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一个FGG杂合缺失突变导致异常纤维蛋白原血症家系分析
目的 对一个新的FGG基因杂合缺失突变导致异常纤维蛋白原血症家系进行表型和基因突变分析,探讨其分子发病机制.方法 收集2016年4月来温州医科大学附属第一医院就诊的先证者临床资料及其家系成员(共3代5人),采用凝固法检测血浆纤维蛋白原活性(Fg:C)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT);免疫比浊法检测纤维蛋白原抗原(Fg:Ag)、D-二聚体(D-D)和纤维蛋白(原)降解产物(FDPs)含量;抽提先证者及其家系成员外周血的基因组DNA,采用PCR扩增先证者纤维蛋白原的FGA、FGB及FGG基因所有外显子和侧翼序列,以及家系成员相应的突变位点区域,产物纯化后直接测序,同时采用克隆测序及非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳-银染色进一步验证;用ClustalX-2.1-win软件分析突变位点基因的保守性,并采用Pymol软件分析突变前后蛋白质空间结构及分子间作用力的改变.结果 先证者Fg:C明显下降,而Fg:Ag含量正常,分别为0.30 g/L和2.00 g/L(参考范围均为2.00~4.00 g/L);母亲及外婆Fg:C和Fg:Ag分别为0.42 g/L、2.09 g/L及0.47 g/L和2.42 g/L.基因分析发现先证者FGG基因8号外显子存在c.944_c.952 delCCTTTGATG杂合缺失突变,导致氨基酸289_291delAla,Phe,Asp,其母亲和外婆同样携带此突变,父亲和外公为正常野生型.同源性分析表明Ala289,Phe290,Asp291残基在同源物种间高度保守;蛋白模型分析发现在野生型FGG蛋白质中,Ala289分别与Gly287、Gly292及Thr371形成3个氢键,Phe290分别与Tyr262、Tyr278、His307及Asn308形成4个氢键,Asp291分别与Asp288及Lys302形成2个氢键,当Ala289、Phe290和Asp291发生缺失突变后,原有的氢键连接全部消失.结论 本研究发现了纤维蛋白原γ链289_291delAla,Phe,Asp杂合缺失突变会引起Fg分子空间结构重排,降低了结构稳定性,其与该家系引起异常纤维蛋白原血症有关.(中华检验医学杂志,2018, 41:305-311)
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全基因组外显子测序联合连锁分析法进行家族性偏瘫性偏头痛致病基因 CACNA1 A新突变的研究
目的：探索家族性偏瘫性偏头痛与CACNA1 A基因突变的关系。方法通过收集2014年重庆医科大学附属大学城医院神经内科的一家族性偏瘫性偏头痛家系患者和正常人以及1000名正常对照DNA，对该家系的先证者和另一患者进行全基因组外显子测序，并进行连锁分析、CACNA1A基因测序验证研究和生物信息学分析。结果发现一个位于CACNA1A基因的8号外显子的新突变位点（c.1168A＞G），导致天冬酰胺替换为天冬氨酸（N390D）。结论 CACNA1A基因突变N390D是新发现的引起该家系家族性偏瘫性偏头痛的致病突变。
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纤溶酶原Ala601Thr突变导致的遗传性异常纤溶酶原血症表型与基因型分析
目的 对1个遗传性异常纤溶酶原血症家系进行表型及基因突变检测,寻找其致病基因.方法 2015年5月10日温州医科大学附属第一医院神经内科门诊,收治1例因“半月前无明显诱因出现头痛,两侧颞部胀痛,伴呕吐,复视,睡眠差”的25岁男性患者,入院诊断“上矢状窦静脉血栓形成”.采集先证者及其家系成员(共3代14人)外周静脉血标本,在全自动血凝仪上检测其凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TTr)、纤维蛋白原(FIB)、D-二聚体(D-D)及纤维蛋白原降解产物(FDP);采用发色底物法和免疫火箭电泳法分别检测纤溶酶原活性(PLG:A)和纤溶酶原抗原(PLG:Ag).PCR扩增纤溶酶原(PLG)基因19个外显子及其5'和3'侧翼区.用DNA直接测序法分析扩增产物,并通过反向测序验证突变位点.采用生物信息学预测软件(SIFI,PolyPhen-2和MutationTaster)分析突变对蛋白质功能的影响.采用Swiss-PdbViewer软件对突变位点进行模型分析.结果 先证者及6位家庭成员PLG:A降低约50％,PLG:Ag正常.先证者及其奶奶、父亲的D-D和FDP值轻度升高.DNA测序结果表明,先证者及这6位成员PLG基因15号外显子g.38829G＞A杂合错义突变,导致p.Ala601Thr.生物信息学软件预测结果表明此突变可影响蛋白质的功能.蛋白质模型分析显示突变改变了氨基酸之间的疏水作用力和氢键,从而影响了蛋白质的稳定性.且所有家系成员5'非翻译区均存在g.2501C＞A杂合SNP.结论 在该遗传性异常纤溶酶原血症家系中发现的PLG基因p.Ala601Thr杂合突变与纤溶酶原活性水平降低有关.异常纤溶酶原血症及该突变位点均为国内首次报道.
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β-肌球蛋白重链基因Ala26Val突变中国人肥厚型心肌病热点突变
目的研究中国人肥厚型心肌病致病基因,分析基因型与临床表型的关系.方法在86例肥厚型心肌病患者及120例正常对照中进行β-肌球蛋白重链(β-MHC)基因扫描,聚合酶链反应(PCR)扩增其功能区的外显子片段,双脱氧末段终止法测序.对阳性结果者进行家系调查,收集临床资料,分析其临床表型.结果在3个家系及1例散发患者中发现β-MHC基因第3号外显子的Ala26Val错义突变,正常对照组同一位置未见异常.3个家系临床表型不同.结论β-MHC基因Ala26Val突变是中国人肥厚型心肌病的热点突变, 其临床表型的异质性,提示多因素参与了肥厚型心肌病的发生和发展.
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FⅤ Leiden突变、抗心磷脂抗体与缺血性脑血管病
目的探讨国人凝血因子Ⅴ外显子10中一个固定的错义突变(FⅤ Leiden 突变)发生率及其与抗心磷脂抗体(aCL)和缺血性脑血管病(ICVD)的关系.方法应用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析方法对国人118例ICVD患者及75名健康者进行FⅤ Leiden 突变检测,86例ICVD患者检测aCL,27例进行抗活化蛋白C(APC-R)检测.结果 (1) 6例(5.1%)ICVD患者出现FⅤ Leiden 突变,且皆为杂合子,对照组中无一例发生突变,FⅤ Leiden 突变患者年龄较轻,平均年龄50岁.(2)ICVD组27例检测了APC-R,8例阳性.(3) aCL阳性患者FⅤ Leiden突变发生率高于aCL阴性患者,本组FⅤ Leiden突变患者共6例, 其中aCL阳性者3例.结论虽然FⅤ Leiden突变在ICVD患者中发生率不高,但在血栓形成中起重要作用, 年轻ICVD患者FⅤ Leiden突变发生率更高.ICVD患者FⅤ Leiden突变可能与aCL阳性有关.对于aCL阳性患者,特别是年轻、病因不明的ICVD患者应进行FⅤ Leiden突变和APC-R检测,以期指导诊断、预防和治疗.
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Wilson病基因突变体的体外构建及表达研究
目的研究并比较正常ATP7B蛋白及其突变体蛋白的表达水平,为进一步探寻ATP7B蛋白参与铜转运的机制奠定基础.方法构建含健康人全长Wilson病(WD) cDNA片段的真核细胞表达质粒ATP7BcDNA/pcDNA3,定点诱变三种具有代表意义的突变体表达质粒Arg778Leu/pcDNA3、Gln914Ter/pcDNA3和Thr935Met/pcDNA3;同时设计并制备包含ATP7B蛋白N端主要功能区的具有高度特异性和敏感性的ATP7Bn33-629抗体;分别以上述质粒瞬时转染中国仓鼠卵细胞(Chinese hamster ovary,CHO),收集细胞提取蛋白,以ATP7Bn33-629抗体为一抗,免疫印迹分析并比较正常和突变体ATP7B蛋白的表达程度.结果 ATP7B蛋白在正常ATP7BcDNA/pcDNA3表达质粒和Arg778Leu/pcDNA3、Thr935Met/pcDNA3错义突变体表达质粒转染的CHO细胞中表达量一致,而在Gln914Ter/pcDNA3截短突变体表达质粒转染的CHO细胞中表达量明显增加.结论成功构建了WD突变体表达质粒并在转染细胞中表达,为进一步的功能研究打下基础.错义突变未改变ATP7B蛋白表达量,提示错义突变引起铜代谢障碍的机制与蛋白表达量无关.截短突变产生的ATP7B蛋白产物表达量增加可能与其所需的翻译时间相对较短有关.
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X连锁隐性遗传诺里病家系的NDP基因突变检测
目的 研究一个X连锁隐性遗传诺里病家系NDP基因突变情况.方法 收集诺里病先证者及其家系成员临床资料,完善眼科检查,对家系共35名成员的外周血抽提基因组DNA,PCR扩增NDP基因外显子及其侧翼序列,产物纯化后直接进行DNA测序.结果 家系中患者NDP基因第3号外显子存在c.362 G＞A错义突变(p.R121Q).结论 NDP基因c.362 G＞A错义突变是导致该家系出现诺里病的原因.基因突变检测可以为家系成员提供准确的遗传咨询及产前诊断.
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遗传性核性金黄色结晶样白内障患者γ晶状体蛋白基因错义突变
目的 确定中国北方常染色体显性遗传性白内障(ADCC)一家系的致病基因.方法 收集ADCC一家系资料,提取血液白细胞DNA,运用微卫星位点多态性连锁分析,对提示连锁的染色体区域内的候选基因测序,寻找突变.结果 该家系致病基因定位在2q33.3-34区域内,对其候选基因γ晶体蛋白基因簇各基因进行测序,发现Yd晶体蛋白基因第二外显子有一个杂合子的错义突变(109C→A)与家系患者共分离,此突变可导致其编码的第36位精氨酸被丝氨酸取代.结论 此γ晶体蛋白基因突变引起该家系核性结晶样先天性白内障,是由Γd晶体蛋白基因109C→A(R36S)突变引起的.
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KRT6A基因I462S新生突变导致Ⅰ型先天性厚甲症
目的研究Ⅰ型先天性厚甲症患者KRT6A基因突变情况,为建立该病的基因诊断与遗传咨询提供依据.方法提取1例Ⅰ型先天性厚甲症患者及家系成员和50名正常对照外周血白细胞基因组DNA,设计针对KRT6A基因的特异引物,采用聚合酶链反应(PCR)扩增基因的全部编码序列,DNA直接测序明确具体的突变位置和方式,限制性内切酶反应验证基因突变.结果 PCR结合DNA测序发现患者KRT6A基因第7外显子存在异常;第1385位核苷酸由胸腺嘧啶(T)突变为鸟嘌呤(G),导致KRT6A角蛋白2B螺旋区末端第462位密码子由异亮氨酸(I)变成丝氨酸(S),即发生I462S错义突变.患者父母及与家系无血缘关系的50名正常对照均未发现此突变,提示I462S为一种新生突变(de novo mutation).结论 KRT6A基因I462S新生错义突变是导致该例患者Ⅰ型先天性厚甲症的特异突变.
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因子Ⅴ Leiden突变在布加综合征与门静脉血栓形成中的意义
布加综合征与门静脉血栓是2种罕见的肝脏血管病,可伴发肝功能衰竭及门静脉高压症等严重并发症.研究证据表明因子Ⅴ Leiden(FVL)突变是西方布加综合征与门静脉血栓患者的重要危险因素,但在中国布加综合征患者中比较罕见.着重回顾FVL突变在布加综合征与门静脉血栓形成中的意义,提出尚须前瞻性研究进一步评估FVL突变在中国门静脉血栓患者中的患病率,以判断FVL突变筛查的必要性.
关键词： Budd-Chiari综合征 静脉血栓栓塞 因子Ⅴ 突变 误义 -
Hallopeau-Siemens型隐性营养不良型大疱性表皮松解症一例的基因突变研究
目的鉴定一常染色体隐性遗传营养不良型大疱性表皮松解症家系的基因突变.方法应用PCR、DNA直接测序明确突变位点,根据突变位点设计特异性引物,用PCR检测突变位点从而进一步确定该家系的致病原因.结果发现该患者COL7A1基因的一条等位基因第2号外显子上存在S48P的错义突变,而另一条等位基因第27号外显子上存在3625del11缺失突变,造成编码区阅读框架的移位,终导致蛋白终止密码(PTC)的产生.隐性营养不良型大疱性表皮松解症患者这种两个突变的组合在国际上为首次报道.结论COL7A1基因的缺失突变和错义突变引起该患者临床症状的特异突变.
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一例Crouzon综合征合并黑棘皮病患儿FGFR3基因突变分析
患儿女,7岁,前额突出、突眼伴全身皮肤色素沉着7年.生后1周发现双肘内侧色素沉着,1年后全身皮肤渐出现多处色素沉着.自幼泪管堵塞,多次疏通效果不明显.患儿父母正常,非近亲婚配,无相同疾病家族史.体检:头颅呈方形,前额突出,上颌发育不全,下颌前凸;眼球突出,双眼间距较宽;鼻梁塌陷,上下牙咬合不良,牙列不整,参差不齐.皮肤科检查:全身皮肤黑褐色,颈部及腋下、腹股沟等部位皮肤粗糙,皮棘稍隆起,呈现天鹅绒样外观.诊断:Crouzon综合征合并黑棘皮病.采用PCR和DNA测序检测患儿及其父母、100例无亲缘关系的健康人FGFR3基因第10外显子突变.结果显示,患儿FGFR3基因有1处杂合错义点突变(C.1172 C＞A),患者直系亲属及100例健康人均未检测到上述突变.FGFR3基因的错义突变可能是引起该患者临床症状的致病突变.
关键词： 黑棘皮症 颅面骨发育不全 成纤维细胞生长因子3 突变 误义 -
家族性原发性皮肤淀粉样变一家系的OSMR基因突变检测
目的 检测家族性原发性皮肤淀粉样变一家系患者的OSMR基因突变情况.方法 收集一家族性皮肤淀粉样变家系临床资料,提取先证者及其19名相关亲属、50例无关健康对照外周血DNA,采用PCR扩增OSMR基因编码区的全部外显子及其侧翼序列并测序.结果 基因检测发现,先证者OSMR基因发生c.2081C＞T杂合突变,导致氨基酸出现p.P694L改变,家族中其他患者均发现同样突变位点,而家族健康成员及健康对照组均未检出此突变.结论 OSMR基因的p.P694L突变可能是导致患者出现皮肤淀粉样变临床表型的病因.
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PK-LR基因新突变丙酮酸激酶缺乏症患儿经异基因造血干细胞移植治愈
目的 通过对2例丙酮酸激酶缺乏症(PKD)患儿临床症状及PK-LR基因新突变类型的报道,探讨PKD的PK-LR基因诊断方法及行异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)的疗效.方法 选择2009年2月及2013年8月,上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心收治的2例PKD患儿作为研究对象.本研究遵循的程序符合上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心人体试验委员会所制定的伦理学标准,得到该委员会批准,征得受试对象监护人的知情同意,并与之签署临床研究知情同意书.通过上海儿童医学中心检验科采集2例患儿的血液标本,采用Sanger基因测序及全外显子捕获测序对2例患儿PK-LR基因进行检测分析.采用allo-HSCT对2例患儿进行治疗,并分别对2例患儿进行随访.回顾性分析该2例患儿的临床症状、诊断方法及治疗方案.结果 ①2例PKD患儿丙酮酸激酶(PK)活性均降低,分别为8.00 IU/gHb与7.61 IU/gHb.②2例PKD患儿PK-LR基因检测分析共发现4种PK LR基因错义突变.其中,PK-LR基因c.941T＞C(p.Ile314Thr)突变已有文献报道,c.119G＞A(p.Arg40Gln),c.1015G＞A(p.Asp339Asn)及c.848T＞C(p.Va1283Ala)突变为PK-LR基因新的突变类型.4种突变的SIFT功能预测结果分别为0.20,0.37,0及0.23.③2例PKD患儿均接受allo-HSCT.患儿1于移植后第14天粒系及红系造血功能获得恢复,移植后第19天血小板(PLT)计数＞5×101 0/L,移植后第22天造血干细胞(HSC) 100％嵌合,患儿血型亦转换为供者血型.患儿2于移植后第12天粒系及红系造血功能获得恢复,移植后第19天PLT计数＞3×1010/L,移植后第18天HSC 100％嵌合,患儿血型亦转换为供者血型.④对2例PKD患儿分别随访5年和1年,患儿生存状况良好,造血系统及其他系统指标均为正常,获得成功治愈.结论 全外显子捕获基因测序方法可用于临床PKD基因诊断及PK-LR基因新型突变类型的发现;PK-LR基因新突变类型c.G119G＞A(p.Arg40Gln),c.1015G＞A(p.Asp339Asn)及c.848T＞C(p.Va1283Ala)亦可导致PKD的发生;allo-HSCT治疗本研究中2例PKD患儿是有效、可行的.
关键词： 红细胞丙酮酸激酶缺乏症 突变 误义 造血干细胞移植 -
新的肾上腺脑白质营养不良基因突变1例的鉴定
目的: 对1例肾上腺脑白质营养不良(ALD)患者及其家系成员的ALD基因的突变类型进行鉴定. 方法: 以外周血RNA为模板,采用长链RT-PCR技术,分4个片段扩增ALD基因mRNA的编码序列,对4个PCR产物进行直接测序,筛查整个基因编码区. 通过限制性内切酶酶切分析患者及其家系成员基因组ALD基因片段,以进一步确证所发现的基因突变. 结果: 位于患者ALD基因第6外显子的第508位密码子存在一个新的错义突变CCC→CTC (P508L),患者母亲为突变携带者,患者父亲和妹妹不存在此突变. 结论: 发现中国ALD患者一个新的ALD基因突变,即P508L突变.
