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增液汤中麦冬皂苷D的纯化制备和HPLC含量测定研究
目的 建立增液汤提取物中麦冬皂苷D的提取纯化制备方法,并建立增液汤中麦冬皂苷D含量的HPLC-UV测定方法.方法 采用大孔树脂柱和硅胶柱色谱纯化制备麦冬皂苷D;采用Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6×250 mm,5 μm),柱温30 ℃,流动相为有机相(乙腈-甲醇3:1)-水(56:44),流速为1.0 ml/min,检测波长为203 nm.结果 制得的麦冬皂苷D纯度大于98％,可用于含量测定研究;麦冬皂苷D在进样量0.364～5.46 μg范围内与峰面积呈现良好的线性关系,其相关系数为0.999 9,平均加样回收率为98.38％,RSD值为1.28％.应用所建立的方法对3批增液汤提取物及麦冬药材中的麦冬皂苷D进行了含量测定.结论 此方法准确可靠,可为增液汤提取物的质量控制提供参考.
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麦冬皂苷D通过上调CYP2J2/EETs抗AngⅡ诱导的内皮细胞凋亡
探讨麦冬皂苷D(OP-D)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导内皮细胞凋亡的影响及其机制,为中药的安全性及有效性提供参考依据.MTT法检测AngⅡ对细胞存活率的影响;检测OP-D对AngⅡ诱导的细胞总蛋白含量的影响;酶标仪测定OP-D对AngⅡ诱导的细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放率的影响;Western blot和RT-PCR法检测OP-D及外源性1 1,12-EET对AngⅡ诱导的细胞中JNK及其下游靶分子c-Jun的磷酸化水平表达;流式法检测细胞凋亡率;后进一步借助CYP450酶抑制剂PPOH及JNK特异性抑制剂SP600125,探究OP-D保护内皮细胞的可能内在机制.结果显示,不同剂量的AngⅡ(1×10-8～1×10-6 mol·L-1)对细胞存活率没有显著的影响,1×10-6 mol· L-1的AngⅡ处理24h可诱导细胞总蛋白含量的增加(P＜0.05,P＜0.01),刺激LDH释放率的增多(P＜0.001),JNK和c-Jun的磷酸化水平明显增加(P ＜0.01,P＜0.001),caspase-3的蛋白表达上调(P＜0.01),细胞凋亡率增高(P＜0.001).提前给予SP600125显著抑制了JNK和c-Jun的磷酸化水平.OP-D预处理后,能明显降低AngⅡ诱导的细胞总蛋白含量(P＜0.01)及LDH的释放(P＜0.01,P＜0.01),减少JNK和c-Jun的磷酸化水平,降低caspase-3的表达及细胞凋亡率,提前给予PPOH后,OP-D保护效应被抑制.1 1,12-EET预处理降低JNK和c-Jun的磷酸化水平(P＜0.05).结果表明AngⅡ通过JNK/c-Jun途径诱导细胞凋亡;OP-D通过诱导CYP2J2表达及增加11,12-EET含量抗AngⅡ激活JNK/c-Jun通路所诱导的细胞损伤及凋亡.
关键词： 麦冬皂苷D CYP2J2/EETs 血管紧张素Ⅱ JNK/c-Jun 细胞凋亡 -
麦冬皂苷D通过减轻内质网应激对阿霉素所致心肌损伤产生保护作用
研究麦冬皂苷D (ophiopogonin D,OP-D)对阿霉素(doxorubicin,DOX)所致心肌损伤的保护作用.体外培养H9c2细胞,采用MTT法检测细胞毒性,MitoTracker探针法测定细胞内线粒体中活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量,实时定量PCR和Western blotting分别检测ATF6α,GRP78和CHOP的mRNA及其蛋白表达.结果表明,DOX可诱导H9c2细胞内质网应激相关蛋白的表达量显著上升,并导致细胞活性氧ROS含量增加,细胞活力下降.而OP-D预处理可部分逆转DOX引起的上述变化,siRNA干扰促凋亡转录因子CHOP或抗氧化剂NAC预处理也有类似效应.此外,OP-D可明显减轻DOX所致小鼠心脏超微结构异常.这些结果说明,OP-D通过降低DOX诱导的ROS累积,进而缓解内质网应激而对心肌产生保护作用.
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川麦冬中麦冬皂苷D对照品的制备
目的:建立从麦冬中制备麦冬皂苷D对照品的方法.方法:用萃取、硅胶柱层析、凝胶柱层析、重结晶等方法对麦冬乙醇提取物进行分离纯化,通过MS、IR、<'1>H-NMR、<'13>C-NMR进行结构鉴定.结果:薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC-ELSD)检测分析,麦冬皂苷D的纯度为99%以上.结论:本方法简便,产品纯度高,该对照品可作为川麦冬及其制剂质量的指标成分.
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麦贞花颗粒有效成分的含量测定
目的 建立麦贞花颗粒中麦冬皂苷D和特女贞苷的含量测定方法.方法 采用HPLC法测定制剂中麦冬皂苷D和特女贞苷含量.结果 麦冬皂苷D在进样量1.234 ～12.336 μg内呈良好的线性关系,r = 0.999 6,平均回收率为96.92%,RSD为2.98%;特女贞苷在质量浓度40.64～325.12 μg/mL范围内呈良好的线性关系,r = 0.999 5,平均回收率为98.58%,RSD为2.74%.结论 所建立的含量测定方法 可靠,操作简便,重现性良好,可用于该制剂的质量控制.
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基于化学组分特征评价不同干燥方法对麦冬品质的影响
目的 通过化学组分测定和特征图谱分析,评价不同干燥方式对麦冬品质的影响.方法 总皂苷、总黄酮和总多糖量采用紫外分光光度法进行测定,麦冬皂苷D和麦冬甲基黄烷酮A的量采用HPLC法进行测定;特征图谱采用HPLC法建立.结果 不同干燥方法对麦冬化学组分量的影响差异显著,变异系数在6.9％～20.8％,其中,阴干、晒干、冷藏干燥和晒半干后烘干对麦冬化学组分破坏程度均较小,远红外干燥和微波干燥对麦冬化学组分破坏大;麦冬样品有18个HPLC特征峰,聚类分析可将14种干燥方法分为3类,聚为一类的干燥方法干燥条件相近.结论 通过化学组分量变化和HPLC图谱特征能够有效地反映干燥方法的差异,可作为麦冬产地干燥方法筛选的技术指标,在麦冬产地加工过程中建议晒干和空气源热泵烘干机烘干相结合应用.
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川产麦冬及其须根组织学与麦冬皂苷量的对比研究
目的 考察四川麦冬基地麦冬须根的产量,对麦冬及其须根进行显微特征观察比较,并对块根和须根中麦冬皂苷质量分数进行对比.方法 统计麦冬植株块根与须根质量比值,应用显微镜及显微摄影系统观察须根的表皮细胞、皮层、中柱以及髓部的显微特征;采用UV法对麦冬块根及其须根的提取物进行了总皂苷测定,HPLC-ELSD法测定麦冬块根及须根中麦冬皂苷D质量分数.结果 川麦冬植株麦冬须根与块根质量平均比值为0.68,两者在表皮细胞形状、皮层与中柱排列及比例有一定差异;麦冬与须根平均总皂苷量为1.204％和2.847％;麦冬皂苷D在0.416～10.40 μg内与峰面积呈良好线性关系(r=0.999 3),平均回收率为99.12％,RSD为1.39％.麦冬块根与须根平均麦冬皂苷D质量分数分别为0.035％和0.041％.结论 川产麦冬须根资源量大,与麦冬组织学差异主要在于表皮细胞形状、皮层与中柱排列及比例,而粉末特征无显著差异;川产麦冬须根总皂苷质量分数明显高于麦冬,而麦冬皂苷D质量分数与麦冬块根无显著性差异.
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HPLC-MS/MS法同时测定参麦注射液7种主要有效成分
目的 建立HPLC-MS/MS方法同时测定参麦注射液中7种主要有效成分(人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、麦冬皂苷D、麦冬皂苷D'、甲基麦冬二氢黄酮A和甲基麦冬二氢黄酮B).方法 采用多反应监测(MRM)模式同时监测参麦注射液中5种皂苷类和2种黄酮类成分.色谱柱为Phenomenex Luna C18柱,流动相为乙腈-0.03％乙酸水溶液,梯度洗脱,分析时间15 min.采用所建立的方法对6批参麦注射液进行了测定.结果 所测7种有效成分在测定质量浓度范围内线性关系良好,相关系数(r)均大于0.996 3,线性关系分别为人参皂苷Rg1 Y=15.6 X+ 1.63×104;人参皂苷Re Y=14X+5.36×103;人参皂苷Rb1Y=2.46X+4.74×103;麦冬皂苷DY=11 X+9.73×103;麦冬皂苷D'Y=5.56X+1.64×103;甲基麦冬二氢黄酮A Y=3.58×103X+2.33×104;甲基麦冬二氢黄酮B Y=4.87×103X+2.72×104.实验精密度、重复性和稳定性良好;平均加样回收率为95.3％～104.3％.结论 本法简便、快速、灵敏度高、专属性好,可用于参麦注射液中人参皂苷Rg1、Re、Rb1及麦冬皂苷D、麦冬皂苷D'、甲基麦冬二氢黄酮A和甲基麦冬二氢黄酮B的定量测定.除人参皂苷外,其他4种成分均为参麦注射液中首次测定.
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麦冬总皂苷提取工艺的研究
目的对麦冬总皂苷的提取工艺进行优化.方法以麦冬皂苷D的含量为指标,采用正交试验法对麦冬提取的条件进行考察.结果通过试验找出了麦冬提取的优化条件.麦冬用5～10目药材,加10倍量80%乙醇,热回流提取3次,每次1 h.结论此优选条件可充分提取麦冬总皂苷.
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UPLC-MS/MS法同时测定玄麦甘桔颗粒中8种有效成分
目的 建立同时测定玄麦甘桔颗粒(玄参、麦冬、甘草、桔梗)中8种有效成分(哈巴苷、甘草苷、哈巴俄苷、桔梗皂苷D、甘草酸铵、麦冬皂苷D、麦冬黄烷酮A和麦冬黄烷酮B)的方法,并对市售不同厂家生产玄麦柑桔颗粒中上述8种有效成分进行定量分析.方法 采用超高效液色谱相串联质谱(UPLC-MS/MS)法,Phenomenex Kenetix C18柱(50 mm×2.1mm,5μm),流动相为乙腈和含0.1％甲酸的水溶液梯度洗脱,体积流量0.3 mL/min;质谱采用正负离子同时监测,多反应监测模式扫描,进样量5μL.结果 玄麦柑桔颗粒中哈巴苷、甘草苷、哈巴俄苷、桔梗皂苷D、甘草酸铵、麦冬皂苷D、麦冬黄烷酮A和麦冬黄烷酮B分别在9～2 250、8～2 000、3.4～850、96～24 000、12.4～3 100、3.6～1 900、1.7～425、1.5～375 ng/mL内线性关系良好,加样回收率为97.2％～102.8％,RSD小于2.7％.8种成分在8批样品中的质量分数依次为哈巴苷32.8～107.6 μg/g,甘草苷54.8～178.0 μg/g,哈巴俄苷14.6～70.7 μg/g,桔梗皂苷D 31.2～280.0 μg/g,甘草酸铵106.4～287.9μg/g,麦冬皂苷D 0.1～0.6 μg/g,麦冬黄烷酮A 0.01～0.07 μg/g和麦冬黄烷酮B 0.03～0.17 μg/g.结论 建立的方法简单、高效、准确可靠,可用于同时测定玄麦甘桔颗粒中8种成分,为该制剂建立更全面的质量控制方法提供依据.
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HPLC-ELSD法同时测定益肺清化颗粒中的黄芪甲苷、桔梗皂苷D和麦冬皂苷D的含量
目的:建立益肺清化颗粒中黄芪甲苷、桔梗皂苷D、麦冬皂苷D的定量测定方法.方法:采用高效液相色谱-蒸发光散射检测(HPLC-ELSD)法,色谱柱为SB-C 18(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈-水(20:80);体积流量1.0 ml/min;柱温30℃;ELSD漂移管温度95℃,气体流量2.5 L/min.结果:黄芪甲苷、桔梗皂苷D、麦冬皂苷D的线性范围分别为1.5～30μg/ml(r=0.9992)、1.0～20μg/ml(r=0.9993)和0.5～10μg/ml(r=0.9992),回收率分别为99.59％(RSD为1.39％,n=9)、99.88％(RSD为0.68％,n=9)和100.16％(RSD为2.39％,n=9).结论:该方法测定简便、快速、重复性好,可作为益肺清化颗粒的质量控制方法.
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HPLC法测定麦冬中麦冬皂苷D含量的方法研究
目的 探寻麦冬中指标性成分,建立指标性成分的含量测定方法.方法 采用高效液相色谱法测定麦冬皂苷D的含量.色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶,以乙腈-水(48∶52)溶液为流动相,检测波长为201 nm,柱温25℃.结果 麦冬皂苷D进样量在0.06400~0.6400 μg 线性关系良好(r=0.9999);平均加样回收率为103.4%(RSD为1.4%).结论 该方法准确、可靠,可用于麦冬药材及相关产品中麦冬皂苷D的含量测定,为完善麦冬药材质量标准提供参考.
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麦冬皂苷D对细菌脂多糖所致小肠上皮细胞损伤的保护作用
目的 研究麦冬皂苷D(ophiopogonin D,OPD)对小肠上皮细胞损伤的保护作用及其作用机制.方法 体外培养大鼠小肠上皮细胞IEC-6,用噻唑兰(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)法检测麦冬皂苷D对大鼠小肠上皮细胞IEC-6活性的影响;建立细菌脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)损伤大鼠小肠上皮细胞IEC-6模型,检测麦冬皂苷D对上皮细胞的凋亡作用以及紧密连接屏障功能作用的影响.结果 LPS可显著降低IEC-6细胞的存活率;LPS显著促进炎症指标核转录因子NF-κB、凋亡相关蛋白caspase-9以及可导致紧密连接功能紊乱的肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)的表达;LPS抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达.麦冬皂苷D可逆转LPS造成的功能紊乱,包括促进Bcl-2的表达,抑制caspase-3及MLCK的表达,一定程度上恢复黏膜屏障功能.结论 麦冬皂苷D可缓解LPS造成的肠上皮细胞损伤,该作用与抗炎、抑制细胞凋亡及降低MLCK表达相关;麦冬皂苷D可能成为炎症性肠病临床治疗的一个潜在的候选药物.
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麦冬皂苷D对过氧化氢造模的HUVEC保护作用机制研究
目的:研究麦冬皂苷D时HUVEC凋亡相关分子的影响,探讨其作用机制.方法:用H2O2构建凋亡模型.运用MTT及流式细胞仪检测细胞活性,激光共聚焦方法测定粒体膜电位和钙离子浓度,,结果:麦冬皂苷D可以稳定线粒体膜电位,减少钙离子内流,增加细胞的活力.结论:麦冬皂苷D对HUVEC有一定的保护作用.
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UPLC-MS/MS法检测妇康宁片中掺加的山麦冬
目的 建立超高效液相色谱-串联电喷雾三重四级杆质谱(UPLC-MS/MS)法检测妇康宁片中掺加的山麦冬(湖北麦冬和短葶山麦冬).方法 该药物甲醇提取物的分析采用Zorbax Eclipse Pluse C18色谱柱(100 mm ×2.1 mm,1.8 μm);流动相乙腈-0.1％甲酸,等度洗脱;体积流量0.3 mL/min;柱温35℃,以测定麦冬皂苷D、山麦冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C的含有量.结果 35批样品中有11批检测到湖北麦冬,7批检测到短葶山麦冬,3批同时检出两者.结论 该方法选择性强,灵敏度高,可用于筛查妇康宁片中的麦冬用药品种.
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HPLC-ELSD法测定生脉饮中麦冬皂苷D
目的 建立生脉饮中麦冬皂苷D的定量测定方法.方法 样品经水饱和正丁醇萃取后,再经ODS柱进行固相萃取,Ultimate XB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相为乙腈-水(52∶48),体积流量2.5L/min,漂移管温度95℃,ELSD检测器.结果 麦冬皂苷D在5～ 80 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好(r=0.999 7),平均回收率为98.3％,RSD为0.6％.结论 方法精密度、稳定性和重复性良好,可作为生脉饮的质量控制的进一步补充.
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复方附子口服液质量标准的研究
目的 建立复方附子口服液(黄芪、盐附子、党参和麦冬)的质量标准.方法 TLC法定性鉴别黄芪、盐附子、党参和麦冬,HPLC-CAD法测定黄芪甲苷和麦冬皂苷D的含有量.结果 在TLC色谱图中,4种药材的斑点清晰,分离度好,阴性无干扰.黄芪甲苷在0.670～6.70 μg的线性范围内线性关系良好(r=0.999 8),加样回收率为97.56％(RSD=1.6％);麦冬皂苷D在0.138 8～1.388 μg的线性范围内线性关系良好(r=0.999 7),加样回收率为96.79％ (RSD=1.9％).结论 该方法准确可靠,专属性好,可用于复方附子口服液的质量控制.
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麦冬皂苷D通过降低自噬抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥大
目的麦冬皂苷D是否抑制血管紧张素Ⅱ( AngⅡ)所引起的心肌肥大及其可能机制。方法体外培养大鼠心肌细胞系H9c2,MTS法检测麦冬皂苷 D的细胞毒性；其次将1μmol·L-1的AngⅡ作用于H9c2细胞24h后引起心肌肥大,用不同浓度的麦冬皂苷D( ophiopogonin D,OPD)共处理, BCA法检测总蛋白含量；实时荧光定量PCR技术检测标志性肥大基因BNP和β-MHC的mRNA表达；Western blot法检测自噬蛋白LC3B的表达,同时运用高内涵筛选技术检测心肌细胞自噬蛋白 LC3B 的表达以及线粒体膜电位的改变。结果细胞活力的检测结果显示,与对照组相比,AngⅡ不同浓度作用24 h后,对细胞活力无明显影响,而麦冬皂苷D的高浓度(50~100μmol·L-1)可明显抑制细胞的活性；AngⅡ作用于心肌细胞24h后,可引起心肌肥大,导致特异性肥大基因mRNA表达上调,并且明显增加细胞总蛋白含量；同时使心肌细胞自噬增强；线粒体膜电位降低,而麦冬皂苷D共处理能明显逆转上述指标。结论麦冬皂苷D对AngⅡ所诱导的心肌肥大有抑制作用。
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麦冬皂苷D预处理对PM2.5介导肺泡Ⅱ型上皮细胞炎性损伤的抑制作用及其机制
目的 观察麦冬皂苷D预处理对大气细颗粒物(PM2.5)介导肺泡Ⅱ型上皮细胞MLE-12炎性损伤的抑制作用并探讨其机制.方法 采用CCK-8法检测不同浓度麦冬皂苷D对MLE-12细胞活性的影响,结果显示麦冬皂苷D的安全用药范围为≤80μmol/L.取对数生长期的MLE-12细胞,随机分为空白对照组、PM2.5组及麦冬皂苷D组,麦冬皂苷D组分别加入浓度为10、20、40、80μmol/L的麦冬皂苷D预处理1 h,麦冬皂苷D组及PM2.5组中分别加入PM2.5混悬液(调整其终浓度为80μg/mL),作用24 h.空白对照组不作任何处理.采用ELISA法检测各组培养基上清炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α表达,Western blotting法检测细胞核及细胞质NF-κB p65蛋白相对表达量.结果 PM2.5组培养基上清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α表达均明显高于空白对照组(P均<0.01),加入80μmol/L麦冬皂苷D的麦冬皂苷D组培养基上清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α表达均低于PM2.5组(P均<0.01).加入不同浓度麦冬皂苷D的麦冬皂苷D组培养基上清IL-8、TNF-α表达均高于对照组,加入10、20、40μmol/L麦冬皂苷D的麦冬皂苷D组培养基上清IL-1β、IL-6表达均高于对照组(P<0.05或<0.01).PM2.5组细胞核NF-κB p65蛋白相对表达量高于对照组,细胞质NF-κB p65蛋白相对表达量低于对照组(P均<0.01).加入不同浓度麦冬皂苷D的麦冬皂苷D组细胞质NF-κB p65蛋白相对表达量均高于PM2.5组,加入20、40、80μmol/L麦冬皂苷D的麦冬皂苷D组细胞核NF-κB p65蛋白相对表达量均明显低于PM2.5组(P均<0.01).结论 麦冬皂苷D预处理可减轻PM2.5引起的MLE-12细胞炎性损伤,80μmol/L浓度时作用明显且细胞毒性较小;其机制可能与抑制NF-κB p65入核及其相关信号通路激活有关.
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正交设计法优化超声破壁提取麦冬皂苷D的工艺研究
目的 通过观察麦冬细胞超声破壁时间和利用紫外分光光度法检测超声提取麦冬皂苷D含量两种考察指标来比较筛选麦冬皂苷D的提取条件,优化超声提取工艺.方法 采用正交设计法,分别以麦冬细胞破壁时间和采用紫外分光光度法测定麦冬细胞破壁后皂苷D的含量为考察指标,考察乙醇浓度、温度、麦冬粒度和先期浸泡时间等因素对超声提取工艺的影响.通过显微镜观察,确定细胞破壁状况;通过对两种考察指标的实验结果 进行比较,优化提取方案.结果 利用紫外分光光度法测定麦冬皂苷D含量和通过观察麦冬细胞破壁所筛选的麦冬皂苷D佳提取工艺的结果 是一致的.在考察因素中,麦冬皂苷提取工艺影响程度为:粒度﹥乙醇浓度﹥先期浸泡时间﹥温度,超声提取佳条件为:温度45 ℃,80 目粒度,95% 乙醇,先期浸泡12 h.结论 通过超声方法 对中草药有效成分进行提取,其提取率与细胞破壁有关,利用正交实验分析紫外分光光度法检测麦冬皂苷D含量和考察麦冬细胞破碎的结果 是一致的,可通过观察麦冬细胞破壁结果 来优化提取工艺,简化操作.
