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端粒酶反义hTERT基因治疗抑制卵巢癌细胞生长的研究
端粒酶的激活与卵巢癌发生、进展有关.
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寡脱氧核糖核苷酸联合CA125共致敏树突状细胞对裸鼠人卵巢癌移植瘤生长抑制作用
目的 探讨含未甲基化“胞嘧啶-磷酸二酯键-鸟嘌呤(CpG)基序”的寡脱氧核糖核苷酸(CpG ODN)联合肿瘤表面抗原CA125共致敏树突状细胞(DC)对裸鼠人卵巢癌移植瘤生长的免疫抑制作用.方法 自人外周血分离培养DC,流式细胞术鉴定DC表型特征;应用CpG ODN2006联合CA125体外冲击致敏DC,并与T淋巴细胞共培养获得细胞毒性T淋巴细胞(CTL).建立人OVCAR3卵巢癌荷瘤裸鼠模型,CTL经皮下注射免疫荷瘤裸鼠,绘制移植瘤生长曲线,通过计算抑瘤率、细胞凋亡率评估其对裸鼠人OVCAR3卵巢癌移植瘤的免疫抑制作用.结果 分离培养DC低水平表达CD83、CD86,符合未成熟DC表型特征;联合致敏DC与T淋巴细胞共培养后获得CTL,经皮下免疫治疗,肿瘤出现延迟生长,抑瘤率达50.71％,抑瘤效果优于单纯CpG ODN致敏组和单纯CA125致敏组,差异有统计学意义(P＜0.05).联合致敏组和单纯CpG ODN致敏组肿瘤细胞凋亡率分别为(29.6±3.0)％和(21.8±2.7)％,均显著高于未致敏组和CA125致敏组(P＜0.05).结论 CpGODN联合CA125共致敏DC体外活化的CTL可有效抑制卵巢癌移植瘤生长,促进瘤细胞凋亡.
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脂质体转染细胞周期素A反义脱氧寡核苷酸对HL-60细胞增殖及凋亡的调控作用
目的探讨脂质体转染细胞周期素A(cyclin A)反义脱氧寡核苷酸(ASON)对HL-60细胞增殖及凋亡的影响.方法采用脂质体转染技术将cyclin A ASON与HL-60细胞共同培养,用MTT法绘制细胞生长曲线,用电镜、细胞原位凋亡检测(POD)等方法观察细胞凋亡,用流式细胞术(FACS)及RT-PCR法检测cyclin A、bcl-2表达,并通过裸鼠成瘤实验验证cyclin A在白血病发生中的作用.结果脂质体转染cyclin A ASON组和cyclin A ASON组的HL-60细胞生物抑制率分别为68.9%和24.8%(P<0.01).脂质体转染cyclin A ASON组cyclin A及bcl-2表达水平(1.1%和21.9%)较对照组(38.8%和65.0%)明显减低(P值均<0.01),并能检测出DNA断裂,观察到凋亡细胞.裸鼠实验中发现脂质体转染cyclin A ASON组与对照组相比,其成瘤率低,成瘤时间延长,同一时间成瘤的瘤体体积明显缩小.结论脂质体转染cyclin A ASON能在体外及动物体内明显抑制白血病细胞的生长,且有诱导细胞凋亡的作用,可能会成为基因治疗的一个新靶点.
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c-fos反义寡脱氧核苷酸对β-淀粉样蛋白31～35神经毒作用的影响
目的研究c-fos基因对β-淀粉样蛋白31～35神经毒的作用.方法培养原代小鼠皮层神经元,提前加入不同浓度的c-fos反义寡脱氧核苷酸,以DNA电泳分析和流式细胞技术检测其对β-淀粉样蛋白31～35致凋亡作用的影响.结果低浓度的c-fos反义寡脱氧核苷酸对β-淀粉样蛋白31-35所引起的神经元凋亡有保护作用.结论c-fos途径是β-淀粉样蛋白31-35神经毒作用的必需途径.
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转录因子decoy基因治疗的研究进展
转录因子decoy基因治疗是近年来受到关注的一个新类型的抗基因策略(decoy策略).向细胞内转染转录因子decoy寡核苷酸可竞争性地俘获活化的转录因子,快速、有效、靶向性地抑制转录因子的活性,从而抑制下游基因的表达,其治疗作用已经在许多疾病的动物实验研究中得到证实,并在临床治疗中得到初步应用.该文就decoy的特征、decoy策略的动物实验研究、临床研究及应用前景作一综述.
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抗CD80或CD86的反义寡脱氧核糖核苷酸转导树突状细胞延长同种异基因移植的存活时间
同种异体移植发生排斥反应是临床中常见而又棘手的问题.已知树突状细胞(DC)诱导免疫反应还是免疫耐受取决于其所处的状态,成熟树突状细胞(mDC)由了高表达组织相容性Ⅱ类分子(MHHCⅡ)和协同刺激分子而诱导T细胞反应,非成熟树突状细胞(iDC)低表达协同刺激分子而抑制T细胞反应.然而在临床中无法用iDC来诱导T细胞耐受,因为在机体应激和感染状态下它会转化为mDC.此外,利用腺病毒载体调节树突状细胞表达免疫抑制分子来诱导免疫耐受也无法得到满意的结果,因为腺病毒本身作为外来抗原可诱导免疫应答,因此需要寻找一条新的途径来克服或减少同种异体移植中发生排斥反应的几率.
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胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸-脱氧寡核苷酸抑制疟原虫红前期发育
目的 观察胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸-脱氧寡核苷酸(cytidine-phosphate-guanosine oligodeoxynucleotide,CpG ODN)对疟原虫红前期发育的影响. 方法 通过构建约氏疟原虫BY265株18S rRNA外标准品质粒.与小鼠三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)内标准品共同组成TaqMan RT-PCR分析模型.用不同剂量(0.05×105、0.1×105、0.5×105、1×105和2×105个)约氏疟原虫唾液腺子孢子感染BALB/c小鼠.42 h后处死小鼠取其肝脏,制备约氏疟原虫cDNA进行Taq Man RT-PCR反应,以小鼠肝脏虫荷指标检验模型的有效性.将12只BALB/c小鼠随机均分为CpG组、CpG对照组和PBS对照组,CpG组和CpG对照组小鼠分别尾静脉注射脱氧寡核苷酸1826(ODN1826)及其对照(ODN1826 control)各30 μg,PBS对照组注射0.01 mol/LPBS溶液200 μl.24h后各组每鼠感染100个子孢子,于感染后42 h处死小鼠取肝脏,制备约氏疟原虫cDNA进行TaqMan RT-PCR,定量分析感染疟原虫24h前CpGODN预处理小鼠肝脏虫荷的变化. 结果 构建的约氏疟原虫外标准品质粒所插入的BY265株18S rRNA基因与17XNL株18S rRNA基因相似性为98%,它与小鼠GAPDH内标准品共同组成的TaqMan RT-PCR分析模型能够正确反映小鼠肝脏虫荷与唾液腺子孢子感染量的正比关系.感染疟原虫24 h前给予CpG ODN处理,CpG组小鼠肝脏虫荷为CPG对照组的1/5(0.28/1.33),两者差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 本实验建立的TaqMan RT-PCR分析模型适用于红前期疟原虫(肝脏)虫荷指标的研究.CpG ODN能显著抑制红前期疟原虫的发育.
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与启动子序列相同的单链寡聚脱氧核苷酸拮抗胰岛素对人α1(Ⅰ)型胶原启动子的激活
目的探讨正义单链寡脱氧核糖核苷酸(ssPTODN)抑制胰岛素对人α1(Ⅰ)型胶原(COL1A1)基因启动子的激活.方法(1)将含有氯霉素乙酰基转移酶(CAT)基因与人COL1A1基因-2483～+42 bp片段的重组质粒(pCOLH12.5)稳定转染至NIH3T3细胞,加入不同剂量的胰岛素,测CAT值;(2)合成全硫代的ssPTODN,其序列为COL1A1基因-129～-105的25个碱基.稳定转染的细胞克隆内加入不同剂量的ssPTODN共孵育24 h,加入2.5 μmol/mL的胰岛素,测定CAT值.结果(1)胰岛素浓度(μmol/mL)在0,0.25,2.5,10时的CAT值(pg/mL)分别是920±94,1 021±99,1 595±81,1 711±121.2.5μmol/mL及10 μmol/mL的胰岛素显著增加了COL1A1基因启动子活性(P＜0.05);二者的作用差异无显著性(P＞0.05).(2)胰岛素剂量为2.5μmol/mL,ssPTODN浓度(μg/mL)分别为0,20,40,80时,各组的CAT值(pg/mL)相应为1 660±104,1 625±64,1 396±76,1 040±135;ssPTODN浓度为80 μg/mL时,受胰岛素刺激所增加的CAT值得到显著抑制(P＜0.05),回复到基础水平附近.结论ssPTODN能够抑制胰岛素对人COL1A1基因启动子的激活.
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SiRNA联合asODN靶向逆转白血病细胞多药耐药的研究
目的:探讨靶向多药耐药基因(MDR-1)的siRNA和asODN联合应用逆转人白血病耐药细胞K562/A02的效果.方法:设计并合成针对MDR-1基因同一序列的siRNA和asODN及阴性对照siRNA,采用转染试剂lipofectin2 000分别转染人白血病耐药细胞K562/A02;利用RT-PCR检测MDR-1mRNA和Westem Blot检测MDR-1蛋白质的表达;采用罗丹明123外排实验检测P-糖蛋白(P-gp)的转运功能,MTT法检测K562/A02细胞对阿霉素的耐药逆转效果.结果:siRNA、asODN、asODN和siRNA联合应用均能降低MDR-1mRNA和蛋白质的表达,提高P-gp的转运功能,对阿霉素的敏感性明显恢复,asODN和siRNA联合应用效果明显提高(P＜0.05),低浓度的siRNA(200 nmol/L)比高浓度的asODN(5 μmol/L)的效果强(P＜0.05).结论:siRNA、asODN能有效地逆转人白血病耐药细胞K562/A02的多药耐药,asODN和siRNA联合应用效果明显加强.
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脂质体介导寡脱氧核糖核苷酸转染人视网膜色素上皮细胞的转染率及分布测定
目的:观察阳离子脂质体LipofectamineTM 2000 介导的寡脱氧核糖核苷酸(ODNs)在体外培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞中的转染效率及其在细胞中的分布.方法:在阳离子脂质体LipofectamineTM 2000的介导下将人工合成的FAM荧光标记的ODNs转入人RPE细胞中,荧光显微镜下观察转染后20 min、1 h、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h其在细胞内的分布,流式细胞仪检测其在RPE细胞中的转染效率;并用MTT法检测脂质体处理组、脂质体-ODNs复合物处理组和正常对照组的细胞增生活性,观察脂质体的毒性.结果:LipofectamineTM 2000能迅速将FAM-ODNs转入人RPE细胞的胞质和胞核内,4～6 h达高峰,转染效率高达(85.85±5.75)%,与其他时点比较差异有统计学意义(P<0.05),24 h后其转染率还有(70.11±5.81)%;且脂质体对RPE细胞无明显细胞毒性,3组间细胞增生活性比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论:LipofectamineTM 2000能有效地将FAM-ODNs转入人RPE细胞中,可作为一种安全有效的基因转移载体用于基因治疗.
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血管内皮生长因子反义寡核苷酸体外抑制皮肤血管瘤内皮细胞的增殖
目的 观察血管内皮生长因子(VEGF)反义寡核苷酸对皮肤血管瘤内皮细胞体外增殖及生物学特性的影响,并探讨其机制.方法 体外培养皮肤血管瘤内皮细胞;脂质体介导VEGF反义寡核苷酸进行转染;MTT法观察其对内皮细胞生长的抑制;免疫细胞化学技术检测VEGF的蛋白表达;流式细胞仪分析细胞周期变化.结果 VEGF反义寡核苷酸作用后的内皮细胞生长明显受到抑制,作用后48 h VEGF蛋白表达明显下降,细胞周期中S期细胞数明显减少,并于72 h后抑制效应逐渐减弱.结论 VEGF反义寡核苷酸能显著抑制皮肤血管瘤内皮细胞的生长,其机制是抑制细胞的增殖,而不是促进其凋亡.
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负载肿瘤抗原的DC疫苗对小鼠体内膀胱肿瘤的抑制作用
目的 研究负载肿瘤抗原的DC疫苗对T739小鼠体内膀胱肿瘤的免疫学效应.方法 建立BTT 739荷瘤小鼠动物模型,随机分为实验组和实验对照组和空白对照组,于肿瘤细胞接种后第7、14天给予相应DC疫苗治疗,每组分2亚组,分别用于测量瘤质量、体积及用于观察荷瘤小鼠存活情况.结果 负载肿瘤抗原的DC疫苗实验组荷瘤鼠肿瘤平均体积和平均瘤质量均显著低于对照组(P＜0.01),生存期长于对照组,并且有2只小鼠无瘤长期存活.经DC疫苗实验组治愈的2只小鼠30 d后无肿瘤生长,再次皮下接种BTT739细胞观察30 d仍无肿瘤发生.结沦负载肿瘤抗原的DC疫苗对膀胱肿瘤荷瘤小鼠具有抑瘤效应和生存期延长作用.
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CpG-ODN治疗小鼠膀胱肿瘤的实验研究
目的 探讨含CpG序列的寡脱氧核糖核苷酸(CpG Oligodeoxynucleotide, CpG-ODN)对小鼠膀胱肿瘤的治疗作用.方法 建立BTT739荷瘤小鼠动物模型,随机分为CpG-ODN治疗组和PBS对照组,于肿瘤细胞接种后第7、14天给予治疗,每组分两亚组,分别用于测量瘤重、体积及用于观察荷瘤小鼠存活情况.ELISA法检测小鼠血清中IL-12水平.流式细胞仪检测肿瘤组织中浸润性树突状细胞表面共刺激分子CD80、CD86的表达.结果 第2次治疗7d后,平均瘤重CpG-ODN组为(3.30±0.81)g,对照组为(4.50±0.47)g(P<0.01),平均体积CpG-ODN组为(3.57±0.84)cm3,对照组为(4.84±0.58)cm3(P<0.01),CpG-ODN组荷瘤小鼠生存期长于PBS对照组(P<0.05).治疗组及对照组小鼠血清中IL-12浓度分别为(391.5±28.4)pg/mL和(257.2±13.7)pg/mL(P<0.01).肿瘤组织中浸润性树突状细胞(Tumor infiltrating dendritic cell, TIDC)表面CD80、CD86表达水平治疗组分别为(17.75±3.13)%、(18.72±2.79)%,对照组分别为(11.32±1.18)%(P<0.01)、(12.65±1.22)%(P<0.01).结论 CpG-ODN对膀胱肿瘤荷瘤小鼠具有抑瘤效应和生存期延长作用,其机制主要是通过诱导DC成熟、促进Th1型细胞因子分泌、诱导免疫应答向Th1细胞分化.
