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促炎因子介导的体外培养人主动脉血管平滑肌细胞凋亡
目的:探讨促炎因子对体外培养的人主动脉平滑肌细胞有无致凋亡作用.方法:体外原代培养人主动脉平滑肌细胞,用免疫组化方法鉴定;肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)分别以浓度20μg/ml单独或二者共同与平滑肌细胞培养36 h,实验分4组:TNF-α组(T组)、IL-1β组(Ⅰ组)、TNF-α+IL-1β组(TI组)及对照组,采用流式细胞仪分析细胞凋亡及细胞周期.结果:①细胞凋亡分析显示:TI组两种因子的联合作用诱导人平滑肌细胞凋亡与对照组比明显增加,有显著性差异(P＜0.05),而二者单独作用未能诱导人平滑肌细胞凋亡.②细胞周期分析发现TI组在TNF-α+IL-1β刺激下,细胞增殖能力与其他组比有明显下降,有显著性差异(P＜0.05),生长逐渐停滞,而二者单独作用对细胞增殖有轻微刺激作用,但与对照组无显著性差异.结论:促炎因子TNF-α和IL-1β的相互作用,可以诱导人平滑肌细胞凋亡.
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胰岛素对人血管平滑肌细胞肾素-血管紧张素系统的影响及西拉普利的作用
目前认为胰岛素抵抗及高胰岛素血症与高血压病及冠心病的发生、发展密切相关[1,2],而血管组织局部肾素-血管紧张素系统(RAS)激活产生的血管紧张素Ⅱ可导致血管平滑肌细胞(VSMCs)肥大、增生并分泌细胞外基质而导致管腔狭窄.有研究表明,胰岛素可刺激大鼠血管平滑肌细胞表达血管紧张素原,上调血管紧张素转换酶(ACE)活性[3],但胰岛素对人血管平滑肌细胞RAS的作用却鲜有报道,本研究观察胰岛素对人血管平滑肌细胞RAS的影响及ACE抑制剂西拉普利的作用.
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氟伐他汀对白细胞介素-1β诱导的人血管平滑肌细胞一氧化氮合成的影响
经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)已广泛成功地应用于冠状动脉粥样硬化性心脏病患者的治疗.随着手术经验积累和设备改进,即刻成功率高达90%,但主要不足是术后仍有22%～32%的再狭窄发生率,故PTCA术后再狭窄的预防是介入心脏病学领域的热点课题.
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RhoA介导的脂蛋白a促血管平滑肌细胞迁移作用
目的:研究RhoA在脂蛋白(a)[Lp(a)]诱导的人血管平滑肌细胞(VSMC)迁移及细胞骨架构建中的作用.方法:用不同浓度的Lp(a)诱导VSMC,通过迁移试验观察VSMC迁移数量的变化,在不同时间点用免疫荧光标记肌动蛋白细胞骨架结构,激光共聚焦显微镜观察其变化情况.用脂质体将C3转移酶转移入VSMC阻断RhoA通路,再用Lp(a)诱导阻断后的细胞,激光共聚焦显微镜观察细胞骨架构建情况,迁移试验观察VSMC迁移数量的变化.结果:Lp(a)的终浓度为40～640 μg/ml,其诱导的迁移细胞数随Lp(a)终浓度的升高而增加(P《0.05).Lp(a)诱导10 min后,可见VSMC内出现张力纤维和丝状伪足;20 min后张力纤维明显增多;30 min后张力纤维较20 min时无明显变化.C3转移酶阻断RhoA通路,Lp(a)诱导20 min后,细胞内未见明显的张力纤维及丝状伪足.C3转移酶组迁移细胞数为(42.47±6.06)个,对照组为(76.47±6.28)个,C3转移酶组较对照组明显减少(P《0.01).结论:Lp(a)诱导的VSMC细胞骨架构建及细胞迁移依赖于RhoA的生物学活性.
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糜酶对培养人血管平滑肌细胞血管紧张素Ⅱ生成及细胞增殖的作用
目的拟从细胞水平观察阻断糜酶途径后对人血管平滑肌细胞生成血管紧张素(AngⅡ)及细胞增殖的影响.方法通过植块培养法获得人脐动脉血管平滑肌细胞,并分组为:①DMEM组(空白培养液对照组);②AngⅠ组;③AngⅠ+卡托普利组;④AngⅠ+糜酶抑素组;⑤AngⅠ+缬沙坦组.分别阻断血素紧张素转换酶、糜酶和AngⅠ受体,进行细胞计数、细胞增殖指数及培养液中AngⅡ含量的测定.结果药物干预组较AngⅠ组细胞数量减少(P＜0.01);糜酶抑素组与缬沙坦组能明显抑制细胞增殖(P＜0.01);糜酶抑素组的AngⅡ含量明显降低(P＜0.01),缬沙坦组则明显升高(P＜0.01).结论糜酶途径在血管平滑肌细胞AngⅡ生成及细胞增殖中起重要作用.
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西拉普利对胰岛素激活的人血管平滑肌细胞肾素-血管紧张素系统抑制作用
目的观察胰岛素对人血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖、血管紧张素原(ATG)和血管紧张素转换酶(ACE)活性的影响,以及血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)西拉普利对胰岛素刺激的VSMCs增殖及对肾素-血管紧张素系统(RAS)激活的抑制作用.方法胃左动脉源于3例行胃次全切除术后无高血压、糖尿病的中年男性患者,分离、消化动脉中膜后获得人VSMCs,经无血清DMEM培养24 h,使细胞同步后,加入1 000 μU/ml胰岛素和1×107～1×105mol/ml西拉普利孵育72 h,采用3H-TdR掺入法观察人VSMCs 3H-TdR掺入率;并经上述方法孵育24 h后,采用间接放射免疫法及ACE检测试剂盒测定细胞内及培养上清液中ATG浓度和ACE活性.结果与未经胰岛素刺激的细胞比较,经胰岛素刺激的人VSMCs的3H-TdR掺入率、细胞内及培养上清液中的ATG水平、ACE活性均显著增加,而在胰岛素刺激的同时加入不同浓度的西拉普利后,细胞的3H-TdR掺入率、细胞内及培养上清液中的ATG水平、ACE活性均显著下降,西拉普利对未经胰岛素刺激的细胞3H-TdR掺入率、ATG及ACE活性无影响.结论胰岛素可刺激人VSMCs增殖,这种作用部分与其激活RAS有关,西拉普利可抑制胰岛素刺激的细胞内及培养上清液中的ATG水平及ACE活性上调,抑制胰岛素刺激的人VSMCs增殖,上述结果可部分解释ACEI对存在胰岛素抵抗、高胰岛素血症及糖尿病的高血压、冠心病患者的血管起保护作用.
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糖基化终产物对人血管平滑肌细胞表达及分泌甲状旁腺激素相关肽和血管钙化的影响
目的：观察糖基化终末产物（AGEs）对人血管平滑肌细胞表达及分泌甲状旁腺激素相关肽（PTHrP）功能的影响，探讨PTHrP影响血管平滑肌细胞钙化发生的相关机制。方法：不同浓度的AGE-BSA分别与人血管平滑肌细胞孵育相同时间后，检测各组细胞钙含量及碱性磷酸酶（ ALP）活性判断钙化程度；酶联免疫吸附法检测各组细胞PTHrP的分泌量；实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测PTHrP、核心结合因子（ cbfα1）及骨形态发生蛋白2（ BMP-2）在各组细胞中的表达量。结果：随AGEs浓度增加，细胞中的钙含量及ALP活性增加（P＜0．05），而细胞分泌的PTHrP量逐渐减少（P＜0．05），且AGEs可促进cbfα1、BMP-2及PTHrP在血管平滑肌细胞的表达，这在较高浓度组较为显著（ P＜0．05）。结论：适当浓度的晚期AGEs可影响人血管平滑肌细胞PTHrP的表达水平及分泌量，促进钙含量增加，进而有助于血管钙化的发生。
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糜酶对人血管平滑肌细胞增殖血管紧张素Ⅱ生成及细胞增殖的影响
目的 探讨阻断糜酶途径对人血管平滑肌细胞血管紧张素(Ang)Ⅱ生成及细胞增殖的影响.方法 通过植块培养法获得人脐动脉血管平滑肌细胞,设立5组培养液并分组:对照组,AngⅠ组,卡托普利组,糜酶抑素组,缬沙坦组.对照组中仅为空白DMEM培养液,其他各组均加入AngⅠ(浓度均为10-8mol/L),此外卡托普利组、糜酶抑素组、缬沙坦组分别加入相应的干预药物(浓度均为10-4mol/L).作相应时间培养后测定各组细胞计数、细胞增殖指数及培养液中AngⅡ含量.结果 本实验成功培养出人血管平滑肌细胞,免疫组化染色示阳性细胞达95%以上.卡托普利组、糜酶抑素组及缬沙坦组细胞计数[(6.24±0.24)、(5.39±0.51)、(5.26±0.67)个]及刺激指数(1.273±0.121、1.175±0.098、1.128±0.038)均显著低于AngⅠ组[(7.43±0.33)个、1.424±0.168](均P＜0.01),而且糜酶抑素组较卡托普利组更低(P<0.01),与缬沙坦组相当;糜酶抑素组AngⅡ含量[(59.0±7.5)pg/ml]较AngⅠ组、卡托普利组及缬沙坦组[(150.0±30.2)、(169.0±20.5)、(220.0±29.0) pg/ml]更低(均P＜0.01),而缬沙坦组则显著高于其他所有组(P＜0.01).结论 糜酶在血管平滑肌细胞AngⅡ生成及细胞增殖过程中起着重要作用.
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重组腺病毒AdCat对血管平滑肌细胞
目的:探讨腺病毒载体介导的过氧化氢酶基因转染对体外培养的人血管平滑肌细胞增殖与凋亡的影响.方法:用含过氧化氢酶基因的重组腺病毒(AdCat)转染人血管平滑肌细胞,采用Western blot 方法检测血管平滑肌细胞过氧化氢酶的表达,应用细胞计数方法观察血管平滑肌细胞的增殖活性,应用流式细胞术和Hoechst 33258 染色等方法对血管平滑肌细胞的凋亡进行研究.结果:Western blot显示AdCat转染后血管平滑肌细胞过氧化氢酶表达明显增多;细胞计数显示AdCat组明显抑制细胞增殖,与阴性对照组、空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.01);流式细胞术显示AdCat组与阴性对照组、空白对照组比较凋亡率明显增加(P<0.01).经Hoechst 33258染色后,AdCat组凋亡细胞明显多于空白对照组.结论:重组腺病毒AdCat转染导致血管平滑肌细胞过氧化氢酶过度表达,抑制血管平滑肌细胞的增殖,促进血管平滑肌细胞的凋亡.
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YARA介导增强型绿色荧光蛋白穿透人血管平滑肌细胞
目的:研究细胞穿透肽YARA介导大分子蛋白穿透人血管平滑肌细施(human vascular smooth musle cells,HVSMC)细胞膜的能力.方法:用基因工程的方法制备并纯化YARA-EGFP融合蛋白,将其和培养的人平滑肌细胞共同孵育,在荧光显微镜下直接观察YARA介导目的蛋白EGFP转导入人平滑肌细胞的能力.结果:荧光显微镜下观察到,荧光蛋白穿透细胞膜进入并分布在入血管平滑肌细胞内.结论:YARA能有效携带目的蛋白进入人血管平滑肌细胞,这为将来用细胞穿透肽YARA介导有生物活性的大分子抗血管平滑肌细胞增殖,进行糖尿病血管病变的蛋白治疗奠定了基础.
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携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒的构建及其在人血管平滑肌细胞中的表达
目的:构建携带绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)基因的重组腺病毒质粒pAd-GFP,制备重组腺病毒Ad-GFP,并使GFP在血管平滑肌细胞中得到高效表达.方法:将线性化的穿梭质粒pRNAT-H1.1与腺病毒骨架质粒pAdeagy-1在感受态BJ5183内进行同源重组,并筛选出阳性重组子pAd-GFP;用Pac I酶切线性化pAdGFP,线性化的腺病毒质粒经脂质体转染AD293细胞,进行重组腺病毒的包装和扩增.采用CsCl密度梯度离心进行病毒浓缩和纯化.获得的腺病毒感染人血管平滑肌细胞(human vascular smooth muscle cell,hVSMC),观察其感染效率和GFP表达水平.结果:通过Pac I酶切证实腺病毒载体构建成功,包装出携带GFP基因的腺病毒,滴度达到4.5 × 1012pfu/mL,获得的腺病毒对hVSMC的感染效率约为100%.结论:利用细菌内同源重组方法成功地构建了携带绿色荧光蛋白的重组腺病毒,并能够在hVSMC细胞中高效地表达,为利用GFP作为报告基因的研究奠定了实验基础.
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人血管平滑肌细胞低密度脂蛋白受体的表达与神经肽Y关系的研究
目的:探讨人血管平滑肌细胞的低密度脂蛋白受体(LDL-R)的表达与神经肽Y(NPY)之间的关系,以阐明NPY在动脉粥样硬化的发生发展中的重要地位.方法:将第3～4代融合生长的hVSMC分成10-6mol/L NPY组和对照组,分别培养6,12,24,48h四个时间段后,进行荧光免疫组化染色,然后在激光扫描共聚焦显微镜系统下,定量观察NPY对人血管平滑肌细胞的LDL-R表达的影响.结果:各时间段中对照组hVSMC的LDL-R表达的平均荧光值分别为2527.45±209.22(6h),2476.66±210.28(12h),2442.65±189.16(24h)和2428.39±191.03(48h),各时间段之间均无显著性差异(P＞0.05);而各时间段中NPY组hVSMC的LDL-R表达的平均荧光值分别为2280.68±174.57(6h),1878.81±154.18(12h),1840.78±123.29(24h)和1721.68±143.45(48h),与相应时间段的对照组相比分别下降9.76%,24.14%,24.64%和29.10%(P＜0.01),且各时间段之间有显著性差异(P＜0.05),呈现一定的时间依赖效应.结论:人血管平滑肌细胞的LDL-R表达受NPY下调作用的影响,可导致LDL-R介导途径障碍,从而使LDL在血管壁中沉积,这可能是NPY参与动脉粥样硬化发生发展的重要机制之一.
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辛伐他汀调控RhoA对血管平滑肌细胞增殖与迁移及纤溶活性的影响
目的:探讨不同浓度辛伐他汀调控小G蛋白RhoA及下游激酶ROCK信号对人主动脉血管平滑肌细胞(HAVSMCs)增殖和迁移,以及组织纤溶酶原激活物(t-PA)和纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)表达的影响及作用机制.方法:应用不同浓度Simvastatin(0.1μmol /L、1μmol /L、10 μmol /L)处理HAVSMCs,CCK-8法和“划痕实验”分别检查细胞增殖和迁移能力,RT-qPCR检测RhoA mRNA及下游ROCK mRNA表达,应用RT-qPCR和ELISA检测纤溶活性相关t-PA/PAI-1mRNA及蛋白活性变化.结果:辛伐他汀呈浓度依赖性显著抑制HUASMCs的增殖和迁移能力.辛伐他汀能够显著抑制RhoA/ ROCK信号途径,诱导PAI-1 mRNA表达下调从而抑制蛋白分泌表达,同时上调t-PA mRNA表达从而增加蛋白分泌表达,以10 μmol/L辛伐他汀组处理24 h效果为显著.结论:辛伐他汀呈浓度时间依赖性抑制RhoA/ ROCK信号途径,并且上调tPA以及下调PAI-1基因转录及蛋白表达,从而促进纤溶,抑制细胞增殖和迁移.
