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人脐带间质干细胞分离纯化及基本生物学特性研究
目的探讨人脐带间质干细胞(MSC)的分离、纯化、扩增方法,研究其基本生物学特性.方法无菌条件下收集剖宫产新生儿脐带,分别用组织块贴壁法和酶消化法获取脐带间质干细胞,进行原代培养.应用DMEM/F12培养液进行纯化和扩增培养.用流式细胞仪检测MSC的细胞表面标志.绘制细胞生长曲线并测定细胞周期.结果两种分离方法均可获得MSC,原代培养12～14 d后可达90%融合,细胞可传代20代以上.流式细胞仪检测结果显示,脐带MSC强表达CD13、CD29、CD44、CD105,弱表达CD106,不表达CD34、CD11a、CD14、CD31、CD45.结论脐带MSC在体外有较强的增殖能力,可作为组织工程的种子细胞.
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脂肪来源间充质干细胞的研究进展
脂肪来源的间充质干细胞与骨髓间充质干细胞具有相似的表面标记及分化潜能.因其具有来源丰富、采集方便、扩增速度快且多向分化能力强等优点,目前已成为组织工程研究的热点.其将在未来的细胞替代疗法、组织器官移植和基因治疗等领域具有广阔的应用前景.
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DNMT3B对人脐带间质干细胞成骨分化能力的影响
目的 研究DNA甲基化转移酶3B(DNA methyltransferase 3B,DNMT3B)调控人脐带间质干细胞骨生成的作用.方法 利用RNA干扰法获得两株DNMT3B基因低表达的人脐带间质干细胞(Human Umbilical Mesenchymal Stem Cells,hUMSCs).在使用qPCR和免疫组织化学法确定DNMT3B表达缺失后,对hUMSCs进行骨生成定向诱导分化.并利用免疫组织化学法和茜素红染色评价突变型和野生型hUMSCs成骨能力差异.结果 由RNA干扰获得的两株突变型hUMSCs中两株突变型中DNMTI3B表达量分别下降至野生型hUMSCs的12.67 ±0.45％和35.60 ±0.76％(P ＜0.05).而在DNMT3B突变型hUMSCs中间质干细胞标记物CD73和CD90基因mRNA的表达水平也分别下降(P＜0.05).CD73水平分别是野生型细胞的15.83 ±0.44％和16.60±0.37％(P ＜0.05)；CD90的水平分别是野生型细胞的35.23 ±0.30％和58.64±0.71％(P ＜0.05).在骨生成过程中,免疫组化染色后镜下比较显示DNMT3B突变型的细胞表达Osteocalcin较正常细胞低,qPCR结果表明RUNX2,IBSP和ALPL基因的mRNA表达量水平较正常细胞均明显下降(P＜0.01),其中shD3B-1和shD3B-2的RUNX2基因表达水平分别为正常细胞的55.09±0.53％和53.77 ±0.47％(P＜0.01)；IBSP基因表达水平分别为正常细胞的53.21 ±0.81％和41.75±0.44％(P＜0.01)；ALPL基因表达水平分别为正常细胞的15.55±0.10％和17.86±24％(P＜0.01).同时茜素红染色检测也显示其成骨后细胞成骨功能减弱.结论 DNMT3B突变或缺失会导致hUMSCs骨生成能力下降.
关键词： 骨生成 间质干细胞 DNA甲基化转移酶3B DNA甲基化 -
肿瘤相关成纤维细胞的来源和分子机制
肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)不仅在细胞外基质的沉积,而且在肿瘤的生长、进展和转移中发挥重要作用.正常成纤维细胞、上皮细胞,内皮细胞和间质干细胞被认为是CAFs的主要来源.本文对CAFs的来源、分子机制和可能的潜在治疗靶作一综述.
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人脐带间充质干细胞分离培养及表面标志检测
目的 探讨体外分离培养人脐带源间充质干细胞(hUCMSC)的方法,并检测hUCMSC的表面标志.方法 分离脐带华通胶(Wharton's jelly),将其剪碎后利用组织块贴壁法培养获得hUCMSC,生长至一定密度后进行传代,采用流式细胞术检测第3代hUCMSC表面标志.结果 由人脐带华通胶可方便、有效地获得hUCMSC,其体外生长形态类似成纤维细胞,并可稳定增殖和传代.hUCMSC表面标志CD29、CD44、CD105高表达,而表面标志CD45、CD34、HLA-DR、HLA-G、CD80、CD86不表达.结论 利用人脐带华通胶组织块培养可有效获得hUCMSC,为组织工程提供丰富的细胞来源.
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骨髓间充质干细胞治疗慢性移植物抗宿主病后患者外周血T细胞受体V β亚家族谱系变化研究
目的 研究输注骨髓间充质干细胞(MSC)治疗慢性移植物抗宿主病(cGVHD)后患者外周血T细胞受体(TCR)Vβ基因谱系变化及克隆性增殖情况.方法 1例经异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后发生cGVHD的患者接受MSC治疗,分别于第1次输注MSC后第1、5天及第2次输注MSC后第1、10、20天采集外周血,同时将输注的MSC作为对照,利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增单个核细胞中24个TCR V β基因的互补决定区3(CDR3),PCR产物经荧光标记和基因扫描分析CDR3长度,从而确定T细胞的克隆性.结果 患者输注的MSC不表达全部TCR V β亚家族,第1次输注MSC后第1天也未发现TCR Vβ亚家族的表达,随后的时间点分别出现了3、10、14、10个Vβ亚家族的克隆增殖T细胞,增殖形式以寡克隆、多克隆为主;临床判断cGVHD表现减轻.结论 MSC对allo-HSCT后患者免疫功能的恢复有一定作用,并能减轻cGVHD效应;TCR V β亚家族谱系分析提示有部分优势表达.
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重组腺病毒介导血小板衍生生长因子感染人类脐带间质干细胞的实验研究
目的 检测重组腺病毒方法介导血小板衍生生长因子(PDGF)对人类脐带间质干细胞(MSC)的感染能力,为将其用于基因治疗奠定基础.方法 反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法扩增人类PDGF的cDNA序列,构建重组病毒载体AdPDGF.分离培养人类脐带MSC.体外以不同感染复数感染MSC后,流式细胞术检测感染效率,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)表达.锥虫蓝染色及四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测感染后细胞生存活力及增殖能力.酶联免疫吸附(ELISA)法检测细胞上清液中PDGF分泌水平.结果 成功构建病毒载体AdPDGF.其对MSC的感染效率随感染复数增加而增高,当感染复数为50时,达到高,为87.36%.未感染的MSC、感染AdPDGF和对照病毒的MSC活力分别为(97.8 ±2.3)%、(91.9 ±4.0)%和(92.8 ±4.0)%.增殖能力分别为(100 ±16.8)%,(95.9±12.0)%和(87.5±9.7)%,感染AdPDGF的MSC与两个对照比较差异均无统计学意义(P>0.05).感染48 h后MSC能有效分泌PDGF,感染复数为10、30、50时,PDGF分泌水平分别为(1.53±0.37)、(3.03 ±0.68)和(5.25±0.92)ng/ml,MSC-GFP及MSC组未检测到有PDGF分泌.结论 成功构建AdPDGF重组腺病毒并高效感染人类脐带MSC.
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多发性骨髓瘤患者间充质干细胞TAZ和Wnt/β-catenin基因表达及其骨潜能的研究
目的 研究多发性骨髓瘤(MM)患者骨髓间充质干细胞( MSC)成骨诱导后成骨转录共刺激因子( TAZ)和Wnt/β -catenin mRNA的表达,探讨多发性骨髓瘤骨病(MBD)潜在的治疗靶点.方法 体外分离培养10例初治MM患者及10名健康对照者骨髓MSC,体外诱导分化为成骨细胞,茜素红实验检测矿化物沉积、荧光定量反转录聚合酶链反应( RT-PCR)方法检测骨桥蛋白(OPN)、骨钙素(OC)、碱性磷酸酶(ALP)、核心结合因子α 1(Cbfα 1 )mRNA的表达,分析成骨细胞分化指标变化；荧光定量RT-PCR方法检测成骨细胞的TAZ、Wnt/β-catenin mRNA,分析两组间TAZ和Wnt/β-catenin mRNA表达差异.结果 骨髓MSC体外成骨诱导后,茜素红染色阳性,呈现明显红色钙化结节；实验组MSC诱导后与诱导前相比,成骨细胞分化指标OC、ALP、Cbfα 1 mRNA表达增高[(2.0958±0.5665、2.6670±0.3847、0.8463±0.3473)比(1.3487±0.9291、1.1452±0.6054、0.4439±0.2945)](t值分别为2.171、6.709、2.795；均P＜0.05)；对照组MSC诱导后与诱导前相比,成骨细胞分化指标OPN、OC、ALP、Cbfα 1 mRNA表达增高[(2.1096±0.8267、2.8991±0.3531、4.3045±0.2844、13273±0.4075)比( 1.2200±0.9091、0.8780±0.3927、1.9161±0.2684、0.6736±0.2513)](t值分别为2.289、12.103、25.134、4.411；均P＜ 0.05).MSC体外诱导成骨细胞,实验组与对照组相比,成骨指标OPN、OC、ALP、Cbfα1 mRNA表达降低[(1.2710±0.5636、2.0958±0.5665、2.6670±0.3847、0.8463±0.3473)比(2.1096±0.8267、2.8991±0.3531、4.3045±0.2844、1.3273±0.4075)](t值分别为-2.650、-3.805、-10.822、-2.841；均P＜ 0.05).实验组骨髓MSC体外成骨诱导后TAZ、β-catenin mRNA( 2.2315±1.0723、0.5801±0.2159)比对照组( 4.4140±0.8325、0.9516±0.292)表达降低(t值分别为-5.085、-3.235；均P＜0.05).结论 骨髓MSC体外诱导细胞OPN、OC、ALP、Cbfα1 mRNA表达增高,成功诱导分化为成骨细胞；MM患者MSC 向成骨细胞分化潜能比健康人降低,TAZ和Wnt/β-catenin基因可作为MBD的潜在治疗靶点.
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环孢素A对人类骨髓间充质干细胞增殖活性的影响
目的 探讨环孢素A(CsA)对人类骨髓间充质干细胞(MSC)增殖活性的影响,为研究CsA对骨髓增牛异常综合征(MDS)患者骨髓MSC增殖的影响提供依据.方法 采用四甲基偶氮唑盐(MTT)微量酶反应比色法,经2.5×10~4、2.5×10~3、2.5×10~2、2.5×10 ng/μl CsA刺激后检测对照组和MDS患者骨髓MSC的吸光度(A值).结果 CsA不同质量浓度间骨髓MSC增殖效应差异无统计学意义(P>0.05);在(2.5×10～2.5×10~4)ng/μl质量浓度范围内,未观察到CsA有细胞毒性作用;MDS患者骨髓MSC增殖效应高于健康对照(P<0.01).CsA质量浓度与组别问交瓦作用差异无统计学意义(P>0.05).不同质量浓度CsA处理组与对照组骨髓MSC增殖效应差异无统计学意义.结论 CsA对MDS患者骨髓MSC和健康患者MSC增殖影响不明显.
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间充质干细胞在造血干细胞移植中的应用
间充质干细胞是一种能够从各种人成体组织分离出来的非造血多能干细胞,近年来,许多研究表明间充质干细胞具有免疫调节能力及促进组织重建等功能.就其在造血干细胞移植中的应用,如急慢性移植物抗宿主病(GVHD)、GVHD造成的移植失败、纯红细胞再生障碍性贫血及免疫性血小板减少性紫癜、出血性膀胱炎作以综述.
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骨髓间充质干细胞在血液系统疾病中的研究进展
骨髓间充质干细胞(MSC)是骨髓组织中具有多向分化潜能的一类非造血性干细胞,并可通过多种机制参与骨髓造血微环境调控及免疫功能调节,在组织工程、基因治疗、干细胞移植后移植物抗宿主病(GVHD)中应用前景广泛,是医学研究的热点.现就MSC在造血干细胞移植(HSCT)、再生障碍性贫血(CA)、多发性骨髓瘤(MM)中的研究现况及其潜在应用价值作一简要综述.
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间充质干细胞在移植中的作用
间充质干细胞(MSC)是一类具有高度自我更新及多向分化潜能的组织干细胞,易于在体外扩增,在造血干细胞移植(HSCT)及其他系统的移植中发挥重要的作用.详细阐述了MSC支持造血、促进植入,调节免疫及减轻移植后的移植物抗宿主病(GVHD)等方面的功能及机制,并对其在临床上的进一步应用提出建议与展望.
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间充质干细胞对肿瘤生长的影响
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是骨髓中除造血干细胞以外的另一种成体干细胞,因为其具有强大的自我更新能力和多向分化的潜能,MSC被越来越多地应用于血液等恶性疾病的治疗,并在再生医学及组织工程中广泛运用.但是,MSC对肿瘤的确切作用还未完全清楚,就MSC对肿瘤生长的影响及其相关机制作一综述.
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脐带间充质干细胞治疗造血干细胞移植术后造血重建缓慢三例
目的 观察脐带间充质干细胞(UCMSC)输注对造血干细胞移植后造血重建缓慢患者的临床疗效.方法 3例造血干细胞移植后造血恢复延迟的患者输注UCMSC,1次/周,每次1×106/kg,2～4次.结果 2例患者在输注UCMSC后1个月出现快速造血重建,1例患者在输注后1个月血型转为供者型,血红蛋白开始上升,但因间质性肺炎死亡.结论 UCMSC安全性高,不良反应轻,能有效促进造血干细胞移植后造血恢复,是移植后造血恢复延迟患者的有效治疗手段.
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间充质干细胞诱导体外分化来的初始T细胞表型变化的实验研究
目的 将体外由CD+34细胞分化而来的初始T细胞与异基因骨髓间充质干细胞(MSC)共孵育,观察初始T细胞表型的变化.方法 传3代以上的MSC与脐血CD+34细胞分化的初始T细胞共孵育1周.用流式细胞仪检测其表型变化.结果 与对照组相比,CD+8细胞明显增加[共孵育组(35.9±6.3)%,单纯初始T细胞培养组(18.4±4.5)%],且CD;CD;细胞明显增加[共孵育组(27.6±2.8)%,单纯初始T细胞培养组(15.2±3.1)%].结论 骨髓MSC在体外与异基因初始T淋巴细胞共孵育使CD+8初始T细胞表达增加,这种变化町能与其诱导免疫耐受相关.
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人类脐带源间充质干细胞细胞因子分泌及造血支持作用的研究
目的 研究脐带源间充质干细胞(UC-MSC)细胞因子分泌特征及其对脐血源CD+34细胞的造血支持作用,并与骨髓源间充质干细胞(BM-MSC)相对照.方法 RT-PCR法柃测UC-MSC和BM-MSC细胞凶子分泌.将脐血CD+34细胞分别接种于UC-MSC或BM-MSC滋养层共培养5周,收集贴壁与非贴壁细胞接种于标准甲基纤维素培养基,计数克隆形成细胞(CFC).结果 UC-MSC表达SCF、LIF、M-CSF、Flt-3、IL-6、GM-CSF、G-CSF、SDF-1和VEGF mRNA,不表达IL-3 mRNA.与BM-MSC相比,二者表达细胞因子谱相似,但BM-MSC不表达GM-CSF和G-CSF mRNA.共培养5周计数CFC显示,BFU-E、GFU-GM和CFU-GEMM在CD+34细胞/UC-MSC(75.5±27.9,100.0±25.1,9.5±7.3)与CD+34细胞/BM-MSC(70.5±28.8,108.3±9.5,8.5±5.1)共培养体系差异无统计学意义(P＞0.05).结论 UC-MSC与BM-MSC具有相似的造血支持功能和细胞因子分泌谱.
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全反式维甲酸对人类骨髓间充质干细胞CD106、CD54表达影响的体外研究
目的 探讨体外全反式维甲酸(ATRA)对人类骨髓间充质干细胞(BM-MSC)CD106和CD54表达的影响.方法 用流式细胞术检测0.01、0.1、1.0、10.0μmol/LATRA处理后BM-MSC细胞表面CD106和CD54的表达,采用MTT法测量细胞生长曲线.结果 0.01、0.1、1.0、10.0μmol/L的ATRA能增加BM-MSC细胞表面CD54、CD106的表达.结论 ATRA对BM-MSC细胞CD54、CD106有上调的作用.
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rAAV-2-hGM-CSF、rAAV-2mGM-CSF转导骨髓间充质干细胞的在体基因表达
目的 观察经rAAV-2-hGM-CSF、rAAV-2-mGM-CSF基因转导修饰的骨髓间充质干细胞在体基因表达情况.方法 按预先摸索好的转染条件在体外用rAAV-2-hGM-CSF、rAAV-2-mGM-CSF感染骨髓间充质干细胞后,继续在体外扩增培养12 d,再将被基因修饰的骨髓间充质干细胞通过尾静脉回输到6周龄的裸鼠体内,对照组回输未经基因转导处理的骨髓间充质干细胞,分别于此后的2、4、6、8周处死裸鼠,取其外周血,计数白细胞总数,检测血清中hGM-CSF、mGM-CSF的含量.结果 回输前hGM-CSF、mGM-CSF的分泌水平为36.25、25.14 ng/L,回输后2、4、6、8周裸鼠血清中hGM-CSF的含量分别为23.77、26.32、19.77、15.25 ng/L,mGM-CSF的含量分别为34.96、34.84、35.50、32.93 ng/L,相应时间点对照组裸鼠血清中mGM-CSF的水平分别为17.34、17.44、14.68、16.85 ng/L.rAAV-2-mGM-CSF转导组可使裸鼠体内白细胞计数增加,而rAAV-2-hGM-CSF转导组和对照组裸鼠体内的白细胞计数却无变化.结论 骨髓间充质干细胞可作为一种基因治疗的载体细胞,携带在体外经过基因修饰了的治疗基因在体内发挥其治疗作用.
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慢性粒细胞白血病患者骨髓来源间充质干细胞生物学特性的研究
目的 研究慢性粒细胞白血病患者骨髓来源间充质干细胞的生物学特性.方法 体外培养慢性粒细胞白血病患者骨髓来源间充质干细胞,进行细胞表型测定、细胞周期分析,并分别用RT-PCR及FISH方法检测培养的细胞中bcr-abl的表达情况.结果 观察到贴壁细胞成梭形生长,其细胞表型主要特点为Hk1+CD-31 CD-34,95%的细胞处于G0/G1期,并且能够检测到bcr-abl融合基因的表达.结论 慢性粒细胞白血病恶性克隆可能起源于比造血干细胞更高水平的干细胞.
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骨髓间充质干细胞修复衰老大鼠肾脏损伤的研究
目的：探讨骨髓来源的间充质干细胞对衰老模型大鼠肾脏衰老损伤的修复作用及机制。方法体外培养、鉴定SD大鼠骨髓来源的间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）。将健康SD大鼠随机分为正常对照组、衰老模型组和MSC治疗组。通过每日给予大鼠注射D-半乳糖（剂量为400mg/kg），制备衰老模型。MSC治疗组通过给予衰老模型大鼠输注3×106个MSC，以制备MSC治疗组。采用表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP）的腺病毒载体标记MSC，观察MSC在肾脏的迁移情况。检测各组大鼠肾组织的谷胱甘肽过氧化酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性，晚期糖基化终产物(advanced glycation end products，AGEs)的含量；HE染色行肾组织病理学检查；应用实时定量逆转录PCR法检测肾组织中衰老相关基因P53和P21 mRNA的表达。结果GFP标记的MSC细胞移植给衰老模型大鼠后，能向肾组织迁移。与对照组相比，衰老模型组肾组织GSH-Px活性降低，AGEs含量增加(P<0.05)；而MSC治疗组GSH-Px活性升高， AGEs含量减少(P<0.05)。病理切片显示模型组大鼠肾脏损伤严重，而MSC治疗组大鼠的肾脏损伤有明显修复。MSC能够调控衰老相关基因的表达，MSC组肾组织P53和P21 mRNA表达降低(P<0.05)。结论骨髓MSC能够减少衰老大鼠的肾脏损伤，MSC修复衰老损伤的机制可能是通过抑制氧化应激损伤，降低P53和P21基因的表达。
