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复方银杏叶颗粒改善人脐静脉内皮细胞氧化应激损伤的作用及其机制研究
该实验于体外使用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)与复方银杏叶颗粒(80,160,320,640 mg· L-1)预孵育,合并使用H2O2(1 200 μmol·L-1)建立氧化应激损伤模型.采用MTT法研究药物对HUVEC细胞增殖情况的影响,检测细胞培养上清中的LDH,MDA,NO含量及SOD活性,判断药物对内皮细胞的保护作用.通过Casepase-3活性检测以及ArnexinV-FITC/PI流式细胞术,检测药物对细胞凋亡的保护作用.使用Western blot法测定凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达.研究发现1 200μ.mol·L1H2O2能够诱导内皮细胞产生氧化应激损伤,使细胞存活率降低,且细胞增殖抑制程度与H2O2的作用时间呈正相关.而80,160,320,640 mg·L-1的复方银杏叶颗粒能够明显减轻该模型下内皮细胞的氧化应激损伤,恢复细胞正常增殖水平,改善细胞状态,抑制细胞凋亡,同时能够上调Bcl-2的表达以及下调Bax的蛋白表达.该实验证明了复方银杏叶颗粒对H2O2诱导的内皮细胞氧化应激损伤及细胞凋亡具有一定的保护作用,其机制可能与复方银杏叶颗粒抑制了内皮细胞凋亡的线粒体途径有关.
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基于网络药理学分析丹参山楂组分配伍抗动脉粥样硬化的作用机制研究
该文基于网络药理学预测及体外细胞验证的方法,对丹参山楂有效组分配伍(SC121)抗动脉粥样硬化(AS)的作用机制进行了探讨.根据SC121所含成分的结构类型及药效活性报道,选取丹酚酸B、丹参酮ⅡA、丹参素、表儿茶素及原花青素B2作为SC121的主要活性成分,用于网络药理学分析.运用TCMSP数据库,筛选上述5个主要成分作用于心血管疾病的网络靶点;结合KEGG和Uniprot数据库,进行信号通路和生物途径分析,预测其作用机制.在网络药理学预测的基础上,建立体外细胞模型,观察SC121对ox-LDL诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和巨噬细胞RAW264.7损伤及泡沫化的保护作用.网络分析结果显示,SC121可通过作用同一靶点或不同靶点发挥抗AS作用,其作用机制与调节PPAR,renin-angiotensin system等多通路,参与炎症反应、内皮细胞保护及脂质生物合成和代谢等多生物途径有关.细胞实验结果表明,SC121可减轻ox-LDL对HUVEC和RAW264.7的损伤程度,降低RAW264.7细胞内活性氧水平,减少泡沫细胞面积,并呈一定的量效关系.即在体外细胞模型上,5C121可抑制内皮细胞损伤、抗氧化等,验证了网络药理学的预测结果,综合阐释了5C121抗AS的作用机制.
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RhoA介导凝血酶或脂多糖诱导内皮细胞株单层通透性增高
目的探讨RhoA在凝血酶或脂多糖(LPS)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)单层通透性改变中的作用.方法用免疫荧光和改良的Boydon小室分别检测HUVECs F-肌动蛋白和单层通透性;用Western blot和免疫组化分析HUVECs内RhoA的表达;用RT-PCR检测RhoA mRNA表达.结果HUVECs经凝血酶或LPS处理后,F-肌动蛋白解聚,细胞周边形成应力纤维,HUVECs单层通透性增高;RhoA蛋白和mRNA表达上调;Rho激酶抑制剂Y-27632能明显缓解上述变化.结论RhoA参与凝血酶或LPS诱导的HUVECs的F-肌动蛋白的重构和单层通透性的改变.
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养阴化瘀剔络方对血管内皮细胞的增殖及损伤保护作用研究
目的 研究养阴化瘀剔络方对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)增殖作用的影响和对过氧化氢(H2O2)损伤HUVEC的保护作用.方法 250μmol/L H2O2诱导HUVEC细胞损伤,用四甲基偶氨唑蓝(MTT)比色法检测细胞存活数量,用比色法测细胞培养液中过氧化物丙二醛(MDA)含量.结果 养阴化瘀方对正常HUVEC细胞增殖作用无明显影响,对H2O2诱导的内皮细胞损伤有明显抑制作用,对上清中H2O2诱导的HUVEC细胞损伤产生的MDA含量有一定降低作用.结论 养阴化瘀剔络方对于H2O2诱导的HUVEC细胞损伤有明显的保护作用,对正常HUVEC增殖无影响.
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氨甲环酸对体外人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用
目的 研究氨甲环酸(tranexamic acid,TXA)对H2O2诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)损伤的保护作用及给药时机选择.方法 体外培养HUVECs,加入100μmol/L的H2 O2作用12h,在H2 O2作用开始后30min和60min以及H2O2作用结束前1h和2h这4个时间点加入TXA(150μmol/L);Hoechst 33258染色法观察HUVECs形态;Western blot法检测细胞内细胞间黏附分子(intercellular cell adhesion molecule,ICAM)的表达;酶联免疫吸附双抗体夹心法(ELISA)检测细胞上清液多配体聚糖、tPA和PAI-1含量.结果 HUVECs经H2O2作用后,可显著诱导细胞凋亡,上调ICAM、多配体聚糖和tPA的表达,同时抑制PAI-1的表达;TXA在H2 O2作用60min内给药可抑制H2 O2对HUVECs的凋亡诱导作用,同时下调ICAM、多配体聚糖和tPA的表达,并上调PAI-1的表达,TXA在60min后给药无上述保护作用.结论 早期TXA给药对H2 O2诱导HUVECs损伤有明显抗纤维蛋白溶解和保护作用,从而表明临床应用TXA需早期给药.
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氧糖剥夺对人脐静脉内皮细胞通透性的影响
目的:建立体外氧糖剥夺模型模拟脑缺血缺氧损伤,探讨氧糖剥夺对人脐静脉内皮细胞(HUVECS)屏障功能的影响.方法:细胞培养至完全融合后换成无糖培养基置于低氧手套箱(0.3％O2)分别处理0.5h、1h、2h和4h后,利用CCk-8法检测细胞存活,利用跨内皮细胞电阻(trans-endothelial electrical resistant,TEER)方法检测HU-VECs细胞通透性的变化,以及Western blot检测紧密连接相关蛋白的表达.结果:氧糖剥夺处理0.5h、1h、2h和4h后,HUVECs细胞存活率逐渐下降,TEER值逐渐降低,紧密连接蛋白Occludin、VE-cadherin的表达明显降低.结论:氧糖剥夺破坏内皮细胞间的紧密连接功能,增加HUVECs细胞的通透性,导致细胞的存活率明显降低.
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丹参酚酸B调节 miR-210保护HUVEC过氧化损伤机制研究
目的:研究丹参酚酸调节miR-210对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)过氧损伤的保护作用机制.方法:采用H-DMEM完全培养基培养HUVEC细胞株,3次传代后分为对照组(正常培养)、 模型组(过氧化损伤)、中药组(丹参酚酸B干预)和沉默组(miR-210基因沉默+中药干预组).采用过氧化氢诱导细胞过氧化损伤模型,Lipofectamine?RNAiMAX脂质体法转染miR-210-3P inhibitor诱导miR-210基因沉默,丹参酚酸B给药浓度是10-5 mol/L.qRT-PCR法检测细胞miR-210、 血管内皮生长因子(VEGF)的表达水平,荧光标记免疫组化法检测CD31分子的表达,ELISA法检测细胞液中内皮型一氧化氮合酶(eNOs)和内皮素-1(ET-1)的含量.结果:与对照组比较,模型组miR-210、VEGF和CD31分子的表达水平显著降低,细胞液中eNOs含量降低、ET-1的含量明显升高(P<0.01或P<0.001).与模型组比较,中药组miR-210、VEGF和CD31分子的表达水平均显著升高,细胞液中eNOs含量升高、ET-1的含量明显降低(P<0.001).与中药组比较,沉默组miR-210、VEGF和CD31分子的表达水平均显著降低,但细胞液中eNOs和ET-1的含量差异无显著性(P>0.001).结论:丹参酚酸B能维持过氧化损伤HUVEC的血管新生功能和内皮收缩稳态,其促进血管新生作用被miR-210基因沉默阻断,维持收缩功能不被miR-210基因沉默所阻断,说明丹参酚酸B具有多靶点保护作用,miR-210是其作用靶点之一.
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MTT法筛选赶山鞭抑制血管生成的活性成分
目的:利用MTT法筛选赶山鞭抑制血管生成的活性成分.方法:采用MTT实验法检测quercetin(1),rutin(2),hyperi n(3),quercertin-3-O-α-L-arabinofurano side(4),quercertin-3-O-β-D-glucoside(5)五种赶山鞭单体化合物对HUVEC细胞的抑制血管生成活性;化合物浓度梯度为0.1、1、5、10、50、100μg/mL.结果:在此浓度梯度范围内,化合物1、2均抑制HUVEC生长,化合物1浓度<1μg/mL时不显著,≥1μg/mL时极显著(P<0.01),化合物2均极显著(P<0.01).化合物3、4浓度≤5μg/mL时抑制生长,≤0.1μg/mL时有极显著生长抑制效应(P<0.01),>5μg/mL时有极显著的生长促进效应(P<0.01).化合物5浓度<1μg/mL时抑制生长,≤0.1μg/mL时有显著生长抑制效应(P<0.05),>5μg/mL时促进生长,>10μg/mL有显著的生长促进效应(P<0.05),>100μg/mL有极显著的生长促进效应(P<0.01).结论:化合物1、2有抑制HUVEC生长的作用;化合物3、4、5低浓度(<5μg/mL)抑制HUVEC生长,高浓度(>5μg/mL)促进HUVEC生长.
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清热消积方对SPC-A-1肺癌细胞及其诱导的HUVEC内皮细胞表达VEGF、bFGF的影响
目的:研究清热消积方对SPC-A-1肺癌细胞及其诱导的HUVEC内皮细胞表达VEGF、bFGF的影响,并探讨其抗肿瘤血管生成的部分作用机制.方法:以不同浓度的清热消积方药液干预SPC-A-1肺癌细胞及其诱导的HUVEC内皮细胞后,采用双抗体夹心ELISA法分别检测两种细胞上清液中VEGF、bFGF的表达量.结果:经清热消积方药液干预后,该两种细胞的VEGF、bFGF表达量均出现不同程度的下降,且与药物浓度呈负相关,具有良好的浓度依赖性(P＜0.05).结论:清热消积方抑制SPC-A-1肺癌细胞及其诱导的血管内皮细胞表达VEGF、bFGF,可能是其抗肿瘤血管生成的作用机制之一.
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小檗碱抗肿瘤新生血管形成作用机制的研究
目的:研究小檗碱对bFGF活化人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响,探讨其对肿瘤新生血管形成作用的机制.方法:MTT法检测小檗碱对bFGF活化HUVEC的增殖作用;流式细胞仪检测用药后细胞周期的变化;激光共聚焦扫描显微镜下观察药物对细胞形态、细胞内钙的影响;流式细胞仪检测小檗碱对细胞凋亡的作用.结果:小檗碱能明显抑制bFGF活化的HUVEC增殖,且存在剂量依赖关系;使细胞在G0-G1期的比例明显增多;使细胞核浓缩、甚至裂解成碎块,同时使细胞内钙增多;并诱导活化HUVEC发生细胞凋亡.结论:小檗碱可能通过将bFGF活化的HUVEC细胞周期阻滞在G0-G1期,抑制活化HUVEC的增殖;诱导活化HUVEC细胞发生凋亡等机制,阻止新生血管形成,发挥其抗肿瘤作用.
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养阴剔络方对人脐静脉内皮细胞炎症机制的作用
目的 研究养阴剔络方对脂多糖(LPS)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)炎症机制的作用.方法 100 μg/mL的LPS诱导HUVEC发炎,用2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐(cck-8)比色法检测细胞存活数量,用elisa法测IL-6、IL-8、TNF-a的含量.结果 养阴剔络方对LPS诱导的HUVEC炎症有明显的抑制作用,对LPS诱导的HUVEC细胞产生的IL-6、IL-8、TNF-a等炎症因子有明显的降低作用.结论 养阴剔络方对LPS诱导的细胞炎症机制有很好的保护作用.
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血管紧张素-Ⅱ(Ang-Ⅱ)处理后的人脐带MSCs上清液对HUVEC凋亡、增殖的影响
目的:体外观察100 ng/mL血管紧张素-Ⅱ (Angiotensin-Ⅱ,Ang-Ⅱ)处理后的人脐带间充质干细胞(human umbilical cord MSCs,hUCMSCs)上清液对损伤的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelia cells,HUVEC)增殖、凋亡的影响.方法:CCK8法检测HUVEC增殖情况;倒置显微镜下观察HUVEC形态;吖啶橙/溴化乙锭染色法(acridineorange/ethidium bromide,AO-EB)、Hoechst检测HUVEC凋亡情况.结果:CCK8实验结果显示,加入100 ng/mL Ang-Ⅱ处理后的hUCMSCs上清液组HUVEC增殖速度在各时间点显著快于其他两组.倒置显微镜下观察细胞的形态:加入100 ng/mL Ang-Ⅱ处理后的hUCMSCs上清液组HUVEC的形态佳且凋亡数少.用各组细胞上清液对HUVEC培养24 h、48 h、72 h后,AO-EB、Hoechst染色结果显示:加入100 ng/mL Ang-Ⅱ处理后的hUCMSCs上清液组,在各个时间点HUVEC出现凋亡细胞或死亡细胞的数少.结论:100 ng/mL Ang-Ⅱ预处理后的hUCMSCs上清液可以促进HUVEC增殖、抑制HUVEC凋亡.
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Rac1/MAPK/ERK通路介导脂多糖LPS诱导的人内皮细胞单层通透性增高机制研究
目的:探讨LPS诱导的人内皮细胞单层通透性改变的分子机制.方法:应用逆转录病毒为载体,感染并筛选稳定表达持续活化型Rac1和主导抑制型Rac1的人HUVEC细胞,应用LPS刺激并观察细胞骨架蛋白F-actin和HUVEC单层通透性的改变.同时应用Western blot方法检测LPS刺激前后细胞中MAPK/ERK信号通路的改变及加入PD98059阻断ERK表达后,细胞内F-actin的改变情况 .结果:与正常HUVEC相比较,LPS刺激后,感染活化型Rac1和主导抑制型Rac1的HUVEC中F-actin重构并形成大量应力纤维,细胞单层通透性显著增加.而抑制型Rac1感染后的HUVEC中F-actin无重构现象,同时细胞单层通透性无明显增加.LPS刺激前后,各组细胞中ERK1/2总蛋白均无明显改变.LPS刺激后,感染活化型Rac1的HUVEC中,p-ERK增加.经PD98059阻断后,细胞内p-ERK表达下降同时伴随F-actin解聚发生.结论:LPS诱导的内皮细胞通透性增加是经过Racl-MAPK/ERK通路介导的.
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截短型rhtBIGH3-(RGD)2蛋白通过上调miR-126表达抑制人脐静脉内皮细胞的生物活性
目的:探讨miR-126在截短型rhtBIGH3-(RGD)2蛋白抑制HUVEC细胞生物学活性中的作用.方法:体外培养VEGF孵化的人脐静脉内皮细胞(VEGF-HUVEC),分别加入rhtBIGH3-(RGD)2蛋白终浓度为0和100μg/mL,作用24、48、72 h条件下,分别检测Caspase-3活性和miR-126表达水平.在rhtBIGH3-(RGD)2蛋白终浓度为0和100 μg/mL时,分别加入miR-126 mimic和miR-126 inhibitor,作用VEGF-HUVEC 48 h后,Real-time PCR检测miR-126表达水平,通过检测Caspase-3活性来检测细胞凋亡情况.结果:在VEGF-HUVEC中,当rhtBIGH3-(RGD)2蛋白终浓度为100 μg/mL条件下,Caspase-3水平升高,miR-126表达水平升高,在48 h下达到高峰.在VEGF-HUVEC中,当rhtBIGH3-(RGD)2蛋白终浓度分别为100 μg/mL条件下,加入miR-126mimic后,miR-126表达升高,Caspase-3水平升高;加入miR-126 inhibitor后,48h后检测miR-126表达下降,Caspase-3水平也下降.结论:截短型rhtBIGH3-(RGD)2蛋白通过上调miR-126表达从而促进细胞凋亡、抑制HUVEC生物活性,从而抑制角膜新生血管的发生
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溶血卵磷脂及其受体GPR4对HUVEC的增殖及caspase 3前体表达的影响
目的:研究溶血卵磷脂(lysophosphatidylcholine,LPC)及其受体GPR4(G protein-coupled receptor4,GPR4)相互作用后对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)增殖的影响及其凋亡的诱导.方法:采用脂质体2000将装有GPR4受体基因的pEFneo真核表达栽体转染HUVEC,并通过G418(800μ g/ml)筛选获得GPR4基因稳定表达细胞株;RT-PCR法检测转染前后GPR4受体的mRNA水平表达情况;MTT法检测细胞的生长活力;AO染色法观察LPC对HUVEC造成损伤后形态的改变;Western blot法检测LPC与其受体相互作用后对caspase-3前体表达的影响.结果:成功获得了GPR4基因稳定表达细胞株;随着LPC浓度的增加(0.5,1,2,4,8μ mol/1),抑制率分别增加了3.1%,4.4%,9.3%,17.O%,25.7%;但caspase-3前体的表达却随着浓度的增加先增加后减少.结论:LPC及其受体GPR4相互作用后可抑制HUVEC的增殖,并对HUVEC造成损伤进而诱导凋亡,使caspase-3前体的表达先增加后减少.
关键词： 溶血卵磷脂 GPR4 caspase-3前体 HUVEC -
麦冬皂苷D对过氧化氢造模的HUVEC保护作用机制研究
目的:研究麦冬皂苷D时HUVEC凋亡相关分子的影响,探讨其作用机制.方法:用H2O2构建凋亡模型.运用MTT及流式细胞仪检测细胞活性,激光共聚焦方法测定粒体膜电位和钙离子浓度,,结果:麦冬皂苷D可以稳定线粒体膜电位,减少钙离子内流,增加细胞的活力.结论:麦冬皂苷D对HUVEC有一定的保护作用.
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一种靶向肿瘤新生血管的新型长循环纳米脂质体的制备
目的:构建一种靶向肿瘤新生血管的长循环纳米脂质体,以期成为一种新型抗肿瘤药物载体.方法:采用9-芴甲氧羰基(fluorenylmethyloxycarbonyl, FMOC)固相合成法合成丙氨酸-脯氨酸-精氨酸-脯氨酸-甘氨酸(alanyl-prolyl-arginyl-prolyl-glycine, APRPG)肽-赖氨酸-甘氨酸-甘氨酸(lysine -glycine-glycine, KGG)臂-棕榈酸(palmitate, Pal)复合物;应用薄膜超声分散法制备靶向血管的长循环纳米脂质体(neovessel targeted-polyethylene glycol-liposomes, T-PEG-LP)和普通长循环纳米脂质体(polyethylene glycol-liposomes, PEG-LP),采用激光散射粒度分析仪检测其粒径分布,并在透射电子显微镜下观察其形貌特征;应用薄膜超声分散法制备罗丹明标记的血管靶向荧光长循环纳米脂质体(neovessel targeted-fluorescent-polyethylene glycol-liposomes, T-F-PEG-LP)和普通荧光长循环纳米脂质体(fluorescent-polyethylene glycol-liposomes, F-PEG-LP),通过荧光分光光度计和FCM检测其与人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)和人肺癌A549细胞的特异性结合力;同时,将该载体包封抗肿瘤药物紫杉醇(paclitaxel, PTX)制备紫杉醇长循环纳米脂质体(polyethylene glycol-paclitaxel liposomes, PEG-PTX-LP)和血管靶向的紫杉醇长循环纳米脂质体(neovessel targeted-polyethylene glycol-paclitaxel-liposomes, T-PEG-PTX-LP),应用荧光分光光度计和FCM检测HUVEC和A549细胞对其的摄取能力.结果:透射电子显微镜下观察到T-PEG-LP和PEG-LP均呈规则的圆形或略呈椭圆形,激光散射粒度分析仪检测其平均粒径＜100 nm;T-F-PEG-LP与HUVEC和A549细胞的结合能力均优于F-PEG-LP(P<0.05),2种细胞对T-PTG-PTX-LP的摄取量均高于市售紫杉醇溶液(Taxol)和PEG-PTX-LP(P<0.05).结论:构建的靶向血管的长循环纳米脂质体有望成为一种新型有效的肿瘤靶向药物载体.
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人三维体外血管模型的构建
目的利用HUVEC建立人体外三维血管模型.方法原代培养HUVEC,利用I型胶原蛋白建立三维系统,在上面培养HUVEC,随着胶原蛋白的降解,人体外三维血管模型逐渐形成,HE染色三维血管样结构.结果 HUVEC成功培养,人体外三维血管模型顺利构建.结论利用I型胶原蛋白建立的三维系统,能成功构建人体外三维血管模型.
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麦冬有效部位对HUVEC凝血与纤溶活性物质的影响
目的 探讨麦冬正丁醇提取部位、薯蓣皂苷元及豆甾醇对培养HUVEC抗凝、纤溶及抗自由基损伤等作用.方法 经H2O2和麦冬正丁醇提取部位、薯蓣皂苷元及豆甾醇作用于HUVEC后,取上清培养液测定tPA、PAI-1、TM的含量.结果 麦冬正丁醇提取部位、薯蓣皂苷元及豆甾醇可缓解H2O2所致tPA、PAI-1的水平降低.结论 麦冬有效部位可减轻自由基对HUVEC的损伤,在一定程度上通过对tPA、PAI-1含量的调节,维持内皮细胞正常生理功能,从而能有效防治血瘀证.
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补心软脉颗粒含药血清对 AngⅡ诱导的 HUVEC 细胞抗氧化作用
目的：观察补心软脉颗粒含药血清对 AngⅡ诱导 HUVEC 细胞所致氧化损伤的相关指标 SOD、NADPH、MDA、p40phox、p47phox、p67phox的影响。方法大鼠被随机分为正常组、缬沙坦组、补心软脉颗粒组，每组10只，灌胃6周，取动脉血制备药物血清。建立10－6 mol／L AngⅡ诱导的 HUVEC 细胞凋亡损伤模型，并予各药物血清干预，采用黄嘌呤氧化酶法检测细胞上清液中总 SOD 活力，ELISA 法检测 NADPH 氧化酶，TBA 法检测 MDA 含量，Western blot 法分别检测细胞膜与细胞质p40phox、p47phox、p67phox蛋白表达。结果AngⅡ诱导 HUVEC 细胞损伤，模型组 SOD 活力下降，NADPH、MDA 升高，p40phox、p47phox、p67phox向细胞膜转移，出现氧化损伤；补心软脉颗粒组 SOD 活力上升，MDA、NADPH 下降，抑制 p40phox、p47 phox、p67phox向细胞膜转移，减轻氧化损伤。结论补心软脉含药血清对 AngⅡ诱导体外培养的 HUVEC 损伤有抑制氧化作用，防止动脉硬化。
