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白细胞介素4对重症急性胰腺炎大鼠补体调节因子的影响
本研究将白细胞介素4(IL- 4)应用于重症急性胰腺炎(SAP)大鼠模型,观察其对膜辅助蛋白(MCP)、衰变加速因子(DAF)和膜反应性溶解物抑制物(CD59)表达的影响及疗效,为SAP的治疗提供新的思路.
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重症肌无力患者FOXP3表达变化与体液免疫异常的相关性
目的 探讨重症肌无力(MG)患者外周血叉头样转录因子P3(FOXP3)表达变化与体液免疫异常的关系.方法 利用RT-PCR技术检测41例MG患者和20名体检健康者外周血单个核细胞FOXP3、B淋巴细胞激活因子(BLyS)、补体调节因子膜反应性溶解抑制物(CD59)和衰变加速因子(DAF)的mRNA表达,用ELISA法检测外周血清转化生长因子(TGF-β1)、抗乙酰胆碱受体抗体(anti-AChR-IgG)水平,并进一步分析其间的关系.结果 (1) MG患者组外周血FOXP3、CD59、DAF的mRNA表达及血清TGF-β1水平明显低于健康对照组,BlyS mRNA表达水平明显高于健康对照组(均P<0.01);(2)外周血FOXP3、BLyS、CD59、DAF的mRNA表达及血清TGF-β1水平,在眼肌型与全身型MG患者间差异无统计学意义;(3)41例MG患者中血清抗AChR-IgG阳性30例,眼肌型(18例)和全身型(12例)血清抗AChR-IgG水平差异无统计学意义(P＞0.05);(4)MG组外周血单个核细胞FOXP3 mRNA表达与血清TGF-β1水平及CD59、DAF mRNA表达水平呈正相关(分别r=0.84, P<0.01;r=0.455, P<0.05;r=0.435, P<0.05),与BLyS mRNA表达呈负相关(r=-0.58, P<0.05);血清抗AChR-IgG抗体阳性患者中,抗AChR-IgG抗体水平与FOXP3 mRNA表达水平、血清TGF-β1水平呈负相关(分别r=-0.77、r=-0.81, 均P<0.01),而与BLyS mRNA表达水平呈正相关(r=0.757,P<0.01),与CD59、DAF mRNA水平无相关性(P>0.05).结论 FOXP3 mRNA、TGF-β1低表达可能促进B细胞活化,进而通过增加AChR抗体产生及抑制补体调节蛋白活化促进体液免疫,在MG发病中起重要作用.
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异种移植转基因用含杂合增强子UI的人衰变加速因子重组基因的构建
目的:构建含杂合增强子UI的人衰变加速因子(DAF)重组基因的表达载体,应用于转基因动物克服异种器官移植排斥反应的研究.方法:ClaI/EcoRI双酶切质粒pXMT2得到UI增强子插入片段(03 Kb),将其插入pBluescriptⅡ SK+克隆载体的相应酶切位点之间;XbaⅠ/BamHⅠ双酶切质粒pGEM-7zf-DAF,得到含人ICAM-2启动子及DAF cDNA序列的插入片段(3.7 Kb),将其也插入到pBluescript Ⅱ SK+克隆载体的相应酶切位点之间.随后转化细菌,阳性转化菌落质粒抽提及酶切鉴定.设计引物行PCR特异扩增检验.结果:特异性3组酶切重组载体均产生了符合要求的相应条带;PCR扩增出特异的330 bp及321 bp的片断,符合设计要求.结论:含杂合增强子UI的人衰变加速因子(DAF)重组基因的表达载体构建成功.
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使用人粘附分子-2启动子的衰变加速因子重组基因表达载体的构建及意义
目的:构建含人粘附分子-2(ICAM-2)启动子的人衰变因子(DAF)重组基因的真核细胞表达载体,运用于转基因动物克服异种器官排斥的研究.方法:双酶切本室已构建质粒pGEM-7Zf-DAF,得到含人ICAM-2启动子及DAFcDNA序列的插入片段(3 7Kb);双酶切pcDNA3真核表达载体,得到不含病毒启动子、含筛选基因Neo的一段DNA作为载体序列(4.4Kb);两段DNA进行连接反应后转化细菌;阳性转化菌落质粒抽提及酶切鉴定.根据人的ICAM-2启动子、DAFcDNA序列,设计引物行PCR特异扩增检验.结果:特异性3组酶切重组表达载体,产生符合设计的相应条带;PCR扩增出特异的318bp及1.7Kb的DNA片段,符合设计要求.结论:含人ICAM-2启动子的DAF重组基因表达载体获得成功.
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衰变加速因子在神经病理性疼痛中的作用
目的 观察衰变加速因子(DAF)在2种外周神经损伤模型大鼠脊髓背角的表达情况,旨在探索它在神经病理性疼痛(NPP)发病机制中的作用.方法 将60只健康雄性SD大鼠分为假手术组、CCI组和SNI组3组,按分组制作模型,分别于术前及术后1,3,7d,用热刺激和机械刺激法测定大鼠的痛阈值变化,评估其可靠性后,于术后7d处死大鼠,取L4-6段脊髓背角,用Western-blot和免疫组化两种技术测定其DAF蛋白含量.结果 CCI组和SNI组大鼠于术后1,3,7d痛阈值降低,与假手术组比较有显著性差异,表明模型制作成功.Western-blot检测显示,3组模型大鼠脊髓背角DAF表达发生不同程度降低,CCI组和SNI组与假手术组相比有显著性差异.免疫组化染色显示:CCI组、SNI组大鼠脊髓背角DAF阳性细胞较假手术组显著减少.结论 NPP大鼠脊髓背角CD55蛋白表达下降,可能是此处发生补体级联反应的重要原因,CD55在NPP的形成中发挥作用.
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人衰变加速因子的二级结构与B细胞表位预测
目的：分析预测人衰变加速因子的二级结构特征及B细胞表位。方法：比较Chou & Fasman经典方案和基于多重序列比较的PHDsec二级结构预测方案的预测准确率，应用较优方案对DAF的二级结构进行预测分析；运用Hopp & Woods的亲水性方案及PHDacc可及性方案预测DAF的亲水性和可及性，结合DAF的二级结构特征，分析预测DAF的B细胞表位。结果：PHDsec方案对SCR的预测准确率明显高于Chou & Fasman方案，DAF的SCR1-4中无α螺旋，仅包含β折叠及袢；推测可能的抗原表位位于Pro73-Val79、Arg130-Leu139及Glu156-Cys163；SCR1、SCR2与SCR3、SCR4在亲水性及二级结构分布方面具有较大差异。结论：研究的分析预测结果将有助于确定DAF的B细胞表位及其生物学活性部位。
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增加衰变加速因子可改善实验性自身免疫性脑脊髓膜炎
衰变加速因子(Decay accelerating factor,DAF)作为一种位于细胞膜表面的补体调节成分,不仪可阻止C3和C5转化酶的装配,并且可通过诱导催化亚单位C2a的快速解离而使已形成的C3、C5转化酶失去稳定性,进而抑制C3a和C5a(前炎性成分)的产生.而C3a和C58在体内不仅可以介导炎症反应,而且可以通过与位于抗原提呈细胞和(或)T细胞表面的受体相结合而促进Th1和Th17的产生和存活.
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衰变加速因子及其所在膜微区在T淋巴细胞信号传递中的作用
低温抽提Jurkat细胞膜去污剂抗性的膜成分(DIG),检测Src家族酪氨酸激酶(PTK)及衰变加速因子(DAF)的分布情况.共聚焦扫描显微技术检测Jurkat细胞静息与交联状态下DAF分子对去污剂Triton-X100的抗溶性,以探讨其在Jurkat细胞免疫识别中的作用,结果显示静息状态CD3对去污剂无抗溶性,而DAF与Lck有抗溶性.单抗交联后CD3对去污剂抗性有所增加.静息状态DAF与Src家族PTK特异分布于膜微区中,交联CD3可诱导CD3与膜微区特异性聚集,DAF所在的膜微区可能促进T细胞的免疫识别和信号传递作用.
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衰变加速因子介导Jurkat细胞的PTK信号传递机制的实验研究
为研究衰变加速因子(DAF)介导Jurkat细胞信号传递的机制,本文应用免疫印迹及化学发光技术(ECL)发现交联DAF单抗可使CD3+与CD3Jurkat细胞总蛋白酪氨酸磷酸化水平增加,但磷酸化水平不同.免疫共沉淀实验检测到DAF与Src家族酪氨酸激酶(Src PTK)可发生共沉淀反应.去污剂不溶膜复合物(DIG)抽提与鉴定检测到DIG内有Sre PTK与DAF的特异性聚集.说明DAF对Jurkat细胞的信号传递有辅助激活效应,此效应可能是通过其以与膜微区相关的所联系的Src PTK实现的.
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病毒受体陷阱与病毒性心肌炎
柯萨奇B组病毒(CVB)是引起人类病毒性心肌炎(VM)的常见病原体,CVB感染心肌细胞主要是通过与柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)及衰变加速因子(DAF/CD55)这2种受体蛋白的相互作用完成.近年来,病毒受体陷阱(vires receptor trap)已被用于治疗实验性小鼠CVB3心肌炎,并已显示出良好的抗病毒效果.所谓"病毒受体陷阱疗法"是指利用人工合成的可溶性病毒受体来结合病毒,从而阻断病毒与靶细胞膜上的受体结合及随后的病毒内吞.病毒受体陷阱疗法加深了对VM发病机制的理解,拓展了VM的治疗策略,有望成为急性VM一个新的有效治疗手段.
关键词： 病毒受体陷阱 心肌炎 柯萨奇B组病毒 柯萨奇病毒和腺病毒受体 衰变加速因子 -
补体过度激活与自身免疫型复发性流产的关系
目的 建立自身免疫型复发性流产( RSA)小鼠模型,探讨补体在自身免疫型RSA发病机制中的作用.方法 采用子宫注射人β2GP-1免疫Balb/c小鼠(子宫β2GP-1注射组,n=15)；分别以子宫无关蛋白注射组(n=6)、子宫佐剂注射组(n=13)、子宫生理盐水(NS)注射组(n=10)及正常未孕组(n=10)、正常妊娠组(n=15)作为对照.比较各组小鼠胚胎丢失率、胎盘平均质量、外周血补体C3浓度及胎盘组织衰变加速因子(DAF)的质量浓度.结果 子宫β2GP-1注射组小鼠胚胎丢失率显著高于正常妊娠组和各子宫注射对照组(P＜0.05),胎盘平均质量显著低于正常妊娠组和各子宫注射对照组(P＜0.05),外周血补体C3水平和胎盘组织DAF的质量浓度显著低于正常妊娠组和各子宫注射对照组(P＜0.05).结论 通过子宫注射人β2GP-1的方法可诱导建立符合自身免疫型RSA临床特征的小鼠模型,补体系统过度激活可能是自身免疫型RSA的发病机制之一.
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AA、MDS、PNH患者CD55、CD59检测的临床价值
Lewis[1]等认为再生障碍性贫血(AA)、骨髓增生异常综合证(MDS)和阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)之间存在着相互转化和(或)并存.以往用来诊断PNH的实验方法存在着特异性差、敏感度高或特异性好但敏感度低等缺点,且三者的组织病理学之间有许多相似之处,故部分PNH患者和PNH样病变的AA、MDS患者不能及时确诊.
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衰变加速因子在宫颈癌中的表达及其生物学意义
目的 探讨衰变加速因子(DAF)在宫颈癌中的表达及其生物学意义.方法 以宫颈癌细胞系ME180、宫颈癌组织和癌旁正常组织为材料,采用real-time PCR和western blotting检测DAF基因的mRNA和蛋白质表达水平;用3H-胸腺嘧啶核苷酸掺入量(3H-thymidine incorporation,3H-TdR)检查宫颈癌细胞的增殖,用Transwell小室法评估宫颈癌细胞的迁移能力.结果 DAF的表达在宫颈癌组织中明显高于其配对的癌旁正常组织,抑制DAF基因的表达能明显降低ME180细胞的增殖、迁移能力.结论 DAF在宫颈癌细胞中的高表达可能是肿瘤细胞免疫逃逸的重要机制,对宫颈癌的发生发展有重要的生物学意义.
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携带人衰变加速因子基因转基因小鼠的建立
目的 通过建立转人衰变加速因子(DAF)基因小鼠,为研究异种器官移植的超急性排斥反应提供有效的研究手段.方法 采用受精卵显微注射技术,将人DAF基因导人小白鼠受精卵的原核中.Dot-blot及Southern-blot杂交确定阳性转基因小鼠.以Northern杂交法检测人DAF基因的表达情况.结果 基因注射后共生出小鼠24只,4只为转基因小鼠,人DAF基因在其中1只小鼠体内得到表达.结论 所导入的人DAF基因在小鼠的基因组中实现整合及表达.
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人α1,2-岩藻糖苷转移酶和衰变加速因子基因转移克服异种移植急性血管排斥反应的研究
目的 观察人α1,2-岩藻精苷转移酶(HT)和衰变加速因子(DAF)基因转移对抑制血管内皮细胞激活从而克服异种移植急性血管排斥反应的能力.方法 通过显微注射建立转基因小鼠动物模型,Southern印迹杂交和流式细胞汁数筛选出人HT和/或DAF基因整合与表达阳性的子代转基因小鼠.研究表达不同目的 基因的转基凶小鼠血管内皮细胞与15%人血清孵育后溶破细胞的百分数,免疫细胞化学染色检测细胞核因子(NF)-κB的激活,流式细胞计数检测细胞表面血管细胞黏附分子(VCAM)-1的表达.结果 子代小鼠血管内皮细胞人HT/DAF共基因表达7只,人HT与DAF单基因表达分别为6只和8只.与15%人血清孵育后,人HT/DAF共表达组细胞的溶破细胞百分数(4±2)%低于人HT表达组细胞(25±10)%、人DAF表达组细胞(31±11)%及正常组细胞(76±24)%(P均＜0.05).转双基因抑制细胞NF-κB激活的能力强于转入HT或DAF单基因,且转双基因细胞表面VCAM-1的表达较转单基因细胞显著降低,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 人HT/DAF基因联合转移具有部分抑制血管内皮细胞激活从而克服异种移植急性血管排斥反应的能力.
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包含UI的人衰变加速因子重组基因在转基因鼠高效表达的研究
目的 建立血管内皮细胞高效表达人衰变加速因子(hDAF)基因的转基因小鼠.方法 采用受精卵显微注射法,将包含杂合内含子(UI)的人hDAF导入昆明白小鼠受精卵的雄原核内,然后将注射后仍健康的受精卵植入假孕母鼠输卵管内,待其自然分娩.应用聚合酶链反应(PCR)和Southern杂交检测G0代小鼠hDAF基因的整合情况,应用流式细胞计数(FCM)检测小鼠外周血单核细胞(PBMCs)表面hDAF的表达,应用逆转录(RT)-PCR检测转基因小鼠心脏、肝脏、肾脏和肺脏人hDAF基因mRNA的表达.结果 注射后卵的存活率和幼鼠出生率分别为83.8%(941/1123)和9.5%(89/941),外源基因的整合率为22.5%(20/89),FCM检测发现其中有7只转基因小鼠PBMCs有人hDAF表达,表达强度为人PBMCs的152%～243%,并且相应小鼠的心、肝、肾及肺组织均有人hDAF mRNA表达.结论 UI可以使hDAF在转基因鼠各主要脏器高效表达.
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补体激活调节因子在重症急性胰腺炎中的变化
补体系统的激活在重症急性胰腺炎(SAP)的发展过程中起了重要的作用,这一点已经被既往的研究所证实[1],我们通过对大鼠SAP膜辅助蛋白(MCP,CD46)、衰变加速因子(DAF,CD55)、20KDa的膜反应性溶解抑制物(HRF20;CD59)表达的观察,来阐明RCA在SAP中的作用.
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人衰变加速因子在CHO细胞的表达及其衰变加速活性研究
目的获得稳定表达人衰变加速因子(human decay-accelerating activity,hDAF)的中国仓鼠卵巢(Chinese hamsterovary,CHO)细胞系,观察在补体活化情况下,hDAF对异种细胞的保护作用.方法构建真核表达载体DAF-pcDNA3.1,用脂质体转染法将其导人CHO细胞,有限稀释法筛选稳定表达hDAF的单细胞克隆,流式细胞仪检测hDAF的表达,C3沉积实验和51Cr释放法测定其促补体衰变活性.结果成功构建了真核表达载体DAF-pcDNA3.1,并获得了表达hDAF的单细胞克隆,表达hDAF的CHO能减少补体C3的沉积,减弱补体的杀伤作用.结论获得在细胞膜上稳定表达具功能活性的hDAF的CHO克隆,为进一步研究其结构与功能的关系准备了条件.
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衰变加速因子在Jurkat细胞增殖及分泌IL-2中的作用
目的研究衰变加速因子对CD3阳性与阴性Jurkat细胞的增殖效应及对IL-2分泌的影响.方法应用MTT比色实验观察交联DAF单抗DG3与固相化抗CD3联合作用对CD3阳性与CD3阴性Jurkat细胞增殖效应;IL-2依赖CTLL3H-TdR掺入实验检测CD3阳性与CD3阴性Jurkat细胞IL-2的分泌;细胞ELISA检测CD3阳性与CD3阴性Jurkat细胞IL-2R的表达.结果交联DG3可协助促进固相化抗CD3对CD3阳性Jurkat细胞的增殖效应和IL-2分泌,并可引起IL-2Re链表达增加,此作用可被Src家族酪氨酸激酶抑制剂PP2所抑制,而对CD3阴性Jurkat细胞无此作用.结论衰变加速因子可协同促进固相化抗CD3对CD3阳性Jurkat细胞的刺激增殖效应、IL-2分泌及IL-2R表达增加.
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衰变加速因子在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义
目的检测衰变加速因子(decay accelerating factor,DAF,CD55)在非小细胞肺癌(non-small cell lung carcinoma,NSCLC)中的表达,分析其表达与临床分期、化疗用药及预后的关系.方法免疫组化法检测8例NSCLC癌旁组织和36例NSCLC手术标本中DAF的蛋白表达,分析临床资料.结果免疫组化结果显示36例NSCLC标本中,共有18例(50.0%)表达DAF,其中18例肺鳞癌中有15例(83.3%)表达,而16例肺腺癌中有3例(18.8%)表达,两者有显著差异(P＜0.05);不同的病理分期的DAF免疫组化平均积分光密度表达有显著性差异(P＜0.05);DAF的表达与无病生存期无相关关系(P＞0.05).结论NSCLC中有DAF的表达,尤其是肺鳞癌;提示在NSCLC抗体治疗中应同时阻断DAF的免疫抑制效应.
