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急性缺氧对环匹阿尼酸诱导的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞内钙浓度升高的影响
目的：研究急性缺氧对Ca2+-ATPase抑制剂——环匹阿尼酸（CPA）诱导的大鼠远端肺静脉平滑肌细胞（PVSMC）内钙浓度（[Ca2+]i）升高的影响及机制。
方法：选用6只雄性SD大鼠（体重200~250 g），培养大鼠PVSMC，运用荧光显微镜和细胞内钙浓度检测系统观测CPA及急性缺氧（4%O2）对PVSMC的[Ca2+]i影响及钙池操纵性钙通道（SOCC）阻断剂氯化镍（NiCl2）和SKF96365的干预作用。
结果：含5μmol/L硝苯地平（电压依赖钙通道阻断剂）的无钙Krebs溶液孵育PVSMC，10μmol/L CPA使PVSMC的[Ca2+]i小幅度升高，急性缺氧能使[Ca2+]i升高幅度增加；恢复细胞外Ca2+至2.5 mmol/L后，10μmol/L CPA使[Ca2+]i显著升高，急性缺氧可导致CPA诱导的[Ca2+]i升高显著增强；SOCC阻断剂NiCl2（500μmol/L）和SKF96365（50μmol/L）均能明显抑制急性缺氧条件下CPA诱导的[Ca2+]i升高，但对高钾（60 mmol/L KCl）Krebs溶液引起的[Ca2+]i反应无影响。
结论：急性缺氧能够使CPA诱导的大鼠远端PVSMC的[Ca2+]i升高增强，[Ca2+]i升高可被SOCC阻断剂阻断，提示急性缺氧能够增强SOCC活性，使细胞外Ca2+通过SOCC内流增强，从而导致大鼠远端PVSMC的[Ca2+]i升高。 -
小鼠远端肺动脉平滑肌细胞的原代培养方法及其功能学特性鉴定
目的 建立小鼠远端肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的体外分离及原代培养方法,并鉴定其功能学特性.方法 采用体视显微镜下分离纯化小鼠远端肺动脉平滑肌组织,并采用复合酶联合消化法消化后进行体外培养;倒置显微镜下观察小鼠原代远端PASMCs的生长特点;免疫荧光染色法对细胞进行鉴定;荧光显微镜下观察以Fura-2-AM荧光探针示踪的钙离子,检测细胞高钾反应及钙池操纵性钙内流反应,评价细胞活力.结果 原代小鼠远端PASMCs分离培养6d时细胞生长融合度达80％,生长状态较好,呈典型的谷-峰状形态;细胞α-肌动蛋白(α-SMA)染色阳性率为95％以上.利用含钙高钾Krebs液(钾离子浓度为60 mmol/L)灌流原代小鼠远端PASMCs,1 min后95％以上PASMCs细胞内钙离子浓度迅速上升,细胞内钙离子浓度(△[Ca2+]i)变化值＞50,证明原代小鼠远端PASMCs中电压依赖性钙通道(VDCC)具有良好的功能;利用含钙Krebs液灌流5 min、无钙环匹阿尼酸和Nif Krebs液灌流10 min、以含钙环匹阿尼酸和Nif Krebs液灌流10 min及含钙Krebs液灌流10 min检测原代小鼠远端PASMCs中基础钙及钙池操纵性钙内流(SOCE),结果显示原代小鼠远端PASMCs对灌流液反应良好,钙离子浓度出现双峰变化,表明细胞中钙池操纵性钙通道(SOCC)功能优良.结论 本实验通过复合酶消化法成功建立稳定可靠的原代小鼠肺动脉平滑肌体外培养方法,可获得纯度较高,功能良好的PASMCs,为肺血管疾病的研究提供了良好的细胞工具.
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钙池操纵性钙内流在慢性缺氧致肺动脉平滑肌细胞内钙浓度升高中的作用及机制
目的 探讨钙池操纵性钙内流(SOCE)在慢性缺氧致大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMC)细胞内Ca2浓度([Ca2+]i)改变和细胞增殖中的作用及机制.方法 原代培养大鼠PASMC,分为常氧组(21％O2)和缺氧组(4％O2),活细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测PASMC增殖,细胞内钙浓度检测系统检测[Ca2+]i和SOCE,并观察钙池操纵性钙通道(SOCC)拮抗剂SKF96365和氯化镍对缺氧组PASMC SOCE的影响.结果 缺氧24 h、36 h、48 h、60 h,PASMC增殖和升高[Ca2+]i的效应呈时间依赖性,缺氧60h促进PASMC增殖(吸光度值1.12 ±0.09比0.71 ±0.05;P ＜0.05)和[Ca2+]i升高[(214.8±20.4)nmol/L比(115.2±13.2) nmol/L;P＜ 0.05]的作用明显.含硝苯地平(5 μmol/L)的无钙Krebs液孵育PASMC,环匹阿尼酸(CPA,10 μmol/L)导致PASMC[Ca2+]i小幅升高,△[Ca2+]i峰值为(113.3±49.3)nmol/L,慢性缺氧(4％O2,60 h)使PASMC[Ca2+]i升高幅度增加,△[Ca2+]i峰值达(193.2±22.7)nmol/L(P＜0.05);恢复PASMC外Ca2+后,CPA使PASMC[Ca2+]i显著升高,△[Ca2+]i峰值达(328.0±56.7)nmol/L,慢性缺氧导致CPA诱导的PASMC[Ca2+]i升高更显著,A[Ca2+]i峰值高达(526.0±33.7) nmol/L(P＜0.05);SKF96365(50 μmol/L)和氯化镍(500 μmol/L)均能抑制慢性缺氧条件下CPA诱导的PASMC[Ca2+]i升高,△[Ca2+]i从(526.0±33.7)nmol/L分别降至(170.4±26.4) nmol/L和(177.4±45.9) nmol/L(P值均＜0.05).结论 慢性缺氧促进大鼠PASMC肌浆网中Ca2+释放,并增强SOCC活性,使经由SOCC内流的SOCE升高,从而导致PASMC的[Ca2+]i升高,进而促进大鼠PASMC增殖.
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钙池操纵性钙通道与细胞增殖关系的研究进展
Ca2+是维持细胞正常生理功能的重要离子,参与细胞信息传递并调控一系列生命过程.钙池操纵性钙通道(SOCC)是细胞膜钙通道的一种.许多细胞内Ca2+主要通过SOCC机制影响正常细胞和肿瘤细胞的生长增殖.不同类型的细胞,SOCC通道相关蛋白的表达量及其相互作用存在差异,从而影响细胞内Ca2+浓度,造成细胞的增殖、凋亡和迁移等生物学功能的改变.
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基质相互作用蛋白分子1在肿瘤发生发展和临床应用中的研究进展
基质相互作用蛋白分子1(STIM1)与肿瘤的发生发展密切相关,其参与多种癌症细胞凋亡、增殖、迁移和侵袭的调节过程.阻断或敲除STIM1可以显著抑制癌细胞的增殖和迁移.阐明STIM1在癌症细胞中的调节机制,将有助于新的治疗靶点的确定.本文对STIM1分子在不同肿瘤中的作用机制及临床应用前景作一综述.
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钙池操纵性钙通道抑制剂SKF96365对慢性哮喘小鼠气道重塑和气道高反应性的作用
目的:观察钙池操纵性钙通道抑制剂SKF96365 对小鼠慢性哮喘模型气道重塑和气道高反应性的影响.方法:用鸡卵清白蛋白(OVA)致敏和激发小鼠,建立慢性哮喘模型,33只雌性BALB/c小鼠随机分为3组:对照组、哮喘组、SKF96365组,每组11只,其中SKF96365组于每次激发前30 min给予SKF96365(10mg/kg)干预.哮喘组和SKF96365组于第0、7、14 d腹腔注射(i.p)200μL致敏液(含OVA粉剂20 μg、氢氧化铝凝胶2 mg);自第21天起,腹腔注射1％戊巴比妥钠(70mg戊巴比妥钠/kg小鼠体重)麻醉小鼠后,OVA(40 μg)滴鼻(i.n),连续6周,每周3次,共18次.对照组则在相同时间给予相应剂量的生理盐水腹腔注射和滴鼻.后一次激发后24 h,各组分别随机取5只小鼠用于检测组织病理学变化,另6只小鼠采用Buxco小动物肺功能仪检测气道高反应性.其中组织病理学检测计算杯状细胞(过碘酸希夫染色阳性,PAS+)、胶原细胞(Masson阳性)和平滑肌细胞(α-SMA阳性)阳染面积/支气管基底膜周长值来评估小鼠气道重塑;观察给予不同浓度乙酰甲胆碱雾化时的气道阻力(resistance index,RI)大值,评估小鼠气道高反应性.结果:对照组未见PAS阳性染色区域,哮喘组和SKF96365组杯状细胞增生高于对照组(7.29 ±2.04,4.49 ±1.70 vs 0.00 ±0.00,均P＜0.01),且SKF96365组低于哮喘组(P＜0.05).Masson染色显示哮喘组和SKF96365组上皮下胶原沉积高于对照组(9.23 ± 1.41,7.30 ± 1.33 vs 1.60 ± 0.77,均P＜0.01),且SKF96365组低于哮喘组(P＜0.05).α-SMA免疫组化显示哮喘组和SKF96365组平滑肌增生肥大高于对照组(4.54 ± 1.05,3.15 ±0.57 vs 1.97 ±0.69,均P＜0.05),且SKF96365组低于哮喘组(P＜0.05).当乙酰甲胆碱(Mch)＜6.25 mg/mL时,3组小鼠气道阻力无显著差异(P＞0.05),当25 mg/mL＞Mch≥12.25 mg/mL时,哮喘组小鼠气道阻力明显大于对照组小鼠(P＜0.001),当 Mch≥25 mg/mL时,哮喘组小鼠气道阻力大于 SKF96365 组(P＜0.05).结论:采用SKF96365干预后,慢性哮喘小鼠气道重塑和气道高反应性指标均有改善,提示SKF96365可能对哮喘气道重塑和气道高反应性具有抑制作用.
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TRPC1/STIM1复合体调节人脐静脉内皮细胞钙池操纵性钙通道和受体操纵性钙通道介导的钙内流和NO生成
目的 研究瞬时受体电位通道1(TRPC1)/基质交联分子1(STIM1)复合体在人脐静脉内皮细胞(HU-VEC)钙池操纵性钙通道(SOCC)和受体操纵性钙通道(ROCC)介导的钙内流和NO生成中的作用.方法 取2～3代HUVEC,将构建的TRPC1和STIM1干扰质粒分别转染HUVEC,观察细胞转染效果的同时采用real-time PCR和Western blot检测TRPC1、STIM1 mRNA和蛋白的表达.将细胞分别与钙敏感受体(CaR)激动剂精胺、ROCC模拟剂(TPA) +CaR负性变构调节剂Calhex231、蛋白激酶C(PKC)抑制剂Ro31-8220及经典型PKCs和PKCμ抑制剂Go6967孵育后,用荧光探针Fura-2/AM及DAF-FM负载方法同步检测[Ca2+]i和NO生成的变化;随后用TRPC1和STIM1干扰质粒同时转染HUVEC,与精胺孵育后检测[Ca2+];和NO生成,免疫共沉淀法检测TRPC1和STIM1的相互作用.结果 与Control组相比,TRPC1转染组和STIM1转染组TRPC1、STIM1 mRNA和蛋白表达均明显降低(P＜0.05);在四种不同处理作用下,TRPC1转染组和STIM1转染组[Ca2+]i△ratio值和NO净荧光强度值均明显降低(P＜0.05);与Control组、TRPC1转染组及STIM1转染组相比,TRPC1和STIM1共转染组[Ca2+]i△ratio值和NO净荧光强度值均明显降低(P＜0.05);TRPC1与STIM1相互作用形成复合体,且在CaR激动剂的刺激下作用增强.结论 TRPC1/STIM1复合体共同调节CaR经SOCC和ROCC激活介导的钙内流和NO生成.
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环匹阿尼酸对大鼠远端肺静脉平滑肌细胞内钙浓度的影响
目的 研究环匹阿尼酸(CPA)对大鼠远端肺静脉平滑肌细胞(PVSMC)细胞内钙浓度([Ca2+]i)的影响及可能机制.方法 原代培养大鼠远端PVSMC,并通过形态学和免疫荧光染色鉴定,利用荧光显微镜和InCyte细胞内钙浓度检测系统观测高钾(60 mmol/L KCl)溶液及CPA对PVSMC的[Ca2+]i影响.结果 原代培养的PVSMC表现出典型血管平滑肌细胞生长特征,并对平滑肌α-actin免疫荧光染色呈阳性反应;高钾溶液使PVSMC的[Ca2+]i显著升高,5 μmol/L硝苯地平能完全阻断PVSMC的[Ca2+]i对高钾溶液的反应;10 μmol/L CPA能使含5 μmol/L硝苯地平的无钙Krebs溶液孵育的PVSMC的[Ca2+]i短暂小幅升高,恢复细胞外Ca2+至2.5 mmol/L后,10 μmol/L CPA能使含5 μmol/L硝苯地平的Krebs溶液孵育的PVSMC的[Ca2+]i迅速升高.结论 CPA能够使大鼠远端PVSMC的[Ca2+]i升高,其机制可能与Ca2+从肌浆网释放,并诱发细胞外Ca2+通过钙池操纵性钙通道(SOCC)内流有关.
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SKF96365和氯化镍对环匹阿尼酸诱导的大鼠PASMC［Ca2＋］i升高的影响
目的：研究SKF96365和氯化镍（NiCl2）对环匹阿尼酸（CPA）诱导的大鼠远端肺动脉平滑肌细胞（PASMC）内游离钙离子浓度（[Ca2＋]i）变化的影响。方法培养大鼠PASMC，运用荧光显微镜和InCyte细胞内钙浓度检测系统观测CPA、SKF96365和NiCl2对PASMC[Ca2＋]i的影响。结果含5μmol／L硝苯地平的无钙Krebs溶液孵育PASMC，10μmol／LCPA使PASMC[Ca2＋]i短暂小幅升高，恢复细胞外Ca2＋至2．5mmol／L后，10μmol／LCPA使PASMC[Ca2＋]i迅速显著升高；50μmol／LSKF96365和500μmol／LNiCl2均能明显抑制10μmol／LCPA引起的PASMC[Ca2＋]i升高，但对高钾（60mmol／LKCl）溶液引起的PASMC[Ca2＋]i升高无影响。结论CPA可致大鼠PASMC[Ca2＋]i升高，且能被SKF96365和NiCl2阻断，提示CPA可能诱发细胞外Ca2＋经钙池操纵性钙通道（SOCC）内流，SKF96365和NiCl2能选择性抑制SOCC活性使经SOCC的Ca2＋内流减少。
