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雌激素具有抗血管平滑肌细胞应激性衰老效应
目的 探讨雌激素对血管平滑肌细胞(VSMCs)应激性衰老的影响及其机制. 方法 体外培养的第2～3代雌性SD大鼠VSMCs在无或有不同浓度(10-10mol/L～10-8mol/L)17β-雌二醇(E2)存在时,用150μmol/L H2O2诱导应激性衰老.流式细胞术、细胞化学染色、Pull down assay和Western blotting等检测衰老相关标志DcR2、衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)、原癌基因Ras及细胞周期负性调控因子p21WAF1的表达或活性. 结果 流式细胞术显示,在生理浓度范围内,E2呈剂量依赖性地抑制H2O2诱导的VSMCs DcR2高表达、其中大抑制作用达14.48%±0.6%(E2=10-8mol/L;P <0.05, n =3),且这一效应可被雌激素受体阻断剂ICI 182、780阻断.细胞化学染色、Pull down和Western blotting检测显示,10-8mol/L E2可显著性地抑制H2O2所致的SA-β-Gal阳性VSMCs上升(20.5%±1.4%和9.6%±0.9%;P <0.05, n =9)、Ras活性增高(0.60±0.06和0.26±0.04;P <0.05, n =3)及p21WAF1表达上调(0.46±0.04和0.33±0.02;P <0.05, n =3). 结论 雌激素具有抗VSMCs应激性衰老的效应,其机制可能与抑制Ras激活和p21WAF1表达相关.
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CSL载体构建表达纯化及活性鉴定
目的 构建Calpastatin N末端结构域Calpastatin domain L(CSL)(a.a.150-230)融合蛋白质粒,表达、提取、纯化CSL蛋白并进行生物学活性鉴定.方法 将CSL的cDNA片段插入pGEX-6p-3质粒载体后,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,大量培养后用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导蛋白表达,超声破碎法提取CS;蛋白.利用Glutathione-Sepharose 4B(GS-4B)beads和PreScission蛋白酶分离纯化蛋白,pull down assay检测其生物学活性.结果 CSL质粒经测序比对后表明构建成功;超声破碎法提取的CSL蛋白纯度和浓度均较高,并具有能够与GST-CT1融合蛋白浓度依赖性结合的生物学活性.结论 成功构建CSL融合蛋白质粒,提取纯化具有生物活性的CSL蛋白,为探讨Cav1.2钙通道自身调节机制奠定基础.
关键词： 钙蛋白酶抑素 Pull down assay 质粒构建
