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自发永生性转化人胚肺上皮细胞系HLEC的建立及鉴定
目的对源自人胚肺组织原代培养、形态似上皮类型的细胞系--人肺上皮细胞(HLEC)的生物学特性进行鉴定,为相关研究和应用提供模型和依据.方法分别采用相差显微镜下观察、细胞计数、β-半乳糖苷酶染色、免疫荧光细胞化学.人Alu序列PCR扩增、染色体计数、软琼脂集落形成实验和裸鼠致瘤实验对HLEC的形态学特征、生长特性、衰老状态、上皮细胞标志物、来源、细胞遗传学特点和恶性转化等生物学特性进行研究鉴定.结果HLEC角蛋白和上皮型细胞间黏附分子钙黏着素E-cadherin免疫荧光染色阳性,染色体众数在41～44,人Alu序列PCR扩增结果阳性,β-半乳糖苷酶阳性细胞的比例未见随细胞代数的增加而升高,软琼脂和裸鼠体内均不生长,微丝及黏着斑结构正常.结论HLEC细胞具有永生化细胞特征、属相对正常人肺上皮亚二倍体细胞,可用于肺癌癌变机理研究和癌细胞的相对正常对照.
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过氧化氢上调白细胞介素1β诱导人肺上皮细胞表达环氧合酶2
目的探讨过氧化氢(H2O2)对白细胞介素1β(IL-1β)诱导人肺上皮细胞(HPEC)环氧合酶2(COX-2)表达的影响.方法应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)半定量法和酶联免疫吸附试验 (ELISA)测定IL-1β、H2O2或二者联合干预后HPEC COX-2 mRNA表达量及前列腺素E2(PGE2)释放量的变化, 以不加任何试剂的细胞为对照组.结果 (1)COX-2 mRNA表达量:1、5、10 mg/L 的IL-1β处理组COX-2 mRNA表达量分别为(143.1±7.2)%、(179.9±9.0)%、(190.0±9.5)%,对照组为(32.9±1.7)%,1、5、10 mg/L 的IL-1β处理组与对照组比较差异有显著性(P均<0.05); (2)培养基上清液PGE2浓度:5、10 mg/L 的IL-1β处理组培养基上清液PGE2浓度分别为 (20.86±5.23)×10-6 g/L、(31.16±2.64)×10-6 g/L,对照组为(10.49±0.36)×10-6 g/L, 5、10 mg/L 的IL-1β处理组与对照组比较差异有显著性(P<0.05);(3) COX-2 mRNA表达量: 0.10、0.25、0.50 mmol/L 的H2O2和IL-1β共处理组COX-2 mRNA表达量分别为 (149.2±7.5)%、(189.6±9.5)%、(239.1±12.0)%, IL-1β单独处理组为(66.1±3.7)%, 对照组为(41.6±2.1)%, 0.10、0.25、0.50 mmol/L 的H2O2和IL-1β共处理组与IL-1β单独处理组比较,差异有显著性 (P<0.05); (4)培养基上清液PGE2浓度:0.10、0.25、0.50 mmol/L的H2O2和IL-1β共处理组,培养基上清液PGE2浓度分别为 (27.01±5.16)×10-6 g/L、(32.79±3.01)×10-6 g/L、(41.13±3.41)×10-6 g/L,对照组为(10.49±0.36)×10-6 g/L,0.10、0.25、0.50 mmol/L的H2O2和IL-1β共处理组与对照组比较差异有显著性(P<0.05).0.25、0.50 mmol/L的 H2O2和IL-1β共处理组PGE2浓度均与IL-1β单独处理组[(20.86±5.23)×10-6 g/L]比较差异有显著性 (P<0.05). 结论过氧化氢上调IL-1β对HPEC COX-2的诱导表达,其调节机制可能发生在转录水平.
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慢性阻塞性肺疾病患者诱导痰内皮素和前列腺素E2水平的变化及内皮素1对人肺上皮细胞环氧合酶2表达的调节
研究表明,内皮素1(ET-1)及环氧合酶2(COX-2)在慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者的诱导痰中表达增加[1,2].本组试验比较COPD患者和健康者诱导痰中ET及前列腺素E2(PGE2)的表达水平,并利用人肺上皮细胞,初步探讨ET-1对COX-2表达的作用.
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人肺上皮细胞C反应蛋白的表达
C反应蛋白(CRP)是一种急性时相蛋白,主要在肝脏由细胞炎症因子白细胞介素6(IL-6)刺激肝细胞合成及分泌[1].近来有文献报道,呼吸道本身可能存在有CRP的分泌现象[2,3].我们的研究旨在探讨肺泡Ⅱ型细胞在脂多糖(LPS)诱导下是否有CRP的表达和分泌.
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慢性阻塞性肺疾病患者诱导痰白细胞介素8水平及白细胞介素1β诱导人肺上皮细胞白细胞介素8表达的调节机制
我们比较慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者和健康者诱导痰中白细胞介素8(IL-8)表达水平的差异,并研究IL-1β诱导人肺上皮细胞IL-8表达的信号传导途径.
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人肺上皮细胞在基底周期性拉伸下的增殖与整联蛋白再分布
呼吸过程中,肺泡上皮细胞有着独特的力学环境,其粘附的基膜有较大的周期性拉伸应变(10%～30%).这一应变的变化导致哪些生物学响应,并终如何调控肺结构、功能、代谢等生理活动或肺发育不全、哮喘、肺损伤等病理过程?在此过程中整合素作为跨膜信号转导分子行为如何?
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蛔虫感染期幼虫提取液对人肺上皮细胞的细胞毒作用
蛔虫是危害地域广、感染人数多的病原生物之一,全球蛔虫感染者约14亿,我国感染人数近全国人口的一半,遍及各省[1].蛔虫感染可造成变态反应、肠功能障碍等,并可引起严重并发症.本研究利用人蛔虫感染期幼虫提取液,对体外培养的人肺上皮细胞(A549细胞)进行干预,观察其对A549细胞的细胞毒性作用及其与浓度的关系,探讨蛔虫感染引起宿主病变的发病机制.
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转化生长因子-β1诱导人肺上皮细胞E-钙黏蛋白表达的变化
目的 观察重组人转化生长因子-β1(rhTGF-β1)诱导人肺上皮细胞(A549)E-Cad蛋白表达的变化.方法将体外培养的A549用不同浓度的rhTGr-β1干预,48 h后收集蛋白用Wester blot和间接免疫荧光方法检测上皮细胞表型E-钙黏蛋白(E-Cad)表达的变化.结果 rhTGF-β1诱导A549下调上皮细胞表型E-Cad表达,并呈浓度依赖性.结论 rhTGF-β1可诱导A549细胞E-Cad表达下调,支持在肺上皮细胞发生上皮细胞-间质转化(EMT)的观点.
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SLPI对脂多糖诱导人肺上皮细胞中SP-D表达的影响
目的 研究分泌型白细胞蛋白酶抑制因子(SLPI)对脂多糖(LPS)诱导的人肺上皮细胞株A549中肺表面活性物质D(SP-D)表达的影响.方法 体外培养A549细胞,分为空白对照组(A组)、LPS 10 μg/ml刺激组(B组)、pcDNA3.1(+)-SLPI转染组(C组)和pcDNA3.1(+)转染组(D组).采用RT-PCR和Western blot分别检测SP-D mRNA和蛋白表达.结果 与A组相比,C组SPD mRNA和蛋白表达增加(P＜0.05),而B组和D组SP-D mRNA和蛋白表达降低(P＜0.05);C组SP-D mRNA和蛋白表达均较B组增加(P＜0.01).结论 SLPI能拮抗LPS的炎性作用,刺激人肺上皮细胞中SP-D的分泌,提示SLPI对LPS诱导的肺损伤具有保护作用.
关键词： 分泌型白细胞蛋白酶抑制因子 表面活性物质D 脂多糖 人肺上皮细胞 -
抵抗素、miRNA-26b在婴幼儿毛细支气管炎中的表达
目的 探讨婴幼儿毛细支气管炎中miRNA-26b、抵抗素的变化.方法 收集毛细支气管炎患儿的血液,以正常儿童为对照,通过酶联免疫吸附(ELISA)法测定血清中白介素(IL)-8、抵抗素浓度,并利用实时定量PCR技术测定血液淋巴细胞中miRNA-26b、抵抗素mRNA表达,利用miRNA-26b mimics干预人肺上皮细胞A549,通过实时定量PCR技术测定miRNA-26b、抵抗素mRNA及细胞上清液中IL-8蛋白浓度变化.结果 毛细支气管炎患儿外周血清中IL-8、抵抗素浓度均升高,血液淋巴细胞中miRNA-26b、抵抗素mRNA表达增加;经过干预的A549细胞miRNA-26b、抵抗素mRNA及细胞上清液中IL-8蛋白浓度均有增加.结论 miRNA-26b、抵抗素在毛细支气管炎患儿血液淋巴细胞中存在差异表达,而这可能参与了炎症反应的发生.
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JNK对TGF-β1诱导的人肺上皮-间质转分化的调控作用
目的：探讨c‐Jun氨基末端激酶（JNK）在转化生长因子‐β1（TGF‐β1）诱导的人肺上皮细胞A549转分化中的调控作用。方法将体外培养的人肺上皮细胞（A549）随机分成3组：正常对照组、TGF‐β1组（加入10 ng／mL TGF‐β1）及抑制剂组（加入10 ng／mL TGF‐β1和20μmol／L JNK的特异性抑制剂Sp600125），培养于3％的血清培养液中，光镜下观察3组细胞形态的变化，并通过RT‐PCT检测各组A549细胞的上皮标志物E‐钙黏蛋白（E‐cadherin ，E‐cad）及间充质标志物α‐平滑肌肌动蛋白（α‐smooth muscle actin ，α‐SMA）和胶原纤维Ⅰ（collagen fibersⅠ，ColⅠ）的表达的变化，West‐ern blot检测JNK磷酸化（p‐JNK）水平的变化。结果正常对照组体外培养的A549细胞光镜下为鹅卵石样紧密排列生长，有E‐cad表达及微量的α‐SMA、ColⅠ及p‐JNK表达。TGF‐β1组培养72 h后细胞基本长成梭形、纺锤形，E‐cad表达下调，α‐SMA、ColⅠ及p‐JNK表达上调。与 TGF‐β1组比较，抑制剂组培养72 h后细胞梭形有所逆转，E‐cad表达上调，α‐SM A、ColⅠ及p‐JNK表达明显抑制；与正常对照组比较，细胞形态较扁长，E‐cad、α‐SM A、ColⅠ及p‐JNK表达差异无统计学意义。结论 JNK信号通路参与 TGF‐β1介导的人肺上皮‐间质转分化过程，JNK的特异性抑制剂Sp600125可有效抑制该过程。
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PI3K/Akt信号通路对转化生长因子β1诱导的人肺上皮-间质细胞转分化的影响
目的:探讨磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)通路在转化生长因子β1(TGF-β1)体外诱导的人肺上皮细胞A549间充质化过程中的作用.方法:将体外培养的A549细胞随机分成3组:正常对照组、TGF-β1组及抑制剂组,正常对照组不加入TGF-β1,TGF-β1组加入10 ng/mL TGF-β1,抑制剂组加入TGF-β1(10 ng/mL)和PO3K的抑制剂Ly294002(10 nmol/L),72 h后通过RT-PCR检测各组A549细胞上皮标志物E-钙黏蛋白(E-cad)及间充质细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的变化,ELISA方法检测间充质细胞标志物纤连蛋白(Fn)表达的变化,Western blot检测Akt磷酸化(p-Akt)水平的变化.所有实验至少重复3次.结果:正常体外培养的A549细胞有E-cad表达及微量的α-SMA、Fn、p-Akt表达;TGF-β1组E-cad的表达下调,α-SMA、Fn、p-Akt的表达上调;抑制剂组与TGF-β1组比较E-cad的表达上调,α-SMA、Fn、p-Akt的表达明显抑制.结论:PI3K/Akt途径参与TGF-β1介导的肺上皮-间质细胞转分化过程,PI3K特异性抑制剂Ly294002可有效抑制TGF-β1介导的肺上皮-间质细胞转分化过程.
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不同质量浓度脂多糖对人肺上皮细胞活性的影响
目的 通过不同质量浓度脂多糖(LPS)诱导肺上皮细胞,观察细胞活性的变化,为急性肺损伤(ALI)细胞实验提供基础数据.方法 用不同质量浓度LPS(0.050,0.100,0.125,0.250,0.500,1.000,5.000,10.000,50.000,100.000μg/mL)刺激人肺上皮细胞,建立ALI细胞模型,48 h后应用CCK-8试验检测LPS对人肺上皮细胞的活性的影响,并采用RT-PCR法测定细胞间黏附分子-1(ICAM-1)mRNA表达量.结果 10μg/mL LPS可诱导肺上皮细胞活性明显下降,ICAM-1 mRNA表达量显著升高(P<0.05),但细胞坏死不明显.当LPS质量浓度高于50μg/mL时肺上皮细胞活性持续下降,细胞坏死比较明显.结论 LPS质量浓度控制在10～50μg/mL适合ALI细胞模型.
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机械拉伸对人肺上皮细胞粘附及[Ca2+]i的影响
目的探讨周期性拉伸应变对人肺上皮细胞H727的力学性质及其[Ca2+]i的调控作用.方法应用微管吸吮系统测定细胞与基底间的粘附力和细胞的铺展面积,用荧光探针Fluo-3/AM测定拉伸应变对人肺上皮细胞H727[Ca2+]i的影响.结果在应变为15%,频率为40次/min的拉伸刺激下,与其静态对照组相比,细胞与基底间的粘附力和细胞的铺展面积均增加;拉伸5 min后,[Ca2+]i比对照组有明显增加,用三七总皂苷阻断胞内Ca2+离子通道后,细胞对应变的响应仍表现出[Ca2+]i的升高,但与未加三七总皂苷的实验组相比,[Ca2+]i响应应变后的升高由原来的3.4倍的增加降低为1.5倍的增加.结论在人肺上皮细胞H727响应周期性拉伸应变的过程中,[Ca2+]i的升高既有胞外钙内流的参与,也有胞内钙库的释放作用,其中胞外钙通过跨膜通道的内流起主要作用.
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机械拉伸下人肺上皮细胞增殖及整联蛋白再分布
目的探讨机械拉伸应变对人肺上皮细胞增殖及其膜受体--整联蛋白α5、β1再分布的调控作用.方法建立体外周期性拉伸装置,应用流式细胞术测定细胞的增殖活性,激光共聚焦显微镜分析整联蛋白α5、β1再分布.结果在应变为15%,频率为20次/min、40次/min的拉伸刺激下,24 h后,细胞的增殖活性指数明显降低,H727细胞的DNA合成受到显著抑制.在40次/min的拉伸频率下,整联蛋白α5、β1的分布发生重组并向基底层转移,形成局部粘附连接.结论整联蛋白α5、β1可能在肺上皮细胞感应机械应力过程中起了重要的作用.
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克雷伯杆菌分泌因子及菌体成分在细胞内、外刺激肺上皮细胞分泌IL-8的研究
目的:通过比较肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae,Kp)分泌因子及菌体成分对经过digitonin处理和未处理的肺上皮细胞株IL-8分泌的影响,进一步了解克雷伯杆菌诱导肺上皮细胞炎症反应的信号转导机制.方法:实验分为两组,一组使用能使细胞膜通透性增加的温和去污剂digitonin处理,而另一组不处理.分别用Kp03183的细菌培养上清和超声处理的菌体成分刺激肺上皮细胞株A549,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞IL-8表达水平.并用RT-PCR的方法检测肺上皮细胞胞内模式识别受体NOD1的表达.结果:Kp培养上清对未经digitonin处理的细胞IL-8分泌无明显增强作用,与对照相比差异无显著意义(P>0.05),菌体成分能刺激IL-8的作用都增加(P<0.01),但增高不超过一倍.经digitonin处理合细胞膜通透性增加后,Kp培养上清及菌体成分刺激细胞IL-8的作用都增强,菌体万分刺激IL-8效果更为显著,为对照的3倍,而培养上清作用相对较弱.RT-PCR的检测结果表明,肺上皮细胞表达胞内模式识别受体NOD1.结论:菌体成分是诱导炎症反应更有效的刺激物,肺炎克雷柏杆菌侵入肺上皮细胞可能是引发细胞炎症反应的始动环节.肺上皮细胞表达胸内模式识别受体NOD1,它是否参与肺上皮细胞识别肺炎克雷伯杆菌菌体成分,值得进一步的研究.
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肺炎克雷伯杆菌分泌因子及活菌诱导人肺上皮细胞表达分泌IL-8的研究
目的:探讨肺炎克雷伯杆茵(Klebsiella pneumoniae,Kp)分泌因子及活茵诱导肺上皮细胞株表达和分泌IL-8的状况.方法:用临床分离株Kp03116、Kp03183的细菌培养上清或活茵刺激肺上皮细胞株A549和SPC-A-1,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞IL-8表达量.结果:①两株Kp培养上清分别刺激A549或SPC-A-1后,IL-8表达量均有显著增高(P＜0.01),且随上清刺激浓度增加而上升.②两株Kp及DH5(活茵分别与SPC-A-1共孵育2h,用庆大霉素杀死胞外茵,继续孵育24h后两株Kp诱导细胞IL-8表达量均显著高于DH5α(P＜0.01),且随细菌数/细胞数比例增大而上升.结论:Kp分泌因子及活茵都能够诱导肺上皮细胞IL-8表达,而活茵上调IL-8的效应较培育上清分泌因子更显著,提示肺上皮细胞在Kp感染刺激的肺部炎症反应中起重要作用.
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高糖经由ROS或TGF-β1/PI3K/Akt信号途径促进肺腺癌A549细胞HO-1表达增加
目的 探讨高糖对肺腺癌A549细胞血红素加氧酶-1(HO-1)表达的影响及机制.方法 应用Westernblot技术和逆转录PCR技术检测高糖对人肺腺癌上皮细胞系A549细胞HO-1的表达.应用酶联免疫吸附试验检测HO-1酶活性和氧化应激产物.结果 用25 mmol/L高糖处理肺A549细胞0、24、48、72 h,以及用5、10、25、40mmol/L葡萄糖处理A549细胞48 h,在蛋白水平和RNA水平,高糖诱导肺A549细胞HO-1表达呈浓度和时间依赖性.高糖诱导A549细胞活性氧(ROS)和转化生长因子β1(TGF-β1)产生增加,并介导HO-1表达增加.伴随HO-1表达增加,HO-1酶活性也相应增加.抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)和PI3K/Akt抑制剂可抑制高糖诱导的肺上皮细胞HO-1表达.结论高糖促进肺上皮细胞ROS和TGF-β1产生,介导HO-1表达增加,并伴随HO-1酶活性增加.
