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纳米晶胶原基骨与骨髓间充质干细胞复合培养对表型影响
目的:观察纳米晶胶原基骨(nano-Hydroxyapatite/collagen,nHAC)与骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSC)复合培养前后的表型变化.方法:仿生原理制备nHAC,体外培养MSC并与材料复合,通过碱性磷酸酶染色和流式细胞仪观察MSC与材料的前后表型.结果:MSC可以nHAC在上贴附、生长、繁殖、分化,复合前后表型一致.结论:nHAC是良好的支架材料,易与MSC复合,适合种子细胞的贴附、生长、增殖和分化,并对细胞表型无影响,证实纳米晶胶原基骨是组织工程良好的载体材料.
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人脐带Wharton's jelly源性干细胞的分离、培养和表型鉴定
目的:探讨人类脐带Wharton's jelly来源干细胞的分离、培养和表型鉴定.方法:剔除人类脐带动静脉,获得脐带Wharton's jelly组织,应用组织块贴壁法进行培养,以流式细胞法行细胞表型鉴定.结果:分离出的人类脐带Wharton's jelly组织,在培养后3～7 d可见细胞从组织块爬出,主要表现长梭形的成纤维样细胞,2周左右可达80%汇合,这些细胞表达间充质干细胞的标记物CD105、CD73、CD90、CD54、CD44,而不表达造血和内皮标记物CD34、CD45、CD106和CD133.结论:应用组织块贴壁法可以从人脐带Wharton's jelly中分离、培养出干细胞,它们表达间充质干细胞的标记物.
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骨髓间充质干细胞研究进展
骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived Mesenchymal stem cells,骨髓MSCs) 是骨髓内除造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSC)之外的另一类干细胞,是骨髓造血微环境的重要组成部分,在体内外均具有支持和调控造血的作用.因其比较容易贴壁和形成成纤维样的克隆,因此也称成纤维细胞集落形成单位(Colony forming unit fibroblast,CFU-F).又由于它们来自骨髓的支持结构,并作为滋养层支持造血干细胞的生长,因此也有人称其为骨髓基质细胞 (Bone marrow stromal cells,BMSCs).近年来,随着组织干细胞研究的兴起,特别是对组织干细胞可塑性的深入研究,使得骨髓MSCs的发育潜能、体外分离、纯化、诱导分化方法等的研究有了很大进展.同时,由于骨髓MSCs具有易分离、扩增以及体外操作简便等特点,使其在组织工程、细胞移植、基因治疗等领域具有十分广阔的应用前景.
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过表达肝细胞核因子4 alpha对人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的作用
目的 应用转基因技术将肝细胞核因子4 alpha(HNF-4α)转导入人骨髓间充质干细胞(MSCs)内,使其连续过表达HNF-4α并促进MSCs向肝样细胞分化.方法 HNF-4α基因通过慢病毒表达载体pLV/Final-puro-hHNF4α-hrGFP转入人MSCs(UE7T-13细胞)内,用流式细胞分析法检测及分选后,收集hrGFP阳性的UE7T-13细胞进行扩增.体外成肝诱导一周后,免疫荧光染色检测过表达HNF-4α基因的UE7T-13细胞(E7-hHNF-4α细胞)的白蛋白(ALB)和细胞角蛋白(CK18)的表达情况,糖原染色检测UE7T-13细胞及E7-hHNF-4α细胞的糖原储存功能.结果 建立稳定、过表达hH-NF-4α基因的E7-hHNF-4α细胞,持续过表达HNF-4α促进MSCs向肝样细胞分化,经过7天体外成肝诱导,E7-hHNF-4α细胞具有成熟肝样细胞表达ALB和CK18蛋白及糖原储存功能.结论 利用Gateway技术可将HNF-4α高效转导入人MSCs细胞中,并有效促进MSCs向肝样细胞分化.
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干细胞移植治疗原发性骨质疏松症
我国是骨质疏松症患者人口大国,其中大多数为原发性骨质疏松症.积极深入探求病因,对治疗原发性骨质疏松症有重要意义.干细胞衰老及功能退化与骨质疏松症的发病密切相关.干细胞的衰老导致其增殖能力下降,成骨分化能力下降,成脂分化能力增强,骨矿盐沉积减少,进而导致骨细微结构破坏,整体骨质疏松.研究人员尝试将干细胞自体、同种异体或者基因修饰后移植到骨质疏松位点发现能够有效增加移植位点的骨量,提高骨密度,增强骨的机械强度,改善骨质疏松症状.通过干细胞移植增加骨量有望成为治疗骨质疏松症的新途径.
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间充质干细胞治疗原发性干燥综合征的研究进展
干燥综合征是一种侵犯外分泌腺，累及多脏器、多系统，以高度淋巴细胞浸润为特征的慢性炎症性自身免疫性疾病。目前发病机制尚未明确，治疗仍停留在改善症状，提高患者生存质量，阻止疾病进展阶段，尚无根治性方法。近年来间充质干细胞作为治疗自身免疫性疾病的一种新方法已成为研究热点，本文就间充质干细胞与自身免疫性疾病及治疗原发性干燥综合征的相关研究进展进行综述。
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间充质干细胞移植修复椎间盘退变的研究进展
下腰痛影响了不少人的生活和工作，造成沉重的社会、经济负担。下腰痛主要的原因是椎间盘退变，目前临床上治疗椎间盘退变的方法有保守治疗和椎体融合等手术治疗，这些方法可以缓解症状但是不针对退变的原因。通过恢复椎间盘功能来缓解疼痛的方法受到人们关注，利用组织工程学方法逆转椎间盘退变已经实现。成体间充质干细胞可以分化为髓核样细胞为椎间盘组织工程提供了种子细胞。目前这种方法初步应用于临床前研究，但是许多问题有待进一步解决，例如间充质干细胞在宿主椎间盘中如何生存和增殖，移植过程中是否需要生物支架以及移植的安全性等。
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间充质基质细胞对脊髓损伤的神经保护机制
间充质基质细胞(MSCs)以其取材方便、自体移植、免疫原性低等独特的生物学特征,成为包括脊髓损伤在内的多种疾病治疗领域的研究热点及具有良好的临床应用前景.MSCs可通过释放营养因子、抑制炎症反应等多条途径发挥神经保护作用,在脊髓损伤的治疗领域有很广阔的应用前景.
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无缝线骨髓间充质干细胞羊膜移植治疗兔角膜新生血管的实验研究
目的：探讨无缝线骨髓间充质干细胞（bonemarrowmesenchymestemcells，BMMSCs）羊膜移植在兔角膜缘干细胞缺损模型的应用效果。方法选择新西兰白兔36只（72眼），制作兔角膜缘干细胞缺损模型第7天随机分为两组：实验组进行无缝线BMMSCs羊膜移植术组，对照组进行单纯羊膜移植术。分别于术后1、2、3、7、14、28d观察眼压情况、角膜新生血管、角膜透明度、前房反应及泪液分泌情况，术后1周和1个月每组各处死3只兔，摘除眼球，12眼（两组各6眼）作病理切片检查，HE染色观察比较炎症细胞和角膜上皮细胞形态并进行细胞计数。结果裂隙灯检查眼压、前房反应和并发症在组间各时间点差异无显著性（P均＞0.05）。而术后1个月泪液分泌、角膜新生血管和透明度组间比较差异有统计学意义（tCNV＝5.692，tCT＝6.316，tST＝9.197，P均＜0.05），HE显示两组角膜上皮数有显著性差异（t＝7.287，P＜0.05），炎症细胞数也有显著性差异（t＝9.178，P＜0.05）。结论无缝线BMMSCs羊膜移植应用于兔角膜新生血管中炎症反应小，泪液分泌影响少，角膜透明度高。
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间充质干细胞治疗重症急性胰腺炎临床疗效的观察
目的 探讨间充质干细胞(MSCs)在重症急性胰腺炎(SAP)治疗中的疗效、安全性及相关不良反应.方法 收集2010年1~12月SAP患者20例,随机分为常规组和MSCs组.MSCs组入院后第3天及第10天外周静脉注射MSCs,剂量为1×106个/kg.治疗过程中观察两组患者生命体征,肝、肾功能,定期复查患者CT征象、白细胞计数、血、尿淀粉酶、血小板活化因子、TNF-α、IL-6、IL-8等指标的浓度,并对比两组患者的死亡率、并发症的发生率、手术率、平均住院时间和出院后随访情况.结果 (1)两组手术率、并发症的发生率比较无统计学差异(P>0.05);MSCs组的平均住院时间较常规组明显缩短,两者比较有统计学差异(P<0.05);出院后半年内,MSCs组患者复发率及并发症的发生率低于常规治疗组,但两者比较均无统计学差异(P>0.05).(2)MSCs组患者的CT征象及白细胞计数,血、尿淀粉酶,C-反应蛋白,血小板活化因子,TNF-α、IL-6,IL-8等指标浓度较常规组明显改善.结论 MSCs治疗可能有助于改善急性胰腺炎的炎症反应,有并发症少、缩短住院时间等优势.
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干细胞联合移植对神经系统疾病改善作用的初步观察
目的 观察采用神经干/祖细胞(NSPC)和脐带间充质干细胞(MSCs)联合治疗对神经系统后遗症状的改善作用.方法 选择3例以运动功能受损为主的神经系统疾病(病程＞2年)病例,分别是遗传性共济失调、脊髓灰质炎后遗症和脑梗死后遗症,联合采用NSPC和脐带间充质细胞移植,每周1次,2例治疗4次,1例治疗2次.途径为经脑脊液(腰椎穿刺)、经静脉及损伤靶点定向注射,以世界神经病联合会国际合作共济失调量表(ICARS)评定运动功能的改变.结果 每例患者的运动功能均有改善,治疗前ICARS平均评分为19.7,治疗后平均评分为14.7.副反应主要为在治疗后出现短暂的低热和头晕,均自行消失.从移植途径上看,脑脊液和损伤靶点处注射较静脉输注疗效明显.结论 我们的结果表明,NSPC和MSCs细胞联合移植是安全的,对于神经系统疾病后遗运动功能障碍,至少短期内(1个月内)是改善作用的,但是确定的结论尚需在将来积累更多的样本,更长的观察期限和设立严格对照的研究后得出.
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密度梯度离心和贴壁筛选法分离培养兔骨髓间充质干细胞的形态学观察
目的 探讨兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)分离培养、鉴定和扩增的方法,同时观察BMSCs的生长特性,为组织工程中种子细胞的选择提供实验基础.方法 应用密度梯度离心法和贴壁培养法相结合分离纯化BMSCs并进行体外扩增,倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况,计数细胞数目,绘制细胞生长曲线.HE染色光镜观察细胞形态,免疫细胞化学方法检测细胞表面标志抗原CD29、CD34和CD44的表达,进行表型鉴定.结果 成功地完成了兔BMSCs体外分离培养及扩增.生长特性观察发现,第1~3代细胞增殖能力强,生长旺盛,随着传代次数的增加传代细胞增殖能力逐渐下降.分离培养的BMSCs阳性表达CD29、CD44,阴性表达CD34.结论 体外应用密度梯度离心法和贴壁培养法相结合,可获得高纯度的BMSCs,培养的BMSCs呈纤维状、克隆样生长,第1~3代细胞活性较强,可作为组织工程的种子细胞用于进一步的实验研究.
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骨形态蛋白2诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的实验研究
目的 观察骨形态蛋白2体外诱导骨髓间充质干细胞(BMMSCs)定向分化为心肌样细胞的作用.方法 采用密度梯度离心法分离大鼠BMMSCs,取第4代BMMSCs进行诱导:骨形态蛋白2组(BMP-2,终浓度为10 μg/L),空白对照组.诱导24h后更换常规培养液继续培养4周.倒置相差显微镜观察细胞的形态学变化,免疫荧光染色法鉴定诱导后BMMSCs中心肌特异性肌钙蛋白I(cTnI)的表达,Western Blot检测诱导2周和4周后Cx43以及cTnI的表达量,流式细胞计数法计算心肌样细胞诱导分化率.结果 原代培养的BMMSCs 2周形成集落,呈梭形或星形.传代细胞体积变大,诱导后细胞呈长梭形,呈一致性生长,并出现肌岛样结构.免疫荧光染色结果显示诱导后BMMSCs表达cTnI.Western Blot检测结果提示诱导后Cx43以及cTnI均明显增多,4周组明显高于2周组.流式细胞计数法显示:BMP-2组心肌样细胞诱导率为(17.9±0.8)％.结论 骨形态蛋白2可在体外诱导大鼠BMMSCs定向分化为心肌样细胞,其诱导分化率高.
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人胃癌组织中间充质干细胞的生物学稳定性分析
目的 对从人胃癌组织分离培养的间充质干细胞(hGC-MSCs)进行生物学特性的研究分析,为hGC-MSCs及肿瘤的研究提供研究基础和理论依据.方法 采用组织块贴壁法从新鲜的胃癌组织中分离培养hGC-MSCs,倒置相差显微镜下观察hGC-MSCs细胞形态,计数板计数并绘制hGC-MSCs生长曲线以观察细胞的增殖能力,染色体G显带实验观察hGC-MSCs核型情况,流式细胞术检测hGC-MSCs表面抗原的表达,使用诱导分化液体外诱导hGC-MSCs向成骨细胞和脂肪细胞分化.结果 成功从人胃癌组织中分离培养hGC-MSCs;hGC-MSCs在倒置相差显微镜下呈梭形或多角形的成纤维样细胞,细胞间平行排列呈漩涡状或辐射状;生长曲线示细胞增殖能力很强,并随着传代有所降低;G显带核型分析细胞为正常的二倍体,无染色体异常;hGC-MSCs表面抗原高表达CD13、CD44和CD90,低表达CD45、CD34和HLA-DR;诱导分化实验显示hGC-MSCs具有多向分化潜能.结论 人胃癌组织中存在hGC-MSCs,对其进行生物学特性研究发现生物学特性稳定,未发现恶性转化.hGC-MSCs的研究,对肿瘤微环境的研究及MSCs的临床应用有重要的价值.
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大鼠骨髓间充质干细胞促进超比例任意皮瓣成活的初步实验研究
目的 观察大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)对超比例任意皮瓣成活的影响.方法 采用全骨髓贴壁培养法获得大鼠骨髓间充质干细胞,通过成骨、成脂肪诱导分化以及流式细胞仪分析其表面标记鉴定BMSCs特征;在SD大鼠背部形成超比例任意皮瓣模型,将BMSCs皮瓣内注射治疗,与生理盐水作对照.观察皮瓣大体情况,计算皮瓣成活率.结果 全骨髓贴壁培养法获得的BMSCs经诱导后可分别向成骨、成脂转化;流式分析表面标志分子高表达CD90、CD29,低表达CD34、CD45.皮瓣术后2周,皮瓣成活与坏死部分界限清楚,BMSCs治疗组皮瓣成活率明显高于生理盐水组.结论 BMSCs可明显增加超比例任意皮瓣成活面积,其在临床治疗中有潜在的应用和研究价值.
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Plenti6.3/V5-TERT慢病毒载体的构建并成功建立永生化大鼠骨髓间充质干细胞系的研究
目的 为实现慢病毒感染后可用抗生素筛选TERT基因稳定整合的骨髓间充质干细胞,首先对pCI-neo-TERT质粒进行了改造和构建.方法 将pCI-neo-TERT酶切后得到TERT片段,并进行PCR扩增,将得到的TERT片段连入Plenti6.3/V5,酶切鉴定载体构建正确后,将改造和构建载体分别与辅助质粒psPAX2、pMD2.G共转染HEK-293T包装细胞,收获病毒上清并感染靶细胞,使用相应抗生素筛选细胞,验证抗性基因的插入.结果 成功构建了重组慢病毒载体Plenti6.3/V5-TERT,通过调整病毒上清的用量可以使靶细胞达到很高的感染效率;用相应抗生素筛选细胞证明了抗性基因的表达.结论 我们成功构建了慢病毒载体Plenti6.3/V5-DEST-TERT,从而使病毒感染后用抗生素筛选稳定整合TERT的骨髓间充质干细胞成为可能.
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间充质干细胞对窒息新生大鼠合并多脏器损伤的影响
目的 研究大鼠骨髓来源的间充质干细胞(MSCs)对窒息新生大鼠引致的多脏器损伤的影响及相关机制.方法 采用贴壁选择法分离、培养、扩增大鼠骨髓来源MSCs,以PBS按要求稀释供注射用;3日龄清洁级SD新生大鼠32只,随机分为窒息+ MSCs组(A组)、空气+MSCs(B组)、窒息对照组(C组)、正常对照组(D组)四组;A、C组均先将大鼠置于密封瓶中密闭30 min,再予氧罩吸氧2 h[氧浓度(60±5)%];B、D组同时置于密封瓶中,但瓶口不密闭,也不予吸氧.模型结束后,A、B组每只大鼠腹腔注射5×104的MSCs,而C、D组仅注射相同容积的PBS,72 h后(6日龄)处死全部动物,组织病理学进行心、脑、肺组织病理评分;ELASA法检测心、脑、肺组织匀浆TNF-α含量及血清TNF-α、CK-MB、cTnT、S-100b、NSE水平.结果 (1)心脏、脑、肺组织四组病理学评分分别是1.79±0.22,0.34±0.13,2.33±0.27,0.34±0.08;3.06±0.33,1.29±0.14,4.30±0.47,1.15±0.10;2.31±0.56,0.46±0.20,3.06±0.33,0.44±0.18,差异有统计学意义(P均=0.000).(2)四组间血清TNF-α、CK-MB、cTnT、S-100b、NSE水平差异存在统计学意义(F=32.19,P=0.000;F=39.14,P=0.000;F=242.40,P=0.000;F=66.66,P=0.000;F=78.66,P=0.000).(3)以上各指标结果在A、C组均明显高于D组(均P<0.05),C组高于A组(P<0.05).(4)血清TNF-α水平与细胞因子及酶学改变呈正相关.组织匀浆TNF-α水平与相应组织病理评分也存在正相关(P均<0.05).结论 (1)新生大鼠窒息模型合并有多脏器损伤.(2)MSC对窒息新生大鼠多脏器损伤具有保护作用,可能与抑制损伤部位的炎症反应有关.
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超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞移植治疗兔脊髓损伤的磁共振活体示踪
目的 通过蛛网膜下腔置管,将超顺磁性氧化铁(SPIO)标记后的骨髓间充质干细胞(MSCs)移植入兔脊髓损伤模型,观察脊髓损伤MR活体示踪移植细胞的可行性.方法 制作兔SCI模型,并在蛛网膜下腔置管以备移植.将实验用大白兔随机分为三组:A组为移植SPIO标记细胞；B组为移植未标记细胞；C组不移植细胞只注射PBS液做对照组.在细胞移植后3d、7d、14 d、21 d,进行MR活体示踪,并做病理学检测进行对照.结果 SPIO标记的MSCs移植入脊髓损伤模型后7d,MR扫描的T2WI上脊髓损伤区域出现点状低信号影；14 d后T2WI上脊髓损伤区域的点状低信号影增多,21 d后T2WI上脊髓损伤区域的点状低信号影减少.脊髓损伤区域组织切片行普鲁士蓝染色,发现局部组织上出现大量含蓝色铁颗粒的细胞,其细胞变化规律与MR示踪结果一致.结论 蛛网膜下腔移植的SPIO标记MSCs可定向迁移到脊髓损伤区域,利用MR可对移植细胞进行活体示踪.
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骨髓间充质干细胞旁分泌作用对胰岛素瘤细胞功能的影响
目的 探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)旁分泌作用对胰岛素瘤细胞(INS-1)功能的影响.方法 体外分离、纯化大鼠BMSCs.应用链脲左菌素(STZ)诱导INS-1损伤、凋亡,建立BMSCs和INS-1共培养体系.本实验设立以下4组:INS-1,BMSCs对照组(CONI、CONB);INS-1损伤对照组(IINS-1);BMSCs与INS-1共培养组(CO-CUL);BMSCs与损伤INS-1共培养组(ICO-CUL).应用酶联免疫法测各组细胞培养上清液细胞因子,应用流式细胞仪和MTT法分别检测共培养后INS-1细胞的凋亡和增殖.结果 原代培养的BMSCs 14 d左右可达到80%～90%融合,第3代细胞强表达CD44、CD29(99%),不表达CD34、CD45(<1%);ICO-CUL组INS-1分泌胰岛素升至[(10.27±0.95)mU/L]较INS-1损伤对照组[(5.37±0.45)mU/L]明显增加(P<0.01);与CONB组相比,CO-CUL组BMSCs分泌胰岛素样生长因子(IGF-1)由(5.82±0.87)μg/L增至(10.00±1.44)μg/L(P<0.01);ICO-CUL组分泌量[(14.27±0.85)μg/L]比CO-CUL组[(10.00±1.44)μg/L]增加(P<0.01).MTT法检测ICO-CUL组INS-1的OD值(0.624±0.052)较INS-1损伤组(0.320±0.026)明显升高(P<0.01);流式细胞仪检测ICO-CUL组INS-1早期凋亡比例[(19.0±1.06)%]较ISN-1损伤组[(58.1±3.12)%]明显降低(P<0.01).结论 BMSCs旁分泌作用可以促进STZ诱导损伤的INS-1细胞增殖,抑制其凋亡;促进INS-1细胞分泌胰岛素;损伤的INS-1细胞可促进BMSCs分泌IGF-1.
关键词： 间质干细胞 胰岛素瘤 旁分泌细胞细胞间通讯 共培养 -
不同浓度透明质酸对骨髓来源间充质干细胞成软骨分化的影响
目的 探讨不同浓度透明质酸(HA)对骨髓来源间充质干细胞(MSCs)向软骨方向定向分化的影响.方法 取P3代未诱导的骨髓来源间充质干细胞,按培养液中添加的HA浓度不同分为两实验组,A组:低浓度组(基础培养基+HA 0.1 mg/ml);B组:高浓度组(基础培养基+HA0.2 mg/ml).同时设立空白对照组(基础培养基)及阳性对照组(基础培养基+10 ng/ml TGF-β3),观察细胞形态、增殖情况并绘制生长曲线,分别于诱导后第7、14、21天行免疫组化染色及RT-PCR检测细胞Ⅱ型胶原表达.结果 经添加软骨诱导剂后,干细胞的细胞增殖速度放缓,形态由长梭形变为多角形、椭圆形,胞质Ⅱ型胶原免疫组化阳性,RT-PCR检测示Ⅱ型胶原Mrna表达阳性,表现出软骨细胞的分化特点,半定量分析显示两实验组Ⅱ型胶原表达无差异,但均比阳性对照组弱,空白对照组无Ⅱ型胶原表达.结论 不同浓度外源性HA诱导兔MSCs向软骨细胞分化的能力无差异,且均比TGF-β3的诱导能力弱.提示HA作为细胞外基质的主要成分,有促进MSCs向软骨细胞分化的作用,但改变外环境中HA浓度不会影响MSCs的软骨分化.自体关节腔内环境支持以干细胞为基础的组织工程化软骨修复软骨缺损.
