛋白表达，ELISA法测定小鼠 BALF中 TNF-α和 IL-6浓度。结果与急性肺损伤组小鼠比较，MSCs-FGF2组小鼠肺组织病理改变明显减轻、肺损伤评分明显降低（P <0.05）、肺组织湿重与干重比值明显降低（P <0.05）、BALF中中性粒细胞数量明显降低（P <0.05）、肺组织 FGF2 mRNA及蛋白表达量明显增加（P <0.05）、BALF中 TNF-α和 IL-6浓度明显降低（P均<0.05）。结论 MSCs-FGF2基因治疗对脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠有确切的保护作用。
关键词： 间质干细胞 纤维母细胞生长因子 2 急性肺损伤 小鼠 -
骨髓间充质干细胞在肿瘤血管生成过程中的作用
目的 研究人骨髓间充质干细胞(hMSC)在肿瘤血管生成过程中的作用.方法 通过梯度密度离心法及贴壁筛选法分离、培养hMSC;利用pLEGFP-N1逆转录病毒载体获得增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的hMSC(hMSC-EGFP);流式细胞仪检测hMSC-EGFP的免疫表型及分化能力;通过建立BALB/C裸鼠实体瘤模型(分别皮下接种乳腺癌细胞系MCF-7及hMSC-EGFP细胞与MCF-7混悬液)来观察hMSC在肿瘤血管生成过程中的作用;检测肿瘤细胞和内皮细胞条件培养基对hMSC细胞生长和迁移的影响;体外诱导hMSC向内皮细胞分化,观察其对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移的影响.结果 hMSC-EGFP与hMSC形态相似,均呈成纤维细胞样;二者具有相似的免疫表型,在条件基质作用下,均能被诱导分化为成骨细胞及脂肪细胞;hMSC能促进肿瘤血管生成,单纯接种MCF-7组肿瘤平均血管密度为5.33±1.42,混悬液组为13.67±1.53,差异有统计学意义(P<0.05);大部分血管是由hMSC植入体内引起的宿主源性血管新生,只有少数血管的内皮细胞是由hMSC植入体内分化而来的;肿瘤细胞和内皮细胞能够通过其旁分泌作用促进hMSC的生长和迁移;经内皮诱导2周后,hMSC呈CD31阳性;hMSC能促进HUVEC的迁移.结论 MSC具有促进肿瘤血管生成的作用.
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黑色素瘤细胞诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化的初步研究
目的 体外观察和分析小鼠黑色素瘤细胞B16诱导小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)向血管内皮细胞分化的现象和过程,初步分析肿瘤细胞分泌血管生长因子(VEGF)-a在该诱导过程中的时序关系.方法 利用Transwell系统进行BMSC与B16细胞共培养,利用免疫荧光、蛋白印迹、透射电镜等技术观察BMSC经B16诱导后向内皮细胞分化的过程,利用ELISA检测培养液内VEGF-a的水平.结果 BMSC表型鉴定为CD44+/CD73+/CD90+/CD105+/CD166+/CD34-/CIM5-/CD133-,经B16诱导后出现内皮细胞标志物VEGFR-1、VEGFR-2和第八因子(FⅧ)的表达并随时间延长而增强,共培养48 h后VEGFR-1、VEGFR-2及FⅧ均可见明显表达,72 h时VEGFR-2表达量较48 h时增加了1倍,FⅧ表达量增加了约3倍.共培养体系培养基中可检测到由B16细胞分泌的VEGF-a量随时间增多.结论 B16细胞可能通过分泌VEGF-a来诱导BMSC具备血管内皮细胞表型,提示BMSC在肿瘤血管生成中起了重要的作用.
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myocardin在骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化过程中的表达
目的 探讨通过条件培养液(CM)和高浓度血清即20%的胎牛血清(FBS)联合作用下,myocardin在骨髓来源的间充质干细胞向平滑肌细胞(SMC)定向分化过程中的表达特点.方法 采用伞骨髓贴壁法分离骨髓问充质干细胞,CM联合20%FBS诱导骨髓间充质干细胞,同时设立持续10%FBS、单20%FBS及单CM诱导下的骨髓间充质十细胞对照组和SMC阳性对照组,分别于诱导前及诱导3、7、10和14 d时观察细胞形态的变化,并在相应的时间点用免疫荧光法、逆转录聚合酶链反应法、Western blot半定量分析法榆测myocardin以及SMC表面各种标志基因的表达变化,用透射电镜检测诱导后细胞内肌丝存在以此来证实诱导分化成功.结果 光镜观察显示诱导前至诱导3、7、10和14 d时,骨髓问允质十细胞南纺锤形、多角形、扁平形和小圆形等多种形态逐渐转变为单一的长梭形,在诱导21 d后显示出明显的峰-谷特征.免疫荧光结果显示表达myocardin的阳性细胞数量逐渐增多,表达部位由胞质逐渐移向胞核,而表达平滑肌标志基因Ot一平滑肌肌动蛋白(Ot.SMA)、平滑肌肌动蛋白重链(SM-MHC)的细胞也随之增加,同时联合诱导后3、7、lO和14 d表达myocardin和平滑肌标志基因(α-SMA或SM-MHC)的双阳性细胞数逐渐增加.RT-PCR结果显示myocardin的mRNA表达逐渐上调,在诱导7 d达到高峰后表达基本稳定(P<0.05);平滑肌标志基因α-SMA及SM22α的表达随着myocardin表达上调而增加(r=O.81,P<0.05),诱导10 d后表达基本稳定.Western blot结果显示myocardin蛋白和平滑肌标志基因α-SMA蛋白表达量在诱导后明显增加(r=0.84,P<0.05).透射电镜结果显示诱导21 d后的分化细胞中有肌丝的存在.在不同时间点各组之间的差异有统计学意义(P<0.05).结论 CM联合高浓度的血清可有效诱导骨髓间充质干细胞向SMC分化,myocardin在此分化过程中起了重要作用.骨髓来源的间充质干细胞可以在诱导下定向分化成为SMC.
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myocardin基因沉默在PDGF-BB诱导小鼠骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞分化中的作用
目的 构建myocardin特异性siRNA真核表达载体,体外观察其对myocardin基因的沉默效应及对小鼠骨髓间充质干细胞(MSC)向平滑肌样细胞分化过程中的影响.方法 培养小鼠骨髓问充质干细胞并利用血小板源生长因子(PDGF-BB,50 mg/L)联合高浓度胎牛血清(20%FBS)诱导其向平滑肌样细胞分化;构建含U6启动子和myocardin特异短发卡RNA(shRNA)编码序列的质粒载体pGen-myo-shRNA,以含非特异性shRNA编码序列的质粒载体pGenesil-Con(pCon)为阴性对照,分别转染诱导培养后第6天的小鼠MSC,48 h后用RT-PCR技术检测细胞内myocardin在mRNA水平的表达;同时用免疫组织化学方法 检测平滑肌肌球蛋白重链(sM myosin heavy chain,SM-MHC)的表达来鉴定平滑肌样细胞的分化.结果 成功构建myocardin特异性siRNA真核表达载体,利用其沉默myocardin基因后,干扰组相比空白对照组myocardin mRNA表达下调42.86%,差异有统计学意义(P
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体外传代培养成体大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的观察
目的 观察成体大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)体外培养过程中生物学特性的改变,为骨髓间充质干细胞的应用研究提供实验依据.方法 成体大鼠骨髓MSC的分离培养,流式细胞仪观察MSC免疫表型及细胞周期,检测细胞的诱导分化能力以及细胞的生长曲线,TRAP-ELISA方法检测其端粒酶活性.结果 体外培养的成体大鼠MSC,随着传代次数的增加,长梭形细胞的体积逐渐增大.第4代时免疫表型阳性细胞率分别为CD29:(94.75±3.68)%,CD71:(95.43±2.23)%,CD90:(98.08±3.88)%;当传到第7代时,阳性细胞率仅为CD29:(50.00±3.35)%,CD71:(50.70±2.43)%,CD90:(48.60±2.83)%;第9代时MSC检测不到任何阳性免疫表型.前5代MSC增殖较快,第3代时处于S期和G2/M期的细胞比例为(38.36±2.01)%,处于G0/G1期细胞为(61.64±2.13)%;第7代以后细胞增殖能力明显降低,第12代时处于S期和G2/M期的细胞为(10.83±1.63)%,而G0/G1期的细胞为(89.17±1.96)%,此时MSC已经基本停止增长.当体外培养的MSC传到第9代以后,在成骨和成脂肪诱导体系作用下,细胞丧失了分化为Von Kossa法染色和油红O染色阳性细胞的能力;同时其端粒酶活性也随着传代次数的增多由初的(52.7±0.78)%逐渐降低为阴性.结论 体外培养的成体大鼠骨髓MSC随着传代次数的增加,其生物学特性发生明显改变.
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骨髓间充质干细胞对庆大霉素致大鼠急性肾衰竭的保护作用
目的 观察骨髓间质干细胞(MSCs)对庆大霉素导致的急性肾功能衰竭(ARF)的保护作用和机制.方法 取雄性SD大鼠骨髓,体外分离、扩增培养MSCs,DAPI标记.60只雌性SD大鼠建立中毒性ARF动物模型(颈部皮下注射庆大霉素150 mg·kg-1·d-1,连续5 d)随机分为2组:(1)MSCs组(M组,n=30):每次给予庆大霉素的同时经尾静脉静注MSCs细胞悬液0.5 ml(5×106 /只);(2)DMEM-F12组(D组,n=30):方法同上,注入无血清DMEM-F12 0.5 ml.分别在实验第6、8和12天各取10只处死动物取得血液和肾脏标本,测定血BUN和Scr,进行肾脏组织学评分(HSK),检测肾小管上皮细胞凋亡指数(TUNEL染色)、增殖细胞核抗原(PCNA)、Bcl-2和Bax的表达(免疫组化染色),并观察DAPI标记的MSCs在受体大鼠肾脏的分布情况.另取10只雌性大鼠作为对照(C组).采用单因素方差分析法(One Way ANOVA)和Dunnett-t检验进行统计学分析.结果 在各观察时间点,M组的BUN、Scr和HSK评分均明显低于D组;肾组织内PCNA+细胞数在实验第6天高于D组,在实验第8天和第12天则低于D组;M组各时间点Bcl-2表达均高于D组,Bax表达、Bax/Bcl-2比值和细胞凋亡指数均低于D组.整个实验期间未发现MSCs定位于肾组织中.结论 外源性MSCs可以促进ARF损伤后肾小管上皮细胞的增殖和减少细胞凋亡,增加Bcl-2和抑制Bax表达,从而有利于肾小管损伤的早期恢复.
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粒细胞集落刺激因子联合自体骨髓间充质干细胞移植治疗脑卒中的护理
探讨自体骨髓间充质干细胞移植治疗脑卒中的护理措施.对40例患者给予心理护理、骨髓动员期护理、骨髓采集围手术期护理、静脉移植护理、康复护理等措施,取得了理想的效果.提示科学、规范的护理措施在整个治疗过程中具有至关重要的作用.
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人脐带血间充质干细胞体外分离培养研究
目的:探讨人脐带血来源间充质干细胞体外分离及培养方法.方法:采用Ficoll-paque(1.077 g/ml)分离液密度梯度离心法结合直接贴壁分离人脐带血单个核细胞中间充质干细胞(MSCs),20%FBS/DMEM培养,培养至48 h换液并将其上清加入另一培养皿继续培养.观察2个时期细胞贴壁情况;应用流式细胞仪检测各时期细胞.结果:密度梯度法分离来脐血单个核细胞进行培养,可观察12 h即可见少量细胞贴壁生长,绝大部分MSCs在96 h内完成贴壁,经传代纯化第1、2个48 h贴壁细胞均可培养出形态呈较均一长梭形细胞.流式细胞仪检测:单个核细胞中CD44+细胞比例占7.1%、CD34+占28.9%,而在第1个48 h贴壁细胞CD44+、CD34+比例分别占47.2%、6.7%;而第2个48 h贴壁细胞CD44+、CD34+分别占53.3%、4.6%.结论:人脐血间充质干细胞能在体外分离培养,贴壁细胞稳定表达MSCs相关抗原.
