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小鼠脂肪来源间充质干细胞培养上清液对热损伤引起的角质形成细胞凋亡的影响
目的 探讨小鼠脂肪来源间充质干细胞培养上清液(ADSC-CM)对热损伤引起KC(人表皮细胞株HaCaT)凋亡的影响. 方法 (1)取5只健康BALB/c小鼠双侧腹股沟脂肪组织,采用胶原酶消化法分离纯化脂肪来源间充质干细胞(ADSC).取第3代细胞进行形态学观察,采用流式细胞仪检测间充质干细胞表面标志物C D31、CD34、CD45、CD90、CD105的表达,并行成脂成骨诱导分化鉴定.(2)利用51.5℃水浴孵育HaCaT细胞35 s建立KC热损伤模型,流式细胞仪检测热损伤后即刻细胞凋亡率.(3)另取热损伤后HaCaT细胞按照随机数字表法分为常规培养组、无血清培养组、50％ ADSC-CM组、100％ ADSC-CM组,分别以含体积分数10％ FBS的DMEM培养液、无血清的DMEM培养液、含体积分数50％ ADSC-CM的DMEM培养液、体积分数100％ ADSC-CM培养24 h.采用吖啶橙-溴化乙啶(AO-EB)染色法观察各组细胞的凋亡情况,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率.实时荧光定量RT-PCR和蛋白质印迹法检测各组细胞Bcl-2、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的mRNA和蛋白表达水平(蛋白表达结果以灰度值比值表示).流式细胞仪检测各组细胞周期分布.以上实验均重复测定3次.对数据行单因素方差分析和LSD-t检验. 结果 (1)分离培养的细胞形态规则,与Fb类似,CD31、CD34、CD45阳性表达率低于10.0％,CD90、CD105阳性表达率均高于90.0％,经诱导后可分化成脂肪细胞、骨细胞,鉴定为ADSC.(2)热损伤后即刻,HaCaT细胞的凋亡率为(9.8±0.4)％.(3)AO-EB染色结果显示,无血清培养组HaCaT细胞凋亡数量明显多于其他3组.无血清培养组细胞凋亡率为(8.1±1.2)％,明显高于50％ ADSC-CM组的(6.0±0.8)％、常规培养组的(4.6±0.8)％和100％ ADSC-CM组的(3.1±0.4)％(t值分别为3.02、4.96、6.60,P值均小于0.01);100％ ADSC-CM组细胞凋亡率接近于常规培养组(t =1.50,P＞0.05),而明显低于50％ADSC-CM组(t=10.21,P＜0.01).(4)无血清培养组的Bcl-2 mRNA表达量为0.34±0.08,显著低于常规培养组的0.98 ±0.04、50％ ADSC-CM组的0.77 ±0.05和100％ ADSC-CM组的1.06 ±0.04(t值分别为12.87、8.07、14.11,P值均小于0.01);100％ ADSC-CM组的Bcl-2 mRNA表达量接近于常规培养组(t=0.08,P＞0.05),且明显高于50％ ADSC-CM组(t=8.08,P＜0.01).(5)无血清培养组的caspase-3 mRNA表达量为1.15±0.05,明显高于50％ ADSC-CM组的0.72±0.11、常规培养组的0.41 ±0.03和100％ ADSC-CM组的0.38 ±0.11(t值分别为6.93、13.97、22.79,P值均小于0.01);100％ ADSC-CM组的caspase-3 mRNA表达量接近于常规培养组(t=0.05,P＞0.05),但明显低于50％ ADSC-CM组(t=4.77,P＜0.01).(6)无血清培养组的Bcl-2蛋白表达量为0.93 ±0.04,显著低于常规培养组的1.74 ±0.06、50％ ADSC-CM组的1.32 ±0.05和100％ ADSC-CM组的1.90±0.04(t值分别为20.45、11.15、31.38,P值均小于0.01);100％ ADSC-CM组的Bcl-2蛋白表达量接近于常规培养组(t=1.33,P＞0.05),且明显高于50％ ADSC-CM组(t=17.30,P＜0.01).(7)无血清培养组的caspase-3蛋白表达量为0.63 ±0.08,明显高于50％ ADSC-CM组的0.46 ±0.03、常规培养组的0.29 ±0.08和100％ ADSC-CM组的0.21 ±0.03(t值分别为3.28、5.05、8.46,P值均小于0.01);100％ ADSC-CM组的caspase-3蛋白表达量接近于常规培养组(t=0.08,P＞0.05),但明显低于50％ ADSC-CM组(t=3.52,P＜0.05).(8)培养24 h,与无血清培养组比较,其他3组G2/M期细胞比例显著降低(t值分别为6.88、4.08、7.28,P＜0.05或P＜0.01);与无血清培养组比较,常规培养组、100％ ADSC-CM组处于S期的细胞比例明显增加(t值分别为2.67、2.40,P值均小于0.05);各组G0/G1期细胞比例无明显变化(F=0.70,P＞0.05). 结论 异种体积分数为100％的ADSC-CM可通过调节Bcl-2、caspase-3的表达来抑制热损伤引起的HaCaT细胞凋亡,缓解细胞G2/M期阻滞,加快细胞周期进程,推测异种或异体体积分数为100％的ADSC-CM在烧伤创面早期治疗方面有一定的应用潜力.
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人血管内皮生长因子165基因转染人骨髓间充质干细胞的实验研究
目的 建立人血管内皮生长因子165(VEGF 165)基因转染人骨髓间充质干细胞(MSC)的有效方法.方法 体外分离培养MSC,设转染组:采用脂质体介导法将pShuttle-CMV/VEGF 165质粒转染至MSC,空质粒组:转染pShuttle-CMV载体作对照,脂质体组:转染脂质体作对照,对照组:常规培养.用RT-PCR、酶联免疫吸附测定法和蛋白质印迹法检测MSC mRNA及其蛋白的表达情况,用噻唑蓝法检测MSC对VEGF质粒转染的敏感性. 结果转染组、空质粒组、脂质体组和对照组VEGF 165基因mRNA表达量分别为0.89±0.03、0.34±0.04、0.40±0.03、0.30±0.03,转染组与后3组比较,差异有统计学意义(P<0.01);各组细胞培养上清液中VEGF 165蛋白含量依次为(778±35)、(543±24)、(561±28)、(571±23)pg/mL,与后3组比较,转染组差异有统计学意义(P<0.01),转染后第7天表达至高峰,以后逐渐降低.转染组MSC中VEGF165蛋白表达电泳条带强度明显强于其他3组(P<0.01),VEGF质粒转染对MSC增殖活性无影响.结论 本研究建立了VEGF 165基因对MSC的转染方法,能有效表达目的基因及其蛋白.
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烧伤大鼠血清对不同来源间质干细胞的趋化作用
目的 了解间质干细胞(MSC)的来源,观察烧伤大鼠血清对不同来源MSC的趋化作用.方法 将72只大鼠采用完全随机法分成烧伤组(36只,制作背部30%TBSAⅢ度烧伤模型)、假伤组(36只,37℃模拟致伤).从两组大鼠骨髓、外周血中分离并培养MSC,在倒置显微镜下观察各组MSC的阳性率,比较其生长速度和细胞形态.同时观察不同血清对MSC的趋化作用及不同来源MSC的迁移能力.结果 两组大鼠的骨髓内均培养出贴壁生长的MSC.烧伤组12只大鼠外周血中有7只培养出MSC,其阳性率(58%)明显低于骨髓培养(100%,P＜0.05).假伤组大鼠的外周血内未见MSC(P＜0.05).倒置显微镜下可见原代接种后24 h有少量贴壁细胞,2～3 d后见其生长,散在贴壁,大多呈梭形.各组MSC形态无明显差异,均呈纺锤形生长.烧伤大鼠血清处理的假伤组骨髓MSC的迁移数[(94±11)个/高倍视野]明显多于正常大鼠血清和胎牛血清处理者[(37±6)、(38±11)个/高倍视野,P＜0.01],后两者处理的MSC迁移数相近(P＞0.05).假伤组大鼠骨髓MSC被不同血清趋化时迁移的细胞数明显少于烧伤组大鼠骨髓和外周血MSC(P＜0.05或0.01).烧伤组大鼠骨髓MSC与外周血MSC的迁移能力虽有差异,但无统计学意义(P＞0.05).结论 烧伤大鼠骨髓及外周血均能分离到MSC,而正常大鼠仅骨髓能分离到MSC.烧伤大鼠血清对MSC有较强的趋化作用.烧伤大鼠来源的MSC比正常大鼠来源的MSC具有更强的迁移能力.
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肺爆震伤研究进展
In recent years,a variety of explosive weapons become increasingly common used in regional military conflicts and terrorist bomb attacks.Meanwhile,the incidence of accidental explosion also showed an increase in the industries and daily life.The lung is the most labile organ and it is used to be severely injured organ in blast injury although even no signs of external injury could be observed on chest.Blast injury can present the symptoms such as lung rupture,bleeding,edema and emphysema.Respiratory dysfunction can affect oxygen supply to organs and systemic tissue,resulting in rapid and sustained hypoxemia and high mortality rate.Blast lung injury is characterized by respiratory disturbance and hypoxia.This article summarizes the etiology,pathogenesis,pathophysiological changes,diagnosis,and treatment of blast lung injury,with a hope to provide some useful clinical information.
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单侧输尿管梗阻引起输尿管损伤的新认知及进展
单侧输尿管梗阻( unilateral ureter obstruction,UUO)是尿路梗阻性病变的一种主要类型,梗阻的长期存在会进一步加重输尿管损伤。梗阻和损伤的相互作用常可引发输尿管狭窄、纤维化,进而加重尿路梗阻、引起尿液输送异常、终导致肾脏功能受损。间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一类来源于中胚层系的多能干细胞,可通过旁分泌及自分泌作用对输尿管损伤进行修复,并且能够促进输尿管组织工程支架的血管新生,抑制支架的再发梗阻及纤维化,在输尿管损伤的治疗方面具有很大的临床潜力。本文在介绍输尿管损伤病理生理机制的同时重点阐述了间充质干细胞对输尿管损伤的修复及MSCs在输尿管组织工程中应用的新认知及进展,为临床上输尿管梗阻性疾病的治疗提供了新思路。
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脐带间充质干细胞对衰老心肌细胞炎症因子表达影响
目的 探讨人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)对过氧化氢(H2 O2)诱导的衰老心肌细胞炎症因子表达的影响.方法 用100 μmol/L H2O2诱导H9c2心肌细胞衰老,采用DAPI荧光染色检测衰老相关异染色质聚集(SAHF)阳性细胞比例,以判定衰老模型是否建立成功.应用transwell小室构建H9c2心肌细胞与hUC-MSCs的共培养体系,采用DAPI荧光染色检测hUC-MSCs共培养对心肌细胞SAHF阳性细胞比例的影响,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测心肌细胞上清液中炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-10(IL-10)的表达水平.结果 DAPI荧光染色检测显示,与对照组相比较,H2O2组SAHF阳性细胞比例明显增高(F=22.658,q=9.562,P＜0.05),心肌细胞衰老模型构建成功;与H2O2组相比较,H2 O2+ hUC-MSCs组SAHF阳性细胞比例明显降低(q=7.092,P＜0.05).ELISA法检测显示,与H2O2组比较,H2 O2+ hUC-MSCs组心肌细胞上清液中促炎因子TNF-α和IL-1β的表达水平显著降低(F=7.338、13.965,q=4.334、6.144,P＜0.05),抗炎因子IL-10的表达水平显著增高(F=17.995,q=6.405,P＜0.05).结论 hUC-MSCs对H2O2诱导的H9c2心肌细胞衰老性损伤具有保护作用,其机制可能与降低促炎症因子表达水平、升高抗炎症因子表达水平有关.
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牙龈间充质干细胞的培养与鉴定
目的 分离培养人牙龈间充质干细胞,为进一步研究其对牙周炎的治疗作用提供基础.方法 采用酶消化法从牙龈组织中分离培养牙龈间充质干细胞,并通过克隆形成率、成脂成骨诱导分化、流式细胞术测定其增殖、多向分化能力及标志物的表达水平.结果 牙龈间充质干细贴壁生长,细胞与成纤维细胞相似呈长梭形,可形成明显集落.在特定的诱导条件下细胞可产生矿化结节和脂滴,干细胞标志物CD73、CD90、CD105表达均高于95％,造血干细胞标志物CD45表达低于2％.结论 采用酶消化法分离培养的牙龈间充质干细胞具有自我更新、多向分化能力,并表达干细胞标志物,为后期实验奠定了基础.
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NF-κB和P38MAPK在BMSCs肝向分化中的作用
目的 探讨信号转导分子核因子κB (NF-κB)和P38MAPK在肝细胞生长因子(HGF)、肝组织液(LTF)介导下骨髓间充质干细胞(BMSCs)向肝样细胞定向分化过程的作用.方法 采用全骨髓贴壁法分离大鼠BMSCs,利用HGF、LTF两种诱导剂以及NF-κB信号通路抑制剂BAY 11-7082对第3代BMSCs进行分组培养.采用吲哚靛青绿(ICG)摄取实验检测肝向分化的细胞,免疫组化染色检测NF-κB蛋白表达,Western Blot法检测NF-κB、p-P38和AAT表达.结果 经HGF、LTF诱导20 d后的细胞可摄取ICG.免疫组化检测显示,BMSCs经HGF、LTF两种诱导剂诱导后,细胞核内有NF-κB蛋白表达,添加抑制剂BAY 11-7082后细胞核内NF-κB蛋白表达减弱(F=572.2、280.9,P＜0.01).Western Blot检测显示,经HGF、LTF两种诱导剂诱导后,细胞内NF-κB和p-P38蛋白表达量显著增加,且细胞能够表达AAT蛋白,加入抑制剂BAY 11-7082后随着培养时间的延长,NF-κB、p-P38和AAT蛋白表达量均出现不同程度的降低(F=280.8～3 028.2,P＜0.01).结论 HGF、LTF均可诱导BMSCs向肝细胞分化,P38MAPK和NF-κB信号通路均参与了BMSCs的肝向分化,P38MAPK信号通路的调控主要出现在肝向分化的前期,NF-κB的抑制在前期对其无明显影响.
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损伤胰腺提取液对ASCs分化为胰岛样细胞影响
目的 探讨损伤胰腺提取液对脂肪间充质于细胞(ASCs)分化为胰岛样细胞的影响.方法 用胶原酶消化法提取大鼠ASCs并分为4组,对照组采用低糖培养液培养,药物诱导组采用高糖培养液和细胞因子培养,混合诱导组采用高糖培养液、细胞因子和损伤胰腺提取液培养,损伤胰腺提取液组采用高糖培养液和损伤胰腺提取液培养.诱导完成后,双硫腙染色鉴定胰岛素阳性反应细胞的表达情况,ELISA法检测细胞胰岛素分泌量,细胞免疫荧光染色检测胰十二指肠同源盒1(PDX-1)的表达.结果 实验组胰岛素阳性细胞数量、胰岛素分泌量和PDX-1的表达均高于对照组(F=77.231,q=3.48～14.81,P＜0.05);混合诱导组胰岛素阳性细胞数量、胰岛素分泌量和PDX-1均优于药物诱导组和损伤胰腺提取液组,差异有显著性(q=5.45、8.94,P＜0.05).结论 损伤胰腺提取液对大鼠ASCs分化为胰岛样细胞具有促进作用.
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新型纳米支架并MSCs修复兔桡骨缺损影像学观察
目的 采用富含血小板血浆(PRP)的新型纳米活性组织工程支架复合骨髓基质干细胞(MSCs)修复兔桡骨中段骨-骨膜缺损,通过影像学手段评价其成骨能力.方法 取健康成年新西兰大白兔20只,随机分为实验组(A组,8只)、对照组(B组,8只)和空白组(C组,4只).建立双侧桡骨骨缺损模型.A组将PRP纳米支架与MSCs在体外复合培养后植入兔的骨缺损中,B组将PRP纳米支架植入骨缺损处,C组不植入任何材料.分别于术后4、8、12周通过大体观察、X线检查及影像学评分等方法观察骨缺损修复情况.结果 A组复合材料有良好的诱导成骨能力,治疗4周即有明显的成骨反应和新骨形成,治疗12周基本修复骨缺损;B组修复能力较A组差;但A、B组均优于C组.A组和B组对工程支架无明显异物反应.结论 新型纳米活性组织工程支架是修复兔骨缺损的良好移植材料,复合MSCs后能促进骨缺损的修复.
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TNF-α对小鼠骨髓间充质干细胞免疫抑制作用影响
目的 探讨肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)免疫抑制作用影响.方法 采用全骨髓贴壁培养法分离培养小鼠的BMSCs,观察其细胞形态学的变化.应用免疫荧光法检测小鼠BMSCsCXCR4的表达;应用油红O和阿尔新蓝染色分别鉴定BMSCs成脂和成软骨诱导情况;应用ELISA试剂盒检测细胞培养上清液中白细胞介素-10 (IL-10)和前列腺索2(PGE2)的表达;应用免疫印迹实验检测培养细胞环氧化物水解酶2(COX-2)和核因子-κB (NF-κB)蛋白的表达.结果 体外培养的小鼠BMSCs贴壁呈现克隆性生长,大部分细胞呈圆形,部分呈梭形.BMSCsCXCR4的阳性表达率为100％.BMSCs可分化为脂肪细胞及软骨细胞.TNF-α处理组上清液中IL-10和PGE2的表达明显高于对照组(t=14.235、12.005,P＜0.05),细胞CoX-2和NF-κB蛋白的表达明显高于对照组(t=8.557、4.301,P＜0.05).结论 TNF-α可能通过NF-κB信号通路,明显增强小鼠BMSCs的免疫抑制作用.
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BMSCs及ESCs因子在迟发型超敏反应中的作用
目的 探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)和胚胎干细胞(ESCs)因子对迟发型超敏反应(DTH)的影响.方法 分离、培养并传代小鼠BMSCs和ESCs,获取BMSCs因子和ESCs因子.小鼠随机分为正常组(A组)、模型组(B组)、培养基组(C组)、地塞米松(DEX)组(D组)、BMSCs因子组(E组)和ESCs因子组(F组)6组,每组10只,应用5 g/L二硝基氟苯腹部涂抹致敏、耳廓激发的方法制备小鼠变应性接触性皮炎(ACD)模型(A组不处理),A、B组尾静脉注射生理盐水,C、D、E、F组分别注射DMEM、DEX、BMSCs因子、ESCs因子,比较各组耳肿胀度、胸腺指数和脾指数,光镜下观察耳廓苏木精-伊红染色后组织学变化.结果 B组耳肿胀度高于A组,差异有显著性(F=153.080,q=27.68,P＜0.01);D组、E组和F组小鼠耳廓肿胀度均低于B组(q=8.130～20.440,P＜0.01),脾指数和胸腺指数亦低于B组(F=621.352、409.533,q=9.579～38.030,P＜0.01);E组和F组的脾指数及胸腺指数均高于D组(q=4.089～15.969,P＜0.05),E组耳肿胀度、脾指数及胸腺指数均高于F组(q=4.860～11.487,P＜0.05).B组和C组以上指标比较差异均无显著性(P＞0.05).镜下观察,D组、E组和F组炎性细胞浸润均较B组减少.结论 BMSCs因子和ESCs因子均可抑制DTH,但ESCs因子抑制作用优于BMSCs因子.
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人骨髓间充质干细胞玻璃化冷冻复苏后的生物学活性
目的 探讨人骨髓间充质干细胞(BMSCs)玻璃化冷冻复苏后细胞的存活率和诱导分化能力.方法 体外分离纯化人BMSCs,流式细胞仪检测其纯度.应用玻璃化冷冻方法进行冷冻保存,复苏后台盼蓝染色鉴定存活率.在DMEM/F12培养的BMSCs中加体积分数0.10的胎牛血清和10 μg/L重组人碱性成纤维细胞生长因子预诱导2d,再加0.1 μmol/L全反式维甲酸和10 μg/L胶质细胞系源性神经营养因子进行正式诱导3d,免疫荧光染色检测Nestin、微管相关蛋白(MAP2)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、胶质纤维蛋白(GFAP)的表达.结果 BMSCs强表达CD44和CD90,不表达CD34和CD45.玻璃化冷冻解冻后细胞存活率＞95％.经诱导后,BMSCs强阳性表达MBP和GFAP,弱阳性表达Nestin和MAP2.结论 玻璃化冷冻复苏后的人BMSCs存活率高并能成功诱导为神经胶质细胞.
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骨髓间充质干细胞分泌因子对Ⅰ型变态反应的影响
目的 探讨骨髓间充质于细胞(BMSCs)分泌因子对Ⅰ型变态反应的影响.方法 采用全骨髓贴壁法分离和纯化大鼠BMSCs,收集培养第3代的BMSCs上清液获取干细胞分泌因子.制备大鼠抗卵蛋白血清;分离培养大鼠腹腔肥大细胞,用大鼠抗卵蛋白血清特异性致敏肥大细胞,甲苯胺蓝染色法观察干细胞分泌因子对肥大细胞脱颗粒的影响;制备大鼠同种被动皮肤过敏动物模型(PCA),观察干细胞分泌因子对其影响.结果 干细胞分泌因子和酮替芬对特异性致敏肥大细胞脱颗粒和大鼠PCA均有明显抑制作用,与模型组相比差异有显著性(F=219.79～357.32,q=21.26～34.05,P＜0.01).结论 干细胞分泌的细胞因子对Ⅰ型变态反应有抑制作用.
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BMSCs并BDNF移植治疗大鼠陈旧性脊髓损伤效果
目的 探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)并脑源性神经营养因子(BDNF)移植治疗大鼠陈旧性脊髓损伤的效果.方法 对48只Wistar大鼠采用改良的ALLEN撞击法建立脊髓损伤模型,将其随机分为4组,4周后4组分别注射BMSCs+BDNF、BMSCs、BDNF及DMEM干预.分别于移植后1、2、4周采用BBB评分评估大鼠后肢运动情况,并于移植后4周采用免疫组化法检测BMSCs在脊髓损伤部位的分布,及生长相关蛋白43(GAP-43)的表达.结果 移植后4周,BMSCs+BDNF组及BMSCs组的BMSCs在脊髓损伤部位均得以存活.BMSCs+BDNF组与BMSCs组及BDNF组比较,脊髓空洞较少并且GAP-43阳性表达面积较高(F=35.57,q=4.97～25.84,P＜0.05).BMSCs+BDNF组BBB评分与其他组比较,差异有显著性(F=27.51,q=3.89～11.57,P＜0.05).结论 BMSCs+BDNF联合移植对于大鼠陈旧性脊髓损伤有较好的修复作用.
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人TNF-α重组慢病毒载体构建及其脐血间质干细胞表达
目的 构建带有人TNF-α基因的慢病毒载体,并且观察该基因在体外人脐血间质干细胞中的表达.方法 通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从PCD DNA-TNF-α质粒中获得人TNF-α基因,利用Infusion技术重组构建慢病毒载体穿梭质粒pGC-FU-TNF-α,在脂质体Lipofectamine 2000介导下与结构质粒pHelper 1.0和包膜质粒pHelper 2.0共转染293T细胞包装生产慢病毒.将人脐血间质干细胞分为实验组(pGC-FU-TNF-α)、空载体对照组(pGC-FU-EGFP)及空白组(脐血间质干细胞),分别用重组慢病毒、空载慢病毒、PBS感染后,采用RT-PCR以及ELISA方法检测TNF-α表达.结果 所获TNF-α基因测序证明与GenBank中序列一致;重组慢病毒载体质粒pGC-FU-TNF-α经鉴定正确;三质粒共转染293T细胞成功,收集、浓缩病毒后测定其滴度为2×107 TU/L,感染脐血间质干细胞后RT-PCR、ELISA检测3组细胞均有TNF-α表达,其中实验组大量表达TNF-α,与其余两组比较差异有显著性(F=11.677、21.321,P<0.01).结论 成功构建带有TNF-α基因的慢病毒载体并实现在脐血间质干细胞中的表达,为脐血间质干细胞转基因治疗胃癌的应用奠定基础.
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玻璃粘连蛋白对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化影响
目的 体外分离纯化培养大鼠骨髓间充质干细胞(rMSC),研究玻璃粘连蛋白(VN)在rMSC向成骨方向分化过程中的作用.方法 贴壁分离培养法分离纯化rMSC,观察第1、3、5、8、10代细胞的增殖情况,并绘制出生长曲线.选第3代细胞用以VN包被的培养板培养,每4 d检测碱性磷酸酶活性及钙结节的形成.结果 经贴壁筛选法分离的rMSC生长曲线呈S形,第3、4、5代细胞排列具有典型的漩涡状结构;细胞表达CD44、CD90,而不表达CD34.用以VN包被的培养板培养12 d,碱性磷酸酶染色呈阳性,硝酸银染色显示有钙结节形成.结论 VN有诱导rMSC向成骨方向分化的作用.
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外源性骨髓间充质干细胞在兔椎间盘内存活状态观察
目的 观察外源性骨髓间充质干细胞在活体兔椎间盘微环境中存活状态.方法 选取健康新西兰大白兔24只,体外培养经基因转染红色荧光蛋白标记的兔骨髓间充质干细胞,待细胞活性状态佳时,利用显微注射方法 将其注入兔腰椎间盘,分别于术后1、7、14、30、60 d手术取出椎间盘,制备病理学切片,在荧光显微镜下观察外源性骨髓间充质干细胞是否散发出红色的荧光及荧光细胞数量.结果 术后1、7、14、30、60 d椎间盘切片在荧光显微镜下均可观察到荧光,术后14 d细胞所散发出的荧光较术后1 d及7 d有所减弱,术后60 d红色荧光无明显变化.术后30、60 d荧光细胞数量较1～14 d有所增加(F=15.171,P<0.01).结论 手术后60 d外源性骨髓间充质干细胞在活体兔椎间盘内仍处于存活状态.
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离心并贴壁法培养兔骨髓间充质干细胞的成骨特性
目的 观察密度梯度离心并贴壁培养法体外分离纯化兔骨髓间充质干细胞的效果,以及诱导后的兔骨髓间充质干细胞的成骨特性.方法 采用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离兔骨髓间充质干细胞.采用倒置显微镜进行形态学观察、免疫细胞化学法鉴定骨髓间充质干细胞膜抗原;经成骨培养液诱导培养后,对碱性磷酸酶活性、细胞矿化形成钙化结节的能力进行测定.结果 分离的骨髓间充质干细胞2 h后贴壁,贴壁细胞平均10 d[]形成克隆,细胞表型稳定.诱导条件下,细胞碱性磷酸酶活性明显增高,Von.ossa染色可见矿化结节.结论 密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化兔骨髓间充质干细胞,用此种方法培养的细胞具有骨髓间充质干细胞的一般生物学特性.
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TGF-β1对MSCs体外模拟缺血性损伤的保护作用
目的 观察转化生长因子β1(TGF-β1)对骨髓间充质干细胞(MSCs)体外模拟缺血性损伤的保护作用.方法 采用密度梯度离心结合贴壁法分离、培养大鼠MSCs,对培养第3代的MSCs进行鉴定;用1、2、5 μg/L 的TGF-β1分别预处理细胞8 h,然后用血清剥夺和低氧(SOD)处理建立MSCs体外模拟缺血性损伤模型,通过流式细胞术评价MSCs的凋亡及存活情况;用Western blot方法 检测2 μg/L的TGF-β1对Akt和p-Akt表达的影响.结果 密度梯度离心结合贴壁法能有效分离、纯化大鼠MSCs,免疫荧光检测显示培养的细胞CD29表达阳性,而CD34表达阴性.用2 μg/L的TGF-β1预处理MSCs后,可抑制SOD诱导的细胞凋亡,其早期凋亡率和中晚期凋亡率均明显下降,与凋亡模型组相比差异具有显著性(F=199.77、232.82,P<0.05),而PI3K抑制剂Wortmannin能明显抑制TGF-β1的抗凋亡作用.2 μg/L的TGF-β1可升高p-Akt的表达,p-Akt在8 h达到高峰,p-Akt/Akt显著增高,和其他时间点相比差异具有显著性(F=6.306,P<0.05).结论 TGF-β1对SOD诱导MSCs的凋亡具有抑制作用,其抗凋亡作用是通过激活PI3K/Akt实现的.
