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丹参延迟发光检测的影响因素
探讨延迟发光检测的影响因素，为优化延迟发光的实验条件奠定基础。延迟发光检测是研究中药材的新的技术方法，能够反映中药材的整体的信息。延迟发光对外界环境的变化极其敏感，通过对样品不同的含水量、激发光、激发时间及样品颗粒状态对延迟发光衰减动力学的影响，确定中药材延迟发光检测的影响因素。激发光频率越低，样品的含水量越低，延迟样品的颗粒在80～120目时延迟发光越强，衰减时间越长。激发光频率、样品含水量、样品颗粒尺寸对样品的延迟发光有影响。延迟发光影响因素的确定为中药材延迟发光检测实验条件的优化奠定了基础。
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皮肤石蜡包埋标本组织芯片制备条件优化及应用评价
组织芯片(tissue chip )又称组织微阵列(tissue microarray,TMA),是将若干石蜡包埋块上的各种典型组织或细胞转移到一个新石蜡块上重新构建微型化高通量组织阵列的方法.1
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L-缬氨酸生产菌的选育及发酵条件的优化
目的 研究L-缬氨酸生产菌的选育及发酵条件的优化.方法 以黄色短杆菌LNV10为出发菌株,经紫外线、硫酸二乙酯逐级诱变处理,在含磺胺胍(SG)、α-氨基丁酸(α-AB)、2-噻唑丙氨酸(2-TA)结构类似物平板上定向筛选,通过响应面分析对培养基的组成进行优化,同时对发酵条件如温度、pH值等进行了探索.结果 获得L-缬氨酸高产菌株LNV270,优化了发酵条件.结论 在优条件下发酵65h,可产L-缬氨酸46.89g·L-1.
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他克莫司发酵条件的研究
通过正交试验优化了他克莫司产生菌的发酵培养基,研究了不同发酵条件对他克莫司产量的影响.结果 显示在优条件下,进行了5m3发酵罐的发酵试验,发酵144h他克莫司的产率为330μg·mL-1,达到了工业化生产的要求,为进一步放大生产奠定了基础.
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1株海洋来源鞘氨醇单胞菌胞外多糖的含量测定
目的 建立1种简便快捷的测定海洋来源鞘氨醇单胞菌分泌的胞外多糖威兰胶含量的方法.方法 通过测定威兰胶同葡萄糖的换算因子以及发酵液中葡萄糖和总糖的浓度,建立了1种利用苯酚-硫酸法测定发酵液中威兰胶含量的方法,并采用单因素及正交实验对该方法的影响因素进行了优化及方法学验证.结果 佳的优化条件为:苯酚用量为0.8mL、浓硫酸用量为6 mL、显色时间为30 min、显色温度为80℃.方法学验证结果表明,该方法的平均回收率为98.94％,相对标准偏差(RSD)为0.53％;显色产物在2h内稳定,RSD为0.48％;仪器的精密度良好,RSD为0.77％.结论 建立的苯酚-硫酸法可用于发酵液中威兰胶的含量测定.
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酸性α-淀粉酶研究进展
酸性α-淀粉酶是指在低 pH 值条件下可保持高活性，通过随机切断分子内α-1，4糖苷键，将淀粉降解为糊精和低聚糖等的一种重要工业酶制剂。本文对酸性α-淀粉酶产生菌的来源、高产菌株选育、产酶条件优化及应用潜力进行了综述，为进一步研究酸性α-淀粉酶提供参考借鉴。
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成纤维细胞生长因子23蛋白原核表达及条件优化
目的 制备具有生物学活性的可溶性重组人成纤维细胞生长因子23(FGF23),并探讨其佳诱导表达条件.方法 克隆FGF23和SUMO-FGF23两个cDNA序列,分别与原核表达载体pET3c与pET22b相连,转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)和BL21 (DE3)宿主菌中,对FGF23表达的佳质粒和宿主菌组合进行筛选,并对Rosetta (DE3)/pET22b-SUMO-FGF23重组菌株的佳诱导表达条件进行优化.结果 只有pET-SUMO-FGF23的质粒和Rosetta(DE3)的组合有FGF23蛋白质表达;融合蛋白在16℃、0.4 mmol/L IPTG诱导19 h以可溶形式表达,且上清表达量占菌体总蛋白的28％.结论 本研究成功获得了高表达量及可溶性的重组FGF23,佳表达条件是16℃、0.4 mmol/L IPTG诱导表达19 h.
关键词： 重组成纤维细胞因子23 原核构建 诱导表达 条件优化 -
星状病毒70 mer探针寡核苷酸芯片制备及杂交条件的优化
目的 探讨有利于制备多种病毒长探针平行检测芯片的佳制备及杂交条件.方法 通过引物直接标记方法,对70 mer探针寡核苷酸芯片的点样浓度、点样后固定方案、杂交温度、杂交时间进行优化.结果 70 mer寡核苷酸探针点样浓度在10 μmol/L时就可获得较高的的荧光强度,探针点样干燥后在3 600 mJ条件下紫外交联固定效果好,在65 ℃条件下杂交8 h能获得优杂交结果,所用杂交液是5×SSC(0.5%SDS、50 %甲酰胺、1%鲑鱼精DNA).结论 本实验优化了70 mer探针寡核苷酸芯片制备及杂交条件;此为进一步研制多种海洋环境人致病性病毒检测芯片奠定了基础.
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食用油中黄曲霉毒素B1的ELISA测定条件优化与准确检测
目的 为提高食用油中黄曲霉毒素ELISA检测的精密度与准确度,对检测相关条件进行优化探讨.方法 通过调整样品前处理以及免疫反应过程中一些实验参数,对比不同实验条件下实际样品测定值的RSD与回收率,取一定量样品提取液加入样品稀释液后按ELISA测定程序进行测定.结果 在优化条件下样品加标回收率在75.5％～115.6％之间,同一个样品提取液做多孔平行其RSD小于8.5％.以超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS-MS)进行确认检测结果满意.结论 优化后的检测条件有效地改善了检测过程中不确定性,样品检测结果的平行性和重复性较好,本实验对食用油中黄曲霉毒素B1的有关优化研究参数可以作为实际检测分析的参考,适用于实验室常规检测.
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乳酸菌中幽门螺杆菌ureB基因的食品级表达与优化
目的:以乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)为宿主菌构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)尿素酶B(UreB)的食品级表达系统.方法:从重组质粒pMD19-T-ureB上酶切得到ureB基因片段,与含有筛选标记lacF基因的L.lactis表达载体pNZ8149经双酶切后定向连接,应用PCR、酶切和测序的方法鉴定重组子.重组菌用乳联菌肽诱导表达,用正交表实验进行表达条件的优化,通过SDS-PAGE和Western blot对重组蛋白进行鉴定.结果:重组菌Nz3900/pNz8149-ureB经鉴定与预期相符.优化结果显示在菌体培养到D600nm为0.40左右时加入终浓度为25μg/L的乳联菌肽诱导5 h产量高,通过Western blot能检测到UreB的表达.结论:构建了ureB基因食品级表达系统,并得到了表达的优条件.
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何首乌抗性淀粉制备工艺优化及性质研究
目的 制备何首乌抗性淀粉并优化提取率.方法 以何首乌淀粉为原料,采用压热-酶法制备抗性淀粉,单因素试验和响应面分析获得抗性淀粉的佳制备条件.结果 佳制备条件为:淀粉乳浓度20％、普鲁兰酶添加量13.5 U/g,普鲁兰酶作用时间30 h、老化时间24h.在此条件下抗性淀粉的质量分数是35.21％±1.43％.;电镜试验表明:淀粉颗粒经压热-酶法处理后表面形态发生变化,淀粉经过脱支重结晶后,重结晶淀粉颗粒形状为不规则的碎片,可有效增加淀粉的溶解度同时降低淀粉膨胀度;体外消化模拟试验表明:与原淀粉相比,大鼠胃、肠液对抗性淀粉消化能力降低.结论 该研究可为抗性淀粉的工业化生产和应用提供参考,对开发新的药用辅料及保健型膳食纤维意义显著.
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70 mer长寡核苷酸探针芯片制备、标记方法及杂交条件的优化
目的 优化长片段寡核苷酸芯片制备、探针标记及杂交条件.方法 通过直接标记方法优化芯片的点样浓度、点样后的固定方法.探索两种靶基因标记方法,并优化杂交液及各种杂交条件.结果 采用70 mer寡核苷酸探针,点样浓度在10 μmol/L时就可获得满意的荧光强度.探针点样后37 ℃水合,然后在3 600 mJ条件下进行紫外交联固定效果好.样品采用生物素间接标记较CY3直接标记信号强度强,成本相对低廉.优化出的杂交液成分:50 %甲酰胺、5×SSC、0.5 %SDS,杂交时间为8 h,杂交温度为65 ℃.结论 通过此试验优化了制备病原体长探针寡核苷酸芯片的制备方法,样品标记策略和杂交液及杂交温度,为下一步制备多种病原体的寡核苷酸芯片检测系统奠定了基础.
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宫颈癌相关BLCAP基因的原核表达及条件优化
目的 利用大肠埃希菌表达系统表达宫颈癌相关BLCAP基因,并优化表达条件.方法 利用PCR技术从逆转录病毒重组载体pL(BLCAP)SN中扩增宫颈癌相关BLCAP基因,将其插入到原核表达载体pET-32(a)中,从而构建原核表达重组质粒pET-32(a)-BLCAP,随后将阳性重组质粒转化到表达宿主菌中,通过IPTG诱导表达并优化表达条件,所表达的带有His标签目的融合蛋白经Ni2+亲和层析纯化回收,并采用SDS-PAGE和Western印迹对目的蛋白进行分析和鉴定.结果 构建的重组表达质粒经PCR、酶切和DNA测序鉴定与预期的结果一致,含有重组质粒的表达宿主菌经过IPTG诱导表达了分子量约为28 ku的融合蛋白,并经优化确定了佳的诱导表达条件.结论 成功构建了pET-32(a)-BLCAP原核表达质粒,表达并经纯化得到了BLCAP目的蛋白,为研究该蛋白的性质及其制备针对该蛋白的抗体奠定了基础.
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水体病毒浓缩条件的优化
病毒浓缩条件的优化是水环境病毒污染监测及灭活去除效率评价的基础,本文开发了在待浓缩水样中预先加入钠化蒙脱石吸附病毒以增加其沉降性能,并在优化絮凝条件下用聚合氯化铝絮凝沉淀蒙脱石钠的水体病毒浓缩方法.该方法对人为污染的脊髓灰质炎病毒(Poliovirus 1, PV1)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)、大肠杆菌噬菌体(Phage of Ecoli, E.cp)在闽江水、生活污水、自来水中分别有高于84.3%的浓缩回收率,说明该浓缩方法具有较广泛的适用性和应用前景,可为水体病毒污染监测及灭活去除评价提供一个简便、回收率高、成本低的浓缩方法.
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药用百合DNA提取和RAPD条件的优化
目的 确定药用百合佳随机扩增多态DNA(RAPD)分析方法 .方法 以药用百合新鲜鳞叶为材料,研究DNA的提取方法 ,并对影响RAPD反应的各因素进行优化.结果 药用百合RAPD反应体系及程序为:在40 μL反应体系中,含40 ng模板DNA,0.3 μmol/L随机引物,0.2 mmol/L dNTPs,1.7 mmol/L Mg2+,3 μL 10×PCRBuffer,1.5 U Taq酶;扩增程序为:第一步94℃预变性2 min,第二步94℃变性1 min,第三步36℃退火45s,第四步72℃延伸90s.返回至第二步重复40个循环,第六步72℃延伸10 min,后4℃保存以备电泳.结论 建立了药用百合RAPD的优化反应体系及程序.
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叶下珠愈伤组织快速培养体系研究
目的:诱导叶下珠得到愈伤组织并对其培养条件进行优化.方法:以茎、叶、种子为外植体,以MS为基本培养基,考察不同外植体在不同外源激素及不同配比下愈伤组织的诱导率;以诱导条件下优化得到的激素配比为基础,通过改变激素NAA、2,4-D和6-BA的相对比例,考察叶下珠愈伤组织继代生长的佳条件.结果:茎为佳外植体;佳诱导培养基为MS+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L 2,4-D+2 mg/L 6-BA,此条件下诱导率可达90%以上;佳继代培养基为MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 2,4-D+2 mg/L 6-BA;外源激素NAA、2,4-D和6-BA不同比例组合后对叶下珠愈伤组织诱导及继代培养影响较大.结论:首次成功建立叶下珠愈伤组织快速培养体系,为利用现代生物技术方法保护和利用叶下珠物种资源提供了一种新途径.
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儿童微小病变型肾病综合征尿蛋白组的双向电泳及PDQuest图像初步分析
微小病变型肾病约占儿童肾病综合征(NS)78%,我们以微小病变型肾病综合征的蛋白尿为研究对象,经条件优化后,以固相pH梯度(IPG)等电聚焦为第1向,SDS-PAGE均一胶(T=10%)的垂直电泳为第2向,即双向电泳(2DGE),对NS儿童的尿蛋白进行了研究.结果获得了满意的电泳图谱,将2DGE银染后,以扫描仪获取电泳图像,对图谱进行分析.
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野牡丹止痢片的薄层鉴别研究
目的 建立野牛十丹止痢片的薄层鉴别方法.方法 通过对吸附剂、展开剂、显色剂、点样量的优化和对相对湿度、温度等影响因素的考察,确定佳的薄层色谱条件.结果 佳条件为:以硅胶H为吸附剂,二氯甲烷-甲酸乙酯-甲酸(6:3:1)为展开剂,1%FeCl3乙醇溶液为显色剂,点样量为供试品溶液与对照药材溶液4 μl、对照品溶液2 μl;相对湿度、温度对实验结果无明显不良影响.结论 所建立的方法操作简便、分离快速、专属性强、耐用性好,可用于该制剂的质量控制.
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猪囊尾蚴期特异性抗原cC1的克隆与高效可溶性原核表达
目的 克隆猪囊尾蚴期特异性抗原cC1基因,并进行高效可溶性原核表达.方法 利用PT-PCR从猪囊尾蚴中获得cC1编码基因,T-A克隆后,将cC1插入原核表达载体pET28a中,经酶切、测序鉴定后将其转入宿主菌E.coli BL21(DE3)中,通过IPTG诱导表达并优化表达条件,表达的融合蛋白Ni~+-亲和层析柱纯化后经快速液相蛋白层析分离系统检测其纯度.采用SDS-PAGE和Western-blotting对目的 蛋白进行分析和鉴定.结果 RT-PCR扩增出的片段长度为1056 bp,构建的重组表达质粒经PCR、酶切验证,和预期的结果一致,测序鉴定与Genbank中cC1基因相比于423位存在1个同义突变.转化有重组质粒的E.coliBL21(DE3)经过0.05 mmol/L IPTG 37℃诱导6h高效表达了占菌体蛋白总量60%的可为囊虫病患者血清识别的相对分子质量约为40000的可溶性融合蛋白,经Ni+-亲和层析柱纯化后纯度达94%.结论成功克隆并高效可溶性原核表达了猪囊尾蚴期特异性抗原cC1,为其进一步研究和应用奠定了基础.
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醇类沉淀法提取尿液蛋白的优化策略
目的 研究提取条件,探讨提取尿液蛋白的优化策略.方法 收集健康志愿者的混合尿液标本,采用甲醇、乙醇、异丙醇沉淀法在不同的条件下提取尿蛋白,这些条件包括:醇类试剂的种类、醇类试剂的比例、醇类试剂与尿液作用的不同温度及作用时间、不同的温度处理程序等.然后测定提取的蛋白浓度,评价蛋白回收量;十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)评价总蛋白条带;蛋白免疫印迹评价在不同条件下提取的目的 蛋白条带.结果 孵育条件固定为4℃ 30 min时,溶剂为75%乙醇可提取蛋白多为(649.03±28.33)μg;SDS-PAGE和免疫印迹结果显示,在不同醇类溶剂条件下提取的总蛋白条带和目的 蛋白条带呈趋势变化.提取试剂条件固定为75%乙醇时,改变孵育的温度方案,显示先4℃孵育30 min后,再-20℃过夜提取的总蛋白多为(599.93±42.20)μg;SDS-PAGE和免疫印迹结果都显示,孵育温度方案不同,所提取的总蛋白条带和目的 蛋白条带无明显差异.结论 75%乙醇,在4℃孵育30 min后,-20℃过夜条件下,可高效提取尿中胰淀粉酶(AMY),用于尿AMY定性定量检测.醇类溶剂的比例对提取的总蛋白量影响很大,且对不同分子量蛋白有选择性;孵育温度条件主要影响总蛋白量.
