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PI3K/Akt信号传导通路在替莫唑胺诱导脑胶质瘤细胞耐药中的作用研究
目的 观察替莫唑胺耐药脑胶质瘤细胞中激活磷脂酰肌醇3激酶/PKB蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号传导通路活化情况,并对PI3K/Akt信号传导通路在替莫唑胺诱导脑胶质瘤细胞耐药中的作用机制进行探讨.方法 采用Western blot方法检测耐药脑胶质瘤细胞(U251/TMZ)和非耐药脑胶质瘤细胞中PI3 K/Ak信号传导通路的活化情况.采用PI3K/Akt信号传导通路特异性阻断剂LY294002阻断U251/TMZ中PI3K/Akt信号传导通路,检测替莫唑胺对U251/TMZ细胞活性的影响.采用Western blot方法检测LY294002作用后,U251/TMZ细胞中Bcl-2、MDR1、Topo Ⅱ、ARF和p53等蛋白表达变化情况.结果 耐药脑胶质瘤细胞中PI3K/Akt信号传导通路活化情况显著增强(P＜0.01).阻断PI3K/Akt信号传导通路后,替莫唑胺对U251/TMZ耐药脑胶质瘤细胞的抑制率明显高于对照组(P＜0.05).阻断PI3K/Akt信号传导通路后,耐药相关基因Bcl-2和MDR1的表达显著降低(P＜0.01),Topo Ⅱ的表达显著升高(P＜0.01),同时抑癌基因ARF和p53的表达显著升高(P＜0.01).结论 PI3K/Akt信号传导通路参与替莫唑胺耐药脑胶质瘤细胞的形成,其机制可能与PI3K/Akt信号传导通路对耐药相关基因Bcl-2、MDR1和Topo Ⅱ及抑癌基因ARF和p53的表达调控有关.
关键词： 脑胶质瘤细胞 耐药 PI3K/Akt蛋白 替莫唑胺 敏感性 -
对乙酰氨基酚抑制SHG-44细胞生长及其放射增敏作用的实验研究
对乙酰氨基酚(扑热息痛)属于非甾体抗炎药(NSAIDs),在国内外有着上百年临床广泛使用的历史,是不良反应较少的低毒非处方药物,口服后吸收迅速并且可分布于全身各组织包括脑组织,通过抑制环氧化酶(COX)阻止前列腺素(PGs)的合成而产生抗炎解热镇痛作用.20世纪70年代末NSAIDs开始被用于抗肿瘤的研究,并发现NSAIDs主要是通过抑制COX-2发挥抗肿瘤作用[1].此次实验观察其能否协同放射增强杀灭离体脑胶质瘤细胞的作用.
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加温对脑胶质瘤细胞SHG-44的放射增敏效应
高级别恶性脑胶质瘤治疗效果差,探索新的综合治疗方法依然是当前的热点.笔者对脑胶质瘤细胞SHG-44的热放射增敏作用进行了实验研究,现报道如下.
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RNA干扰抑制脑胶质瘤细胞HMGA1基因表达对放射敏感性的影响
目的 探讨慢病毒介导的RNA干扰沉默HMGAI对脑胶质瘤细胞株SHG-44放射敏感性的影响.方法 把HMGAlsiRNA慢病毒载体转染脑胶质瘤细胞株SHG-44后,用半定量RTPCR和Western blot检测其对细胞HMGAl基因表达的影响.采用克隆形成法检测细胞对6 MV X 射线的敏感性,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率及细胞周期.结果 RT-PCR和Western blot证实,HMGAl转染组细胞存在HMGAl基因表达下调:HMGAl mRNA的表达量转染组(0.11%±0.02%)明显低于未转染组(0.89%±0.02%,t=46.6,P<0.01);HMGAI蛋白的表达量转染组(0.18%4±0.02%)明显低于未转染组(0.86%4±0.03%,t=22.6,P<0.01).HMGAl转染组细胞较未转染组细胞对6 MV X射线的敏感性增加,增敏比为1.73.流式细胞仪检测,转染组凋亡率(37.4%±3.1%)显著高于未转染组(6.1%±0.5%,t=12.9,P<0.05);转染组细胞周期存在G_o/G_1期延迟(72.6%4±2.4%)显著高于未转染组(45.2%4±1.6%,t=16.2,P<0.05)).结论 HMGAI siRNA能特异性下调细胞SHG-44中HMGAI的表达,增强了该脑胶质瘤细胞对X射线的辐射敏感性.
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雷公藤单体抑制结缔组织生长因子对脑胶质瘤细胞增殖的影响
目的 探讨结缔组织生长因子( CTGF)对脑胶质瘤细胞增殖的影响,并分析Rho激酶信号转导通路及雷公藤单体在其中的作用. 方法 取传代培养生长的脑胶质瘤细胞,按如下进行操作:正常对照组未予以任何无药物干预,CTGF组予以2.5 μg? L-1 CTGF孵育细胞24 h;雷公藤甲素组予以2.5 μg? L-1 CTGF与0.5 ng? mL-1雷公藤甲素共同孵育细胞 24 h;雷公藤红素组予以 2.5μg? L-1 CTGF与0.5 ng? mL-1雷公藤红素共同孵育细胞24 h;Y27632 ( Rho激酶特异性抑制剂)组予以1 μmol? L-1 Y27632 预处理细胞30 min后,加入2.5μg? L-1 CTGF作用24 h. 用酶联免疫吸附测定法对Rho激酶活性进行检测.用氚化胸腺嘧啶核苷法检测脑胶质瘤细胞的增殖. 结果 CTGF组脑胶质瘤细胞DNA的合成量显著高于正常对照组( P<0.01 ) ,雷公藤甲素组和雷公藤红素组脑胶质瘤细胞DNA的合成量显著低于CTGF组(P<0.05),Y27632组脑胶质瘤细胞DNA的合成量显著低于CTGF组( P<0.05 ). CTGF组的Rho激酶活性显著高于正常对照组( P<0.01 ) ,雷公藤甲素组和雷公藤红素组的Rho激酶活性显著低于CTGF组( P<0.05 ). 结论 CTGF可诱导脑胶质瘤细胞的增殖,雷公藤甲素和雷公藤红素可抑制CTGF诱导的脑胶质瘤细胞的增殖, Rho激酶信号转导通路参与CTGF诱导的脑胶质瘤细胞增殖.
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2种粒径PLGA纳米粒细胞摄取动力学的比较
目的:比较包载有荧光香豆素-6(coumarin-6,C6)的2种粒径聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plylactic acid-glycolic acid copolymer,PLGA)纳米粒,经肿瘤细胞的摄取动力学的差异.方法:以生物可降解材料PLGA为载体,采用乳化溶剂挥发法制备2种不同粒径的载有C6的PLGA纳米粒,以黑色素肿瘤细胞(B16)和脑胶质瘤细胞(U87)为细胞模型,分别与2种粒径的纳米粒孵育0.5,1,4,6和17 h,用荧光光度计检测细胞裂解液中C6的荧光值,计算得出2种细胞摄入的载药PLGA纳米粒的量(以C6的量表示),绘制入胞动力学曲线.应用GraphPad Prism程序处理2种细胞得出的数据,并应用T检验法分析各组数据之间的差异.结果:孵育0.5h后,2种粒径纳米粒在2种细胞中的摄取量均表现出显著差异;且随着时间延长,该差异加大.细胞摄取时间在6 ～17h时,粒径约为150 nm的PLGA纳米粒的入胞速率明显变缓.结论:在相同的给药浓度下,小粒径纳米粒入胞速率要快于较大粒径的纳米粒.大粒径的纳米粒比小粒径纳米粒的入胞量到达平衡快,且总的入胞量要少.
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脑瘤散对脑胶质瘤细胞GFAP及Bax/Bcl-2的影响
[目的]观察脑瘤散加环磷酰胺(CTX)对荷瘤鼠体内G422脑胶质瘤细胞胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响.[方法]将G422脑胶质瘤细胞株按4 mL∶1 g的比例在组织研磨器中研磨成匀浆,接种于小鼠右前肢腋下皮下,每只接种0.2 mL.将60只小鼠于接种后次日按体质量分层随机分配法分为3组,每组20只,模型组给予脑瘤散加CTX,阳性对照组给予CTX,空白对照组只注射生理盐水.给药11d后处死动物,取肿瘤标本固定后切片,免疫组织化学染色测定GFAP的含量,IDA-高清晰度数码显微图象分析系统检测阳性细胞的平均光密度及平均灰度,同时计数阳性细胞数.免疫组织化学染色测定Bax,Bcl-2表达蛋白含量,统计其阳性细胞率.[结果]模型组、阳性对照组的GFAP表达较空白组明显增加,模型组与阳性对照组之间差异明显,差异有统计学意义.实验组Bcl-2蛋白的表达明显低于西药组和空白组,实验组Bax蛋白的表达明显高于西药组和空白组.[结论]脑瘤散与CTX联合应用,使肿瘤细胞的损伤加重,导致细胞坏死凋亡,其机制可能与上调Bax蛋白的表达,同时Bcl-2蛋白表达下降,从而促使G422脑胶质瘤细胞凋亡有关.
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雷公藤甲素对脑胶质瘤细胞凋亡的影响及机制探讨
目的 研究雷公藤甲素(TP)对脑胶质瘤细胞u87的细胞凋亡、线粒体膜电位和ROS生成的影响,探讨其诱导细胞凋亡的机制.方法 体外培养U87细胞,用10,50,250,1250 nmol/L四个浓度雷公藤甲素作用于细胞24小时后,流式细胞仪检测细胞凋亡,细胞线粒体膜电位,以及活性氧.结果 随着药物浓度的增加,细胞凋亡率逐渐增加,线粒体膜电位检测到绿色荧光区域细胞比例逐渐增多,细胞活性氧生成水平逐渐升高,与对照组比差异有统计学意义,TP对细胞凋亡的诱导作用与药物浓度呈正相关.结论 雷公藤甲素可体外诱导U87细胞凋亡,机制可能与线粒体信号通路参与了TP诱导的细胞凋亡,同时通过细胞氧化应激反应,升高ROS,诱导细胞凋亡有关.
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电穿孔法高效转染脑胶质瘤细胞U251的条件优化研究
目的 探讨不同电穿孔条件对脑胶质瘤细胞U251电转染率的影响,旨在优化脑胶质瘤细胞U251的电穿孔转染条件以获得较高转染效率.方法 以脑胶质瘤细胞系U251为研究对象,在300μl电转体系中,选择不同的电压、脉冲时间、细胞浓度、DNA剂量,将pEGFP-C1质粒导入U251,计算转染效率.结果 在110V、脉冲250 μs、细胞浓度1×106/ml、质粒2μg,转染效果佳,转染后48 h阳性率约为69％.结论 优化条件后的电穿孔法操作简单,经济省时,可用于脂质体等方法较难转染细胞(如脑胶质瘤细胞)的外源基因导入.该实验也为进一步研究其他基因转移到胶质瘤细胞的应用提供可靠的试验参数基础.
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全硫代反义寡核苷酸对脑胶质瘤细胞端粒酶活性作用
目的 本研究采用针对人端粒酶hTR基因的反义寡聚脱氧核苷酸,探讨端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸(antisense oligodeoxy nucleotides,ASODN)对脑胶质瘤HO-8910细胞端粒酶活性及细胞增殖的影响.方法 本实验将互补于hTR模板区的全硫代修饰型反义寡核苷酸(PS-ASODN)经lipotap脂质体转染作用于脑胶质瘤细胞系C6,然后分别采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色实验、酶联免疫吸附试验(ELISA)法和流式细胞术检测C6脑胶质瘤细胞的体外增殖、端粒酶活性、细胞凋亡和细胞周期的改变.结果 经MTT法检测,PS-ASODN对C6细胞生长具有明显的抑制作用和诱导细胞凋亡,1.0μMPS-ASODN处理后24 h细胞生长抑制率为12.93%,且随着时间的延长,抑制作用逐渐增强;给药72 h对细胞生长抑制率达到高,为50.81%,有相应的浓度依赖关系.ELISA法检测结果,0.5～1.5 μM的PS-ASODN对C6细胞作用72 h后端粒酶皆为阴性,表明PS-ASODN能够抑制端粒酶活性,对照组端粒酶皆为阳性.结论 端粒酶PS-ASODN对体外培养的脑胶质瘤C6细胞的增殖有明显的浓度、时间依赖性抑制作用;抑制脑胶质瘤C6的端粒酶活性和诱导C6脑胶质瘤细胞发生凋亡,可能是端粒酶PS-ASODN抑制C6细胞增殖的主要机制.
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奥沙利铂调控PI3K/Akt信号通路抑制脑胶质瘤细胞株U87生长的作用研究
目的:研究奥沙利铂(Oxaliplatin,Ox)调控PI3K/Akt信号通路抑制脑胶质瘤细胞株U87生长的作用.方法:培养U87脑胶质瘤细胞,分别利用0、20、40、80μg/ml的奥沙利铂处理U87细胞24、36、48、72 h,利用MTT检测各处理组细胞增殖情况;利用流式细胞仪检测40μg/ml的奥沙利铂处理48 h对U87细胞周期及细胞凋亡的影响;Western blot检测40μg/ml的奥沙利铂处理48 h对U87细胞凋亡相关蛋白及PI3 K/Akt信号通路蛋白表达的影响.结果:奥沙利铂处理抑制U87细胞增殖,与0μmol/L处理相比,差异显著(P<0.01),40μg/ml的奥沙利铂处理48 h差异显著.40μg/ml的奥沙利铂处理48 h后,U87细胞周期被阻滞在S期,U87细胞凋亡显著增加(P<0.01),抑凋亡因子Bcl-2蛋白表达明显下降,促凋亡因子Bax、Cleaved-caspase3蛋白表达明显升高(P<0.01),PI3K及p-Akt的表达量明显降低(P<0.01),Akt表达量无明显差异(P>0.05).结论:奥沙利铂可能通过抑制PI3K/Akt信号通路抑制U87细胞增殖,阻滞细胞周期,促进细胞凋亡.
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体外原代培养脑胶质瘤细胞对化疗药物敏感性的影响
目的：建立离体胶质瘤组织原代培养细胞，测试其对常用抗癌化疗药物的敏感性。方法手术切除54例人脑恶性胶质瘤，取3级星形细胞瘤在培养皿中进行原代培养，采用八肽胆囊收缩素（CCK－8）法检测恶性脑胶质瘤细胞对顺铂（DDP）、长春新碱（VCR）、替尼泊甙（VM－26）、替莫唑胺（TMZ）、尼莫司汀（ACNU）的体外敏感性。结果对原代培养肿瘤细胞进行药物敏感性试验，敏感率依次为 VM－26＞TMZ＞ACNU＞DDP＞VCR（P＜0．05）。结论用CCK－8法进行化疗药物的敏感性测定可以更好地辅助临床化疗和放疗，避免盲目使用药物。
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胰岛素生长因子结合蛋白-2 siRNA表达载体的构建及鉴定
目的：构建针对胰岛素生长因子结合蛋白-2（IGFBP-2）的小干扰RNA（siRNA）表达载体，研究载体介导的RNAi技术对人 U251脑胶质瘤细胞株中IGFBP-2表达的抑制作用。方法根据GenBank提供的IGFBP-2基因（NM-000597）核苷酸序列及siRNA的设计原则，设计合成4对带有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点的发夹结构寡核苷酸序列，筛选得到576～594 nt、908～926 nt、938～956 nt 3个19 bp片段靶序列，同时随机组合出一条无关序列，应用限制性内切酶酶切和测序技术鉴定重组克隆。用脂质体介导转染人U251胶质瘤细胞株，采用RT-PCR和Western印迹方法检测细胞IGFBP-2 mRNA和蛋白表达。结果酶切筛选得到4个目的片段的阳性克隆，测序证实重组表达载体中插入序列与设计一致。 RT-PCR和Western印迹检测显示构建的siRNA表达载体可显著降低U251细胞中IGFBP-2 mRNA和蛋白表达水平。结论成功构建载体介导的IGFBP-2靶向 RNA干扰重组体，并能有效抑制U251细胞中IGFBP-2基因的表达。
关键词： 胰岛素生长因子结合蛋白-2 RNA干扰 脑胶质瘤细胞 -
32P胶体持续低剂量率辐射对U87细胞的剂量生物效应
本研究尝试应用32P胶体对脑胶质瘤细胞U87进行持续低剂量率辐射,并分析其剂量生物效应.一、材料与方法1.U87细胞培养.U87细胞株由中国科学院上海细胞生物学研究所提供.应用96孔板进行细胞培养.
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60Coγ线照射联合Tamoxifen体外抑制脑胶质瘤细胞的生长研究
目的探讨Tamoxifen(TAM)和60Coγ线照射对脑胶质瘤细胞的增殖及凋亡影响.方法用3H-TdR掺入法测定TAM单用以及和60Coγ线联用对脑胶质瘤细胞的抑制作用,用激光共聚焦显微镜观察TAM和60Coγ线照射对脑胶质瘤细胞凋亡的影响. 结果 TAM对脑胶质瘤细胞的生长有明显的抑制作用,且抑制作用呈浓度依赖性;TAM与60Coγ线联用具有显著的协同作用,TAM能诱导细胞凋亡,在激光共聚焦显微镜下表现为核固缩或核碎裂,可见凋亡小体. 结论 60Coγ线和TAM联用在体外能有效地抑制脑胶质瘤细胞的生长.
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X线诱导人脑胶质瘤细胞系凋亡及相关基因表达的实验研究
目的:探讨X-刀治疗脑胶质瘤的佳剂量--效应关系和佳时间--效应关系.方法:以BT325细胞系为实验对象,设置了阴性对照组、5Gy、10Gy、15Gy、20Gy和30Gy组,应用Varian直线加速器行单次大剂量照射,分别于2h、6h、12h、48h、72h和96h采用流式细胞仪观察细胞凋亡和细胞周期的改变;采用免疫组化法观察P53、Bcl-2和PCNA基因的表达情况,采用光镜和电镜观察细胞凋亡的形态学改变.结果:X线诱导BT325细胞系凋亡的佳剂量为20Gy,凋亡率为66.95%.BT325细胞受一定剂量X线照射后凋亡细胞逐渐增加,12～48h左右到平台,以后即使再增加剂量,细胞凋亡也不再增加.在20Gy48h时,P53基因表达高,Bcl-2基因表达明显减弱,但PCNA 12h内阳性率较高,随着时间延长,其表达率明显下降,尤以48h为著.且细胞周期发生G1阻滞,达85.56%,此时经FCM检测细胞凋亡发生率也高.结论:X射线诱导细胞系调亡存在佳剂量--效应关系和佳时间--效应关系,且与P53、Bcl-2和PCNA基因的表达有一定的关系.
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UNBS5162对脑胶质瘤细胞增殖和转移的抑制作用及机制
目的 通过体外实验,研究UNBS5162对脑胶质瘤细胞增殖和转移的抑制作用,并对其分子机制进行初步探究.方法 采用10μmol/L UNBS5162处理脑胶质瘤细胞U251细胞为实验组,二甲基亚砜处理为对照组,分别应用CCK8实验、Tran-swell实验、流式细胞凋亡实验检测UNBS5162对U251细胞增殖、迁移和侵袭、凋亡的影响,应用蛋白免疫印迹法检测PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达水平.结果 实验组细胞增殖能力低于对照组(P<0.05);并且其细胞迁移数和侵袭数均低于对照组[(18±5)个比(32±2)个,P<0.05;(30±2)个比(78±4)个,P<0.05];与对照组相比,实验组细胞凋亡率提高[(24.46±2.03)％ 比(5.75±0.74)％,P<0.05],且抗凋亡蛋白Bcl-2表达量降低、促凋亡蛋白Bax和Caspase-3表达量增加(P<0.05).与对照组相比,PI3K/AKT信号通路的关键蛋白AKT和mTOR的磷酸化水平受到抑制,其下游p70S6K蛋白表达水平也相应降低(P<0.05).绪论UNBS5162通过促进细胞凋亡对脑胶质瘤细胞的增殖和转移具有抑制作用,其机制与UNBS5162可以抑制PI3K/AKT信号通路的激活有一定相关性.
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Tamoxifen对人脑胶质瘤细胞SHG-44辐射敏感性的影响
目的 研究tamoxifen(TAM,三苯氧胺)对人脑胶质瘤细胞SHG-44辐射敏感性的影响.方法 以60Co为辐射源,细胞接受0、1、3、5、7、9Gy的γ射线照射,3H-TdR掺人法检测脑胶质瘤细胞DNA合成.人体外周血中T、B淋巴细胞分别由植物血凝素(PHA)和脂多糖(LPS)刺激后,同法测定TAM对T、B淋巴细胞转化的影响.结果 TAM使SHG-44细胞的剂量-效应曲线发生改变,且向左移,D0值下降.当TAM浓度在2～8μmol/L时对T、B细胞转化无明显抑制作用,与对照组比较无统计学意义(P>0.05).结论 TAM能提高人脑胶质瘤细胞SHG-44对60Coγ射线的辐射敏感性,且在2～8μmoL/L浓度时对外周血T、B免疫细胞的增殖无影响.
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高场强磁共振波谱观察脑胶质瘤细胞代谢特征
目的 利用14.7T高场强磁共振仪检测脑胶质瘤细胞水溶性代谢物,观察其波谱代谢特征.方法 培养并获取脑胶质瘤细胞株C6、U251,利用高氯酸提取细胞水溶性代谢物.通过14.7T高场强磁共振仪获取相应水溶性代谢物波谱并计算出乳酸(Lac)/肌酸(Cr)、琥珀酸(Suc)/Cr、N-乙酰天门冬氨酸(NAA)/Cr、胆碱复合物(Cho)/Cr、Cho/NAA、甘氨酸(Gly)/Cr、肌醇(MI)/Cr比值.结果 C6与U251脑胶质瘤细胞水溶性代谢物种类基本相同,但代谢物比值各具特征.结论 高场强磁共振波谱能在细胞水平分析代谢物特征并用于检测细胞生理、病理状态.
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亚甲蓝对C6胶质细胞的增殖抑制和促凋亡作用
亚甲蓝(MB)是噻嗪染料类化合物,为水溶性色素.对胶质瘤细胞代谢研究表明MB可直接杀伤及抑制其在体外的生长[1].我们采用大鼠C6脑胶质瘤细胞作为研究MB的工作模型,观察MB对C6细胞增殖抑制和诱导凋亡的作用,探讨MB的抗胶质瘤的作用.
