阿霉素在小鼠离体培养脑片中增强Ⅱ型腺相关病毒的转导

目的：在小鼠离体培养脑片中观察Ⅱ型腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV-2）载体介导的增强型绿色荧光蛋白（ enhanced green fluorescent protein，EGFP）的感染，并进一步研究阿霉素促进AAV-2转导的效应。方法离体培养小鼠全脑脑片，在培养基中加入携带EGFP的AAV-2（AV2．EGFP）或阿霉素与AV2．EGFP的混合物，利用荧光显微镜实时观察活细胞中EGFP的表达情况。结果 AV2．EGFP感染脑片6 d后，EGFP稳定表达，同时加入1μmol／L阿霉素可明显增强EGFP表达，阳性细胞数增加至2．8倍，该效果至少可持续6 d。并且，阿霉素与AV2．EGFP同时给药与在AV2．EGFP感染之后给药效果相似。结论阿霉素在小鼠离体培养脑片中可明显增强AAV-2的转导，该研究有望促进AAV-2介导的基因治疗在中枢神经系统疾病中的应用。

原位杂交和免疫组化双标记技术在大鼠全脑脑片培养中的应用

目的 探讨联合应用原位杂交(in situ hybridization,ISH) 和免疫组化(immunohistochemistry,IHC)技术检测全脑脑片特定核酸和蛋白的表达.方法 在静态全脑脑片培养的基础上,将培养的脑片进行冰冻切片,然后联合应用原位杂交和免疫组化技术检测特定基因的表达情况.结果 脑片冰冻切片的质量可以进行后续的实验;与单纯应用一种方法相比,联合应用两种技术可同时在核酸水平和蛋白水平检测待测基因,两种显色方法不相互冲突,且可以更直观地显示核酸和蛋白的表达模式.结论 原位杂交和免疫组化双染技术明显优于单纯的原位杂交技术或免疫组化;该双染技术可用于脑片培养中的基因和蛋白检测.

锰对大鼠脑片的损伤及对细胞α-突触核蛋白表达的影响

目的 研究锰对脑多巴胺神经细胞的毒性作用,重点观察α-突触核蛋白与细胞凋亡的改变.方法 利用体外脑片培养模型,用不同浓度氯化锰(0,25,100,400μmol/L)处理脑片24 h后,观察脑片中酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)阳性细胞改变,培养液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的释放量,细胞凋亡率以及α-突触核蛋白的表达.结果 随着Mn处理浓度的增加,脑片神经细胞损伤逐渐加重.与对照组比较,锰处理脑片导致TH阳性细胞数明显减少,LDH释放量、细胞凋亡率以及α-突触核蛋白的表达均明显增加.结论 锰对多巴胺神经细胞有毒性作用,并且锰可以通过诱导α-突触核蛋白过表达而造成神经细胞损伤.

新生大鼠大脑皮质、纹状体及中脑黑质器官型脑片培养

目的探索大脑皮质、纹状体及黑质密部器官型脑片的体外培养.方法选出生2d内的Wistar乳鼠,取大脑皮质、纹状体及黑质致密部,切成300μm厚的脑片,共同转至带有Millicell微孔膜插件的培养皿中.分别培养0d、10d、20d和30d,倒置显微镜观察,酪氨酸羟化酶(TH)免疫荧光染色及激光共聚焦显微镜下检测脑片摄取溴化已啶(EB)能力.结果黑质密部多巴胺能神经元(TH阳性)及突起逐渐长入纹状体中,约20d左右,纹状体及黑质致密部脑片长在一起,脑片中所有细胞EB染色呈阴性,说明无坏死细胞.培养30d时,脑片约10%神经元呈EB染色阳性,细胞变性坏死.结论培养20d内脑片已经形成多巴胺能神经元从黑质密部到纹状体通路,可用于帕金森病等神经退行性疾病研究的组织模型.

小鼠海马神经元冰冻切片和脑片培养方法的比较

目的:通过冰冻切片和脑片培养方式比较获得更适合脑片实验研究的方法.方法:分别运用急性切片和脑片培养方法,结合全细胞膜片钳技术比较两种脑片处理方法对小鼠海马神经元细胞形态、细胞膜封接难易程度、细胞电生理特性等的差异,获得更适合细胞研究的脑片获取方法.结果:冰冻切片方法切断部分神经纤维,脑片表层出现肿胀或坏死细胞,2-3层细胞可用于膜片钳记录,但不易封接破膜.脑片培养后可使纤维再生,整个脑片细胞形态清晰可见,容易封接破膜,电生理记录波形及基本特性与冰冻切片一致,但脑片培养方法的细胞突触后电流幅度更大、频率更高.结论:脑片培养可修复受损纤维和细胞膜柔韧性,且不改变膜特性,但脑片培养重建了一定数量的细胞间信号连接,使细胞反应性增强,脑片培养方法更适合脑片神经元研究.

NMDA受体亚单位在海马脑片和在体发育海马结构中表达变化的比较

目的:对比长期培养大鼠海马脑片与在体生后发育海马结构中N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体亚单位NR1、NR2A和NR2B表达变化的异同,为利用海马脑片研究NMDA受体亚单位在生理和病理状态中的作用提供资料.方法:免疫组织化学染色、海马脑片培养技术及图像分析.结果:NR1、NR2B在海马脑片各区和生后大鼠海马结构各区表达模式相似,均呈"先升后降"的趋势,但升降幅度不同;NR2A在海马脑片各区是"先升、后降"的趋势,在生后海马结构各区则呈现"先降后升"的模式.NR1、NR2A、NR2B在脑片和在体发育海马的相似期间,在CA1、CA3、PG区表达均无显著性差异.结论:P3w/C2w时NR1和NR2B在海马脑片各区的表达强度,和其在生后大鼠海马结构中的表达较相似.

海马脑片缺氧缺糖模型的制备方法

离体神经组织培养尤其是海马脑片培养,可以弥补在体动物实验方面的一些局限性,是现代神经科学工作者常用的研究方法之一.实验证实,离体海马脑片缺氧缺糖培养模拟"脑缺血",可以重现在体动物实验时海马各区对缺血敏感性不同的特点[1],所以许多学者利用海马脑片缺氧缺糖培养模型来研究缺血性脑损伤的细胞和分子机制.目前海马脑片缺氧缺糖模型的制备有多种,但各方法间存在着差异,本文对目前运用较多的浸没法、充N2法和三气缺氧培养箱法进行了比较,并将其中两种方法予以结合,以期为海马脑片缺氧缺糖模型的应用提供参考.

大鼠中脑黑质器官型脑片与在体发育黑质结构的形态学比较

目的:比较不同时间离体培养黑质脑片与在体发育黑质结构的形态学变化.方法:选出生当天SD大鼠,制备中脑黑质器官型脑片(厚度350 μm).用Millicell-CM微孔膜脑片离体培养技术分别培养脑片至7、14、21和28 d,光镜观察,常规苏木精-伊红染色及酪氨酸羟化酶(TH)免疫组化反应染色,并与同龄SD大鼠作形态学及TH阳性反应细胞计数比较.结果:培养0～28 d内器官型脑片黑质细胞的体积及细胞密集程度均小于同期在体发育的黑质结构,离体培养与同期在体发育的黑质结构比较,TH阳性反应细胞趋于幼稚,细胞间连接也出现较晚,两者细胞计数比较有统计学意义(P＜0.05).结论:SD大鼠黑质发育的成熟时间约为生后14 d;离体培养的黑质脑片与在体生长的黑质结构发育过程相似,但离体培养的黑质脑片发育滞后于在体发育的黑质结构.

离体培养海马脑片与在体发育海马结构形态学比较研究

目的观察离体培养海马脑片与在体发育海马结构中锥体细胞和颗粒细胞的形态变化,比较两者间的差异,为海马脑片的应用提供形态学资料.方法海马脑片培养技术,常规组织H-E染色及光镜下观察,体视学原理定量分析.结果随着培养时间的延长,海马脑片阿蒙角锥体层数逐渐减少,CA1区和CA3区细胞的面数密度也逐渐减少,培养2周(C2w)时CA1区锥体细胞的面数密度高于在体发育3周(P3w)时锥体细胞的面数密度;齿状回颗粒细胞的面数密度渐增加,且齿状回颗粒细胞有从背侧支向腹侧支迁移的趋势.结论离体培养海马脑片的发育与在体海马结构的发育模式相似,但离体培养海马脑片的发育滞后于生后发育早期大鼠海马的发育.

海人藻酸损伤成年大鼠纹状体后Nestin表达的变化/NMDA受体亚单位NR1、NR2A、NR2B在生后大鼠海马的免疫组织化学表达/MK-801对海马脑片培养缺氧缺糖损伤中bcl-2、bax蛋白质表达的影响/局灶性脑缺血后修复蛋白表达与细胞凋亡影响的实验研究

SDF-1α和CXCR4在低氧缺糖海马脑片中的表达变化

目的 研究海马脑片低氧缺糖损伤后SDF-1α和CXCR4蛋白的表达变化情况.方法 运用脑片培养技术建立低氧缺糖海马脑片模型,用免疫组化法和Western blot法检测SDF-1α和CXCR4的表达变化.结果 低氧缺糖损伤前后海马脑片中均可见SDF-1α和CXCR4表达的阳性细胞,其胞膜和胞质呈棕黄色着色,其中部分轴丘可见CXCR4阳性蛋白表达.Western blot发现,损伤后在分子量为11 ku和43 ku处分别检测到SDF-1α、CXCR4阳性条带;与正常对照组相比,OGD组SDF-1α和CXCR4表达均增加,其中SDF-1α表达增加差异有统计学意义(P<0.01).结论 海马脑片缺氧缺糖损伤后SDF-1α蛋白表达增加,提示SDF-1α可能与海马脑片低氧缺糖损伤密切相关.

亚硝基化在锰致蛋白二巯基异构酶活性改变中的作用

目的 观察亚硝基化在锰致蛋白二巯基异构酶活性改变中的作用. 方法 以胎大鼠脑片为模型,实验分4组,分别为对照组,正常DMEM培养液;锰处理组,含400 μM锰的DMEM培养液;低剂量L-刀豆氨酸硫酸盐(L-Can)预处理组,用0.5 mML-刀豆氨酸硫酸盐预处理脑片12 h后,再用含400μM锰的DMEM培养液;高剂量L-刀豆氨酸硫酸盐预处理组,用2mML-刀豆氨酸硫酸盐预处理脑片12 h后,再用含400μM锰的DMEM培养液.37℃孵育24 h.检测下列指标:蛋白二巯基异构酶(PDI)蛋白活性,PDI的基因和蛋白表达,以及PDI亚硝基化情况,NO生成量、诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)活性. 结果 锰可活化iNOS,使细胞内PDI亚硝基化水平升高,降低PDI正常活性.L-刀豆氨酸硫酸盐可抑制神经细胞损伤后iNOS的活性、降低NO的生成量,降低PDI蛋白亚硝基化水平. 结论 锰诱导iNOS活化,造成神经细胞内PDI蛋白亚硝基化,影响其正常功能;L-Can可以减轻锰所致的PDI蛋白亚硝基化水平,对锰致神经细胞损伤起到保护作用.

脑片培养在神经科学中的应用

早在1907年Harrison首次通过完善悬滴培养法进行神经系统培养,人们开始通过体外培养对神经领域进行探索.一个世纪以来,国内外学者从改进培养容器,培养条件及培养操作技术方法等多方而进行革新,发展了一系列神经系统体外培养的方法,使细胞或组织能够长期体外生存并保持功能,进一步进行观察、研究和操作.

不同培养条件对小鼠诱导性多能干细胞分化为神经元样细胞的影响

目的 研究小鼠诱导性多能干细胞(iPSC)在不同培养条件诱导下向神经元样细胞分化的能力.方法 将小鼠iPSC悬浮培养形成拟胚体,然后随机分为全反式维甲酸(ATRA)组、脑片共培养组和脑组织匀浆上清组,将其诱导分化成神经元样细胞.倒置显微镜下观察细胞形态变化;免疫荧光染色技术对其进行鉴定分析;Western blot法检测巢蛋白(nestin)、微管相关蛋白2(MAP2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.结果 小鼠iPSC在不同培养条件下都能够向神经元样细胞分化,这些神经元样细胞可以被神经细胞标志物nestin、MAP2标记;ATRA组的nestin、MAP2、GFAP蛋白相对表达量明显高于脑片共培养组和脑匀浆上清诱导组,但脑片共培养组和脑匀浆上清诱导组间无显著性差异.结论 脑片微环境和脑组织匀浆上清均可诱导小鼠iPS细胞向神经元样细胞分化,但效果不及ATRA组.