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RGD多肽(224)、蛇毒和17β-雌二醇对破骨样细胞骨吸收活性的影响
目的探讨RGD多肽(224)和ED-71对骨吸收的作用. 方法将RGD多肽(224)、蛇毒提取物(Ech)和17β-雌二醇(E2)分别加入破骨样细胞(OLC)与象牙骨片共培养体系中. 结果 10-7mol/L RGD、Ech及E2均有不同程度使骨吸收陷窝数目减少,面积缩小和空洞减少的作用. 结论 RGD-多肽(224)Ech和E2能不同程度抑制OLC骨吸收活性.
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氟化钠对大鼠破骨样细胞及其凋亡的影响
目的探讨氟化钠对大鼠破骨样细胞及其凋亡的影响,进而推测地方性氟病的发病和氟化物治疗骨质疏松的机制.方法以5mg/L NaF和15mg/L NaF饲喂正常和去卵巢(OVX)大鼠6个月,观察了体内和培养基中的NaF对大鼠破骨样细胞(OLC)形成和凋亡的影响.结果氟摄入2个月时,15mg/L NaF明显抑制正常和OVX大鼠OLC形成;第5个月时,5mg/L NaF和15mg/L NaF均抑制正常和OVX大鼠的OLC形成.氟摄入2周时,发现NaF促进OVX大鼠OLC凋亡;1个月时,NaF促进正常和OVX大鼠OLC凋亡,随时间的延长,其促进作用逐渐增强.以上作用均表现为15mg/LNaF的作用明显大于5mg/L NaF.体外NaF抑制OLC形成并促进OLC凋亡,其作用程度为15mg/LNaF＞lOmg/L NaF＞5mg/L NaF.结论体内NaF抑制正常和OVX大鼠OLC的形成并促进正常和OVX大鼠OLC凋亡,其作用是时间和剂量依赖性的.培养基中NaF抑制OLC形成并促进正常和OVX大鼠OLC的凋亡,其作用是剂量依赖性的.
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人外周血单个核细胞体外诱导成为破骨细胞样细胞阳性率研究
目的 研究人外周血单个核细胞体外诱导成为破骨细胞样细胞阳性率.方法 将人外周血以密度梯度离心方法分离出单个核细胞,实验组在地塞米松、1,25(OH)2D3和M-CSF的存在下,在盖玻片和骨磨片上与UMR 106细胞共同培养20天,对照组除不与UMR 106共培养外,其余条件与实验组相同.结果 在培养20天后,实验组电镜检查发现有多核巨噬细胞形成,有伪足,骨磨片上有骨吸收陷窝形成,盖玻片上有TRAP染色阳性细胞形成,其细胞阳性率约为3%,对照组没有TRAP阳性细胞形成.结论 人外周血单个核细胞在地塞米松、1,25(OH)2D3和M-CSF的存在下,与UMR 106细胞共同培养有TRAP阳性细胞形成,其细胞阳性率约为3%,提示可能在单核/巨噬细胞分化较早阶段就决定了哪些细胞能被诱导成为OLC.
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特异性阻断诱导培养的大鼠破骨样细胞Atp6i基因的表达
目的 筛选具有高效、高特异性地阻断体外诱导培养的大鼠破骨样细胞(osteoclast-like cells,OCL)Atp6i基因转录产物mRNA翻译过程的siRNA序列.方法 根据大鼠Atp6i基因序列设计2对siRNAs(Ⅰ、Ⅱ)序列,转染到各组体外培养第6天的OCL细胞内,转染组(Ⅰ或者ⅡsiRNA)T1组、阴性对照转染组(ⅢsiRNA)T2组、转染试剂转染组T3组以及空白对照组T4组;转染第24小时后,RT-PCR分析Atp6i mRNA的表达情况.结果Ⅰ号siRNA转染后,T1组中Atp6i基因RT-CR扩增产物密度值较其他组减少,差异明显(P＜0.01),相对密度值较其他组也明显减少(P＜0.01).结论 Ⅰ号siRNA片段特异性的抑制大鼠OCL Atp6i mRNA表达.
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淫羊藿黄酮苷及其代谢产物调控骨代谢的体外实验研究
为探讨淫羊藿黄酮苷及其代谢产物对骨形成和骨吸收的调控作用,利用酶水解法和酸水解法分别制备了淫羊藿黄酮苷的2种代谢产物.采用鼠颅盖骨机械法分离和体外培养获得成骨细胞, 采用新生兔长干骨机械分离法获得破骨细胞,采用VD3诱导鼠骨髓的造血干细胞分化成破骨样的多核巨细胞.实验组培养液为10%胎牛血清+α MEM培养液+不同浓度淫羊藿黄酮苷及代谢产物,对照组不加药.分别用四甲基偶氮唑盐和3H-TdR法检测成骨细胞的增生和碱性磷酸酶,用骨钙素衡量成骨细胞的分化状态,用Actin-ring 染色观察破骨细胞形态变化,用图像分析仪分析体外骨吸收陷窝面积,用抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察OCL的形成,用RT-PCR法检测和破骨样细胞形成有关的分子机制.发现:淫羊藿黄酮苷及其代谢产物对大鼠成骨细胞的增生有明显的刺激作用,并能够促进成骨细胞合成分泌碱性磷酸酶, 但对成骨细胞晚期分化指标骨钙素无显著作用.同时,使破骨细胞Actin-ring回缩,从而使骨吸收陷窝面积减少.此外,淫羊藿黄酮苷及其代谢产物通过影响成骨细胞中RANKL和OPG的表达而达到抑制破骨样细胞形成.以上结果说明,淫羊藿黄酮苷及其代谢产物一方面抑制破骨样细胞形成和成熟的破骨细胞对骨基质的吸收,另一方面还能够通过刺激骨形成来调控骨代谢,其中刺激骨形成的效果较强.由此推断淫羊藿黄酮苷可能是淫羊藿抗骨质疏松作用的主要有效成分.
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ED-71和1α(OH)D3对破骨样细胞的影响
目的探讨2 β(3-羟丙氧)骨化醇(ED-71)和1α(OH)D 3对破骨细胞的影响.方法取新鲜的人破骨样细胞(OLC)(骨巨细胞)置入含α-MEM培养液的24孔板中.在培养系中分别加入10 -7 ～10 -9 mol/L ED-71与1α(OH)D 3,观察细胞形态学变化,于培养第3 d、6 d计数和拍照.结果 OLC的数目在给药后第3 d,10 -9 、10 -8 mol/L ED-71组与空白组OLC数目间差别均有显著性意义(P<0.05);第6 d,3种浓度的ED-71组与空白组OLC数目间差别均有显著性意义(P<0.05).在给药后第3 d、6 d,10 -9 mol/L 1α(OH)D 3组OLC数目无明显变化,10 -7 mol/L 1α(OH)D 3组与空白组比较OLC数目间差别有显著性意义(P<0.05).结论 10 -9 和10 -8 mol/L ED-71明显抑制 OLC增殖,10 -7 mol/L ED-71和10 -7 mol/L 1α(OH)D 3对OLC的成熟和增殖有明显的促进作用.
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慢病毒转染大鼠破骨样细胞研究
目的 探讨慢病毒转染大鼠破骨样细胞的可行性.方法 诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)培养成破骨样细胞(OLC)后,将其用绿色荧光蛋白(GFP)标记的对照慢病毒进行转染,荧光显微镜下观察不同感染复数(MOI)时慢病毒转染OLC的荧光率,并用TRAP染色鉴定OLC.选择适宜的MOI并加入不同干预进行对照,分为OLC对照组、NFAT2抑制剂(VIVIT)组、NFAT2iRNA慢病毒组、对照病毒组,用RT-PCR进行基因验证.结果 对照病毒转染后,OLC随着MOI值的升高,荧光转染率增加;MOI=15时荧光数多(41.00±9.19)个/视野.不同干预后,NFAT2抑制剂组和NFAT2iRNA慢病毒组的NFAT2的基因表达明显低于OLC对照组和对照病毒组(P＜0.05).结论 慢病毒可转染大鼠破骨样细胞,并在一定范围内随MOI升高转染率增高.
关键词： 慢病毒 破骨样细胞 活化T细胞核因子家族 -
两种大鼠骨髓源破骨样细胞诱导方法的比较
目的 比较两种不同的大鼠骨髓源破骨样细胞(Osteoclast-like cells,OLC)体外分离培养的方法.方法 收集5周龄SD大鼠骨髓细胞悬液,加入M-CSF(10 ng/ml)培养24 h后置入不同的诱导培养体系中,即A组:巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)+破骨细胞分化因子(RANKL),B组:M-CSF+1,25二羟基维生素D3[1,25(OH)2D3]+地塞米松(Dexamethasone),分别于培养3、5、7、9、12 d利用抗酒石酸碱性磷酸酶(TRAP)染色、骨吸收陷窝检测等对获得的OLC进行形态学和功能观察,并进行计数比较.结果 两种方法 均可诱导出TRAP染色阳性的多核细胞.两组细胞数量均于第7天达到高峰,B组于7、9、12 d获得的细胞数量较A组多(P<0.05);B组骨吸收陷窝数于9、12 d时多于A组(P<0.05).结论 两种方法 均诱导出破骨样细胞,B组诱导OLC的细胞活性和细胞数量高于A组.
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破骨样细胞中骨保护素和 NF－κB配体受体的表达及其意义
目的：探讨破骨样细胞中骨保护素（ OPG）和 NF－κB配体受体（ RANKL）表达情况。方法单独培养骨髓单核细胞前体，用巨噬细胞集落刺激因子（ M－CSF）和维生素D诱导其转化为破骨样细胞，在0、5、10、15 d用光镜观察和TRAP染色（抗酒石酸染色）评估破骨样细胞的转化程度，用RT－PCR检测OPG和RANKL的表达情况；然后构建主动脉中膜平滑肌细胞（ SMC）与骨髓单核细胞前体共培养的模型，用维生素 C 和β－磷酸甘油诱导SMC转化为成骨样细胞，并在0、5、10、15 d用同样方法再次检测共培养中破骨样细胞转化的情况，以及两种细胞中OPG和 RANKL的表达情况。结果不管是单独培养、还是共培养，破骨样细胞中始终没有OPG和RANKL的表达。结论破骨样细胞的转化可能主要受成骨样细胞分泌的OPG和RANKL调控，本身并没有分泌OPG和RANKL进行自身调节的机制存在。
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源于脾干细胞的破骨细胞诱导生成及培养
目的建立一种可以获得大量破骨细胞或破骨样细胞的方法,以便进行原发性骨质疏松有关破骨细胞的研究.方法 C57雌性小鼠经尾静脉注射5-氟脲嘧啶后,取脾细胞悬液在含有rmIL-3, rhIL-6和胎牛血清(FCS)以及牛血清白蛋白(BSA)的α-MEM-琼脂半固体培养7 d左右,获得脾脏造血干细胞集落;此集落再以粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)诱导生成破骨样细胞.结果经活体观察、酒石酸-抗酸性磷酸酶(TRAP)染色、扫描电镜检查,证实所得细胞为破骨细胞.结论建立了一种获得大量破骨细胞或破骨样细胞方法,即源于脾干细胞的破骨样细胞的诱导生成及其培养.
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17β-雌二醇对人破骨样细胞RANK、CK mRNA表达的作用
目的观察17β-雌二醇(17β-E2)对破骨样细胞破骨细胞分化因子受体(RANK)和组织蛋白酶K(CK)mRNA表达的影响.方法人巨细胞瘤组织经过滤、培养、洗涤、胰酶消化后再经孔径25μm微过滤网过滤,得到纯化的破骨样细胞,用RT-PCR观察17β-E2对人破骨样细胞CK及RANK mRNA表达的影响.结果(1)破骨样细胞具有成熟破骨细胞的表型特征,如抗酒石酸酸性磷酸酶和酸性磷酸酶染色阳性、具有溶骨作用,可表达CK和RANK;(2)17β-E2对人破骨样细胞RANK mRNA表达无明显影响,但下调CK mRNA表达(P＜0.05).结论破骨样细胞是进行破骨细胞研究的较好细胞来源;17β-E2可下调破骨样细胞CK mRNA表达.下调CK基因表达是绝经后雌激素补充治疗的药理机制之一.
关键词： 破骨样细胞 破骨细胞分化因子受体(RANK) 组织蛋白酶k -
金雀异黄素对IL-1α刺激破骨样细胞的组织蛋白酶K表达的影响
目的:探讨金雀异黄素对白细胞介素1α(IL-1α)刺激破骨样细胞组织蛋白酶K(CK)表达的作用.方法:从人骨巨细胞瘤组织中纯化出破骨样细胞(OCLs),用不同浓度的金雀异黄素或1 7β-雌二醇(17β-E2)孵育,并设空白对照组和阳性对照组,采用RT-PCR和Western blot方法,观察IL-1α刺激后CK的表达.结果:与空白对照组相比,IL-1α刺激CK表达显著增加(P＜0.01);金雀异黄素在转录水平下调IL-1α刺激后CK的表达,且呈剂量依赖关系(r=0.68,P＜0.01);金雀异黄素下调IL-1α刺激后CK的蛋白表达,且呈剂量依赖关系(r=0.61,P＜0.01).雌激素受体拮抗剂ICI 182.780可以部分抑制金雀异黄素的上述作用.结论:金雀异黄素可通过破骨样细胞的雌激素受体部分抑制IL-1α刺激后CK的表达.
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不同浓度破骨细胞分化因子和巨噬细胞集落刺激因子体外诱导大鼠破骨样细胞形成的研究
目的 探讨破骨细胞分化因子和巨噬细胞集落刺激因子在大鼠破骨样细胞形成、分化中的作用,为进一步研究正畸牙齿移动的生物力学机制奠定基础.方法 应用不同浓度的破骨细胞分化因子和巨噬细胞集落刺激因子对提取的SD大鼠骨髓单个核细胞进行诱导培养,分别于培养1、3、5、7 d利用TRAP染色、骨吸收陷窝检测等对单核及多核破骨样细胞的生成进行鉴定,对TRAP(+)的细胞进行计数和统计学分析.结果 巨噬细胞集落刺激因子和破骨细胞分化因子对TRAP(+)的单核及多核破骨样细胞的诱导分化作用与时间有关:第3 d时逐渐增多,以第5 d和第7 d为多;缺乏巨噬细胞集落刺激因子时.骨髓单个核细胞不能有效地分化为TRAP(+)的细胞;在破骨细胞分化因子浓度一定的条件下(50 ng/ml),TRAP(+)的细胞数与巨噬细胞集落刺激因子的浓度有关,当其浓度超过30ng/ml时,TRAP(+)细胞数不再显著增加,曲线趋于平缓;当巨噬细胞集落刺激因子浓度一定的条件(50 ng/ml)下,TRAP(+)的细胞数与破骨细胞分化因子的浓度无关.结论 以巨噬细胞集落刺激因子和破骨细胞分化因子作为诱导因子,对大鼠骨髓单个核细胞进行诱导培养,可获得TRAP(+)吸收陷窝(+)的破骨样细胞,且巨噬细胞集落刺激因子30 ns/ml、破骨细胞分化因子50 ng/ml时具有强的生物学效应.
关键词： 破骨样细胞 体外培养 破骨细胞分化因子 巨噬细胞集落刺激因子 -
羧甲基赖氨酸对人外周血单核细胞破骨样转化的影响
目的：探讨羧甲基赖氨酸（ CML）对外周血单核细胞破骨样转化的影响。方法：从外周血分离提取单核细胞，分为3组：细胞核因子κB受体活化因子配基（ RANK-L）＋巨噬细胞集落刺激因子（ M-CSF）诱导组（ A组），CML＋RANK-L＋M-CSF干预组（ B组），空白对照组（ C组）。利用RANK-L和M-CSF诱导其破骨样转化，每天通过倒置显微镜观察细胞生长形态及计算细胞核个数，培养8d后通过抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色法观察破骨样细胞的形成，Western blotting 检测破骨细胞标志物组织蛋白酶K蛋白表达。结果：随着培养时间的延长，A组TRAP阳性多核细胞数明显增加，B组TRAP阳性多核细胞数较A组明显减少（P＜0．05），B组组织蛋白酶K表达亦较A组明显降低（P＜0．05）。结论：CML能够抑制外周血单核细胞向破骨样细胞转化。
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不同代数RAW264.7细胞分化为破骨细胞样细胞的能力研究
目的:观察不同代数RAW264.7细胞形成破骨细胞样细胞的能力是否改变.方法:以细胞核因子κB受体激活物的配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)为诱导剂,选用第6、9、13、18、24代RAW264.7细胞在体外诱导6天,固定细胞行抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色,计数阳性细胞数及总细胞数.结果:第6、9、13、18、24代细胞均有TRAP染色阳性细胞:第6、9、13、18代细胞的阳性率无显著差异(P＞0.05),而第24代与第6、9、13、18代细胞的阳性率显著降低(P＜0.01).结论:RANKL可以诱导RAW264.7细胞形成破骨细胞样细胞;RAW264.7细胞经多次传代后分化为破骨细胞样细胞的能力明显减弱.
关键词： RAW264.7细胞 破骨样细胞 RANKL -
两种不同培养方法对破骨细胞ATPase a3基因表达和骨吸收活性的影响
[目的]探讨不同方法培养下的大鼠破骨细胞(osteoclast,OC)骨吸收功能的差异,以及骨吸收关键基因ATPase a3的mR-NA表达水平的差异,为体外实验奠定基础.[方法]机械分离和诱导培养,即从新生24h的大鼠长干骨骨髓腔内壁机械分离成熟OC和1,25(OH)2D3诱导大鼠骨髓细胞形成破骨样细胞(osteoclast like cell,OLC),对获得的OC进行形态和骨吸收功能观察,并测定OC骨吸收关键基因ATPase a3的mRNA表达水平的差异.[结果]OC和OLC均为抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resist-ant acid phosphatase,TRAP)染色阳性的多核巨细胞,与细胞共培养骨片上可形成骨吸收陷窝;诱导法培养出的OLC数目多于机械分离法,但诱导早期陷窝较之小而浅,诱导后期基本接近OC;OC骨吸收关键基因ATPase a3的mRNA,在机械分离8h与诱导培养6天的细胞表达量无显著差异,但都远少于培养8天的表达量.[结论]诱导法可以培育出大量的OLC,优于机械分离法,但早期骨吸收功能较弱,OC骨吸收功能与其核数相关.后期的OCL与机械分离OC接近,可以用于各类实验.
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犬乳恒牙替换期利钠利尿肽的表达
目的观察不同发育阶段的犬牙槽骨破骨细胞中C型利钠利尿肽(CNP)的表达情况,探讨其是否参与破骨细胞的分化过程.方法制作犬乳恒牙替换期牙槽骨组织切片,采用免疫组化检测破骨细胞中CNP的表达情况.结果可见破骨细胞中CNP有阳性表达,在不同发育阶段CNP表达强弱不同.结论CNP可能参与了破骨样细胞的发育、分化及成熟的过程.
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牙周膜成纤维细胞对外周血单个核细胞分化的影响
目的:探讨牙周膜成纤维细胞在破骨细胞形成过程中作用；观察破骨样细胞的生长过程.方法:本实验以含有1α,25(OH)2D3和地塞米松的培养基将牙周膜成纤维细胞、单个核细胞分别进行单独或直接共培养,每3d对TRAP阳性多核破骨细胞的数量及牙本质磨片的吸收陷窝数目和面积分别进行记录、计算.结果:不同时间段间的TRAP阳性单个核细胞与TRAP阳性多核细胞数目相比较,差异具有统计学意义(P＜0.05)；同时,不同组间的吸收陷窝数目和面积比较,差异具有显著性(P＜0.001).牙周膜成纤维细胞明显增加了共培养组TRAP阳性多核细胞数量、吸收陷窝数目和面积.然而牙周膜成纤维细胞组与单个核细胞组之间的吸收陷窝数目与吸收陷窝面积差异无统计学意义.结论:末梢血单个核细胞需在牙周膜成纤维细胞存在的条件下,才能形成多核的破骨样细胞.
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氟离子植入猪骨源羟基磷灰石对破骨样细胞生物学行为影响的体外研究
目的：研究氟离子植入猪骨源羟基磷灰石对破骨样细胞体外生物学行为的影响。方法：化学浸泡结合高温烧结法制备氟化猪骨源羟基磷灰石，以小鼠单核巨噬细胞株RAW264．7诱导形成破骨样细胞，扫描电镜观察破骨样细胞在材料表面黏附、分化与功能，CCK－8法检测材料上前破骨样细胞的增殖活性，酶活性定量检测细胞内抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate resistant acid phosphatase， TRAP）活性。结果：破骨样细胞可在氟离子植入猪骨源羟基磷灰石上黏附、分化并发挥吸收功能，材料对前破骨样细胞的增殖活性无明显抑制作用，但可降低破骨样细胞TRAP的表达。结论：氟离子植入猪骨源羟基磷灰石可抑制破骨样细胞的骨吸收作用。
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类风湿关节炎患者外周血单核细胞诱导转分化为破骨样细胞
目的 建立类风湿关节炎(RA)患者外周血单核细胞(PBMCs)转分化的培养体系,并对所培养的破骨样细胞(OLC)进行鉴定.方法 抽取RA患者外周静脉血,密度梯度离心法获得PBMCs,分别接种于玻片和骨磨片.随机分为单核细胞集落刺激因子(M-CSF)组(A组),加入25μg/L M-CSF;协同作用组(B组),分别加入不同浓度的核因子κB受体活化子配体(RANKL),5、10、20、25、50μg/L)和25μg/L M-CSF.培养至4、12和20 d时,取玻片行HE染色和抗酒石酸磷酸酶染色计数OLC,取骨磨片行甲苯胺兰染色检测OLC骨吸收活性.结果 对OLC转分化的影响:各组细胞分别于4、12、20 d染色,显示RANKL呈浓度及时间依赖性诱导OLC形成(P<0.05).对OLC骨吸收活性的影响:RANKL和M-CSF协同诱导骨磨片上吸收陷窝的形成,RANKL呈浓度及时间依赖性增强OLC的吸收活性(P<0.05);单独M-CSF刺激不能形成骨吸收陷窝.结论 RANKL和M-CSF可协同诱导RA患者PBMCs转分化为OLC,该培养方法稳定、有效,具有可重复性.
