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高通量测序法研究不同pH的饮用水对SPF小鼠肠道微生物的影响
目的 研究不同pH饮用水对SPF小鼠肠道微生物多样性的影响.方法 21日龄SPF小鼠90只随机分成3组,每组30只,分别给予三类水,即酸化水(pH 3.0),中性水(pH 7.0)和碱性水(pH 9.0),并进行为期三个月的饲养.每组分别在饲养4周、8周、12周末各处死10只动物,取血清按SPF国标项目检测了细菌、病毒、寄生虫,取回盲部内容物,根据细菌16S rRNA的保守性设计引物,构建文库,进行高通量(Illumina)测序,获得10 G的数据,并对数据进行统计,聚类分析.结果 以pH 3.0处理的小鼠肠道微生物丰富度适中,稳定性高.结论 在规模化饲养条件下,选取pH 3.0饮用水小鼠能较长时间维持肠道微生物多样性,稳定性达到一个平台.本研究为长期稳定维持动物质量的生产实践提供了理论与技术支持,也是胃肠道宏基因组学技术在动物质量控制领域的一个具体应用.
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基于高通量测序技术的实验动物沙门氏菌检测方法的建立与评价
目的：建立基于高通量测序技术的实验动物沙门氏菌检测方法，应用于实验动物沙门氏菌的检测。方法提取小鼠粪便DNA样本，分别针对16S rDNA区域、23S rDNA区域、16S～23S rDNA IS、23S～5S rDNA IS、gyrB优选区域设计通用引物，对各个引物进行测试分析，优化扩增条件并建库，利用Illumina高通量测序技术检测区分42个样本中的沙门氏菌，评价该方法的特异性和稳定性。结果筛选发现沙门氏菌的菌种分类优选区域为gyrB基因，gyrB基因引物序列为FP5’-AACCACCGCAATCAGACCTT3’，FP5’-AGCCACGAAACCTTCACYA-3’。对引物进行优化，确定佳扩增条件及样品上样量并正式建库，通过高通量测序和序列分析能检测出42个样品中极微量的沙门氏菌，检测方法稳定，灵敏度高，检测限可达0～102的cfu。结论本实验利用高通量测序技术，建立了一套完整检测实验动物沙门氏菌的生物体系，能检测出实验动物体内极微量的沙门氏菌，检测方法稳定性好，灵敏度高，可沿用至其他种类病原微生物的检测。
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免疫组库测序在淋巴血液系统肿瘤诊断及疗效预测中的应用价值
免疫组库是指在任何指定的时间,个体循环系统中所有功能多样性的T细胞和B细胞的总和,其具体特征反映了机体免疫系统对抗各种抗原和预防疾病发生的能力.近年来,多重聚合酶链式反应和高通量测序技术的发展再次推动了研究者对免疫组库的深入研究.通过对免疫组库测序可以早期发现急性白血病缓解后的微小残留病灶,发现疾病特异的免疫球蛋白重链(IgH)重排;在新药的临床试验中,通过对免疫组库高通量测序可以发现预测药物疗效的免疫组库变化,如免疫组库多样性的增减、特异克隆型的出现或消失等;在造血干细胞移植后机体免疫重建过程中,临床医生也可以通过监测免疫组库而及时准确地了解患者免疫功能的恢复情况.本文就免疫组库测序在淋巴血液系统肿瘤的诊断及疗效预测中的应用情况进行综述.
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应用大规模平行基因组测序技术无创产前诊断胎儿常见染色体非整倍体异常
目的：探讨大规模平行基因组测序技术检测孕妇外周血浆中游离DNA，行胎儿染色体非整倍体的无创产前诊断，在检测胎儿染色体拷贝数的可行性。方法选择2012年2月至2013年7月在浙江省嘉兴市妇幼保健院产前诊断中心就诊，孕龄在13～33周，唐氏血清学筛查高风险、高龄孕妇或超声显示有异常的孕妇1264例，行无创产前诊断。抽取孕妇外周静脉血，提取血浆DNA，制备测序文库，采用Illumina HiSeq2000测序平台对孕妇外周血中游离胎儿DNA进行测序分析，对检测结果阳性者行介入性穿刺及胎儿染色体分析；对检测结果阴性者随访。结果1264例孕妇中，检测结果阳性者共20例。与介入性诊断染色体核型分析的结果相对照，13例21-三体检测阳性者，诊断符合率100％。6例18-三体检测阳性者中，有5例进行了羊膜腔穿刺（1例发生死胎除外），其中4例为18-三体，1例为正常核型，经检测为胎盘18-三体嵌合。13-三体1例，与核型分析相符。结论大规模平行基因组测序技术行无创产前诊断胎儿染色体非整倍体，可以作为血清学筛查高风险孕妇及其他有产前诊断指征孕妇的进一步筛选方法，可大大减少介入性产前诊断的数量。其敏感性、特异性与染色体核型分析技术具有较高的一致性。
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高通量检测技术在植入前胚胎遗传学诊断中的应用
基因芯片和深度测序是两大重要的高通量检测技术，给生物学和医学研究带来巨大的变化，在功能基因组、系统生物学、药物基因组的研究和遗传疾病诊断中得到了广泛的应用。随着全基因组扩增技术的不断改良，高通量技术在辅助生殖植入前遗传学诊断（PGD）中的应用有了巨大的进展。基于微阵列技术的胚胎全染色体组非整倍体筛查及结构异常的PGD已经开始临床应用，PGD /植入前遗传学筛查（PGS）后的临床妊娠率和胚胎植入率显著提高；基于单细胞高通量测序技术的染色体非整倍体及单基因病诊断的临床试验也已见报道，并有希望在不久的将来走向临床应用。
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miRNAs谱在潜伏结核感染者和健康人血浆中的差异表达
目的 探讨潜伏结核感染者(Latent tuberculosis infection,LTBI)和健康人血浆中miRNAs的差异表达,为后续LTBI诊断实验和机制研究的开展奠定基础.方法 确定研究对象并签署知情同意书,收集黄岛区结核病防治所LTBI和山东国际旅行卫生保健中心健康人的血浆.利用高通量测序技术进行miRNAs表达谱分析,比较LTBI和健康人血浆中miRNAs谱的差异表达情况;利用实时荧光定量PCR法证实差异表达的miRNAs靶标,并采用2-△△Ct法计算miRNAs的相对表达量来明确miRNAs表达上调和下调情况.结果 高通量测序miRNAs表达谱分析发现,与健康人相比,51种miRNAs差异表达,其中17种表达上调,34种表达下调.选取其中四种miRNAs,用实时荧光定量PCR证实发现hsa-miR-126-5p表达上调,而hsa-let-7a-5p、hsa-let-7f-5p和hsa-miR-150-5p表达下调.结论 本研究筛选出多种miRNAs差异表达,荧光定量PCR证实的hsa-let-7a-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-126-5p和hsa-miR-150-5p,可作为诊断LTBI的潜在标志物.
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高通量测序技术在病原生物学方面的研究进展
高通量测序技术(high-throughput sequencing),又称为下一代测序技术(next-generation sequencing,NGS),具有高准确性、高通量、高灵敏度和低运行成本等突出优势.随着高通量测序技术的迅猛发展,科研工作者开始越来越多地应用高通量测序技术来解决各种生物学问题.本文即对高通量测序技术在病原生物学的应用以及研究进展方面作以综述.
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混合测序技术在高通量测序中的应用
介绍了高通量测序在面向大样本时所面临的问题,分析了高通量测序技术的原理和特点及其在解决大样本测序时的技术优势,并总结了检测矩阵的构建方法,指出了混合测序能够应用于部分高通量测序实验并可大幅节约测序成本,展望了混合测序技术在高通量测序中的应用前景.
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米碎花药效微小核糖核酸的鉴定及其靶基因功能分析
目的 筛选米碎花Eurya chinensis茎叶的微小核糖核酸(MicroRNAs,miRNAs)类药效物质及其靶基因功能分析.方法 采用高通量测序法,测定米碎花、正常小鼠和喂食米碎花匀浆液小鼠肝组织及血浆中miRNAs的表达丰度,并与GeneBank上的植物miRNAs数据库比对,结合实时荧光定量PCR(RTFQ-PCR)验证,鉴定吸收进入体内的米碎花miRNAs.以人类mRNA为靶标,采用TargetScan与MiRanda预测米碎花miRNAs的靶基因,并通过基因功能聚类(GO)与KEGG分析靶基因的相关功能.结果 共鉴定出5个米碎花miRNAs可吸收进入体内,其主要在生化过程、细胞成分和分子功能3大区域发挥作用,并影响肿瘤、代谢、炎症等相关信号通路.结论 miRNAs可能是一类新型的中药药效物质.
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基于microRNAs的石荠芋总黄酮抗流感病毒性肺炎作用机制研究
目的 从微小核糖核酸(microRNAs,miRNAs)角度研究石荠芋总黄酮抗流感病毒性肺炎作用机制.方法 设立对照组、模型组和石荠芋总黄酮组,将甲型流感病毒小鼠肺适应株A/PR/8/34经鼻滴入模型组和石荠芋总黄酮组小鼠,建立小鼠流感病毒感染性肺炎模型,观察比较石荠芋总黄酮对流感病毒感染小鼠肺指数和血清白细胞介素-6 (IL-6)、γ干扰素(IFN-γ)水平的影响;采用高通量测序法和荧光定量PCR法,检测各组小鼠肺组织中miRNAs的表达丰度差异;采用miranda、mirbase、targetscan 3个数据库预测差异miRNAs的靶基因,并通过KEGG分析靶基因的相关功能;采用蛋白印迹法验证相关蛋白的表达.结果 与模型组相比,石荠芋总黄酮可显著抑制流感病毒感染引起的小鼠肺指数和血清中细胞因子增加,调节异常表达的miRNAs水平趋于正常;KEGG分析这些miRNAs所调控的靶基因主要富集于JAK-STAT、TLR3等信号通路;Westem blotting证实石荠芋总黄酮可调整感染小鼠异常表达的靶蛋白水平.结论 石荠芋总黄酮可通过调控小鼠体内miRNAs的表达发挥抗流感病毒性肺炎作用.
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基于Illumina MiSeq高通量测序分析黄芪内生细菌多样性
目的 分析黄芪内生细菌群落多样性,为筛选菌种发酵转化黄芪中活性成分的定向炮制工艺研究提供参考依据.方法 应用Illumina MiSeq高通量测序技术测定黄芪内生细菌的16 S rDNA V3-V4区域序列并进行物种丰度等生物信息分析.结果 获得有效序列40 051条,操作分类单元(OTUs) 967个,测序数量接近于饱和,测序数据量合理.黄芪内生细菌主要分布于Anderseniella属、芽孢杆菌属Bacillus、伯克氏菌属Burkholderia、不动杆菌属Acinetobacter、寡养单胞菌属Stenotrophomonas、海洋芽胞杆菌属Oceanobacillus 6个属.结论 黄芪内生细菌群落多样性较低,Anderseniella属和芽孢杆菌属Bacillus是黄芪内生细菌的优势种群.
关键词： Illumina Miseq 黄芪 内生细菌 高通量测序 多样性 -
基于红花不同组织转录组数据的转录因子分析
目的 注释并分类红花Carthamus tinctorius中转录因子家族,分析其在不同组织间的表达水平差异.方法 使用红花不同组织转录组测序数据组装Unigene,利用Nr数据库中转录因子信息比对并注释红花转录因子,同时对MYB转录因子家族的基因表达、蛋白保守结构域及系统发育树等内容重点分析.结果 红花转录组测序数据中共获得731个转录因子,分属42个转录因子家族.MYB转录因子家族成员的表达及蛋白结构分析显示,MYB转录因子家族在花冠中表达差异显著,氨基酸序列中存在3个保守的蛋白核心结构,系统发育树分析显示聚为2类MYB亚族.结论 红花MADs-box、bHLH、MYB、AP2转录因子家族成员多,在不同组织间表达差异显著,MYB转录因子家族具有一定保守性.
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染色体畸变检测在自然流产绒毛组织染色体核型分析中的应用价值
目的：探讨染色体畸变检测技术（高通量测序及短串联重复序列）在自然流产绒毛组织染色体核型检测中的临床应用价值。方法对27例妊娠后发生自然流产者的绒毛组织同时行细胞培养染色体核型分析和染色体畸变检测，比较两种方法的检测结果，分析其临床应用价值。结果（1）两种方法成功率的比较：27例样本经细胞培养染色体核型分析成功23例，成功率85％（23／27）；染色体畸变检测成功26例，成功率为96％（26／27）；差异无统计学意义（P＞0．05）。（2）绒毛培养失败4例的检测：经染色体畸变技术检测成功3例，其结果均为阳性。（3）两种方法阳性率比较：23例样本核型分析结果发现染色体正常10例，异常13例，阳性率为57％；26例样本经染色体畸变检测发现染色体正常3例，异常23例，阳性率为85％，差异有统计学意义（χ2＝6．387，P＜0．05）。（4）核型分析与染色体畸变检测发现染色体数目异常分别为52％（12／23）和50％（13／26）；细胞培养染色体核型分析正常的10例标本中，经染色体畸变技术检测7例存在微缺失／微重复。结论染色体畸变检测技术对染色体非整倍体、异倍体和片段缺失／重复异常的检测精准性高、成功率高，对自然流产病因遗传学检测具有重要意义和实用价值。
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肿瘤大基因包高通量测序在临床中的应用进展
随着高通量测序技术的推进、大数据处理分析水平的提升,以及基于各种分子标记物的靶向治疗和免疫治疗抗肿瘤活性的表现,以高通量测序和大数据为基础的诊疗逐渐应用于临床,不同基因数的基因包(panel)检测为肿瘤诊疗提供依据.本文就高通量测序panel的分类,大panel在肿瘤诊断、靶向治疗、免疫治疗中的应用以及大panel在临床应用中所遇到的问题进行综述,旨在为其在临床上的应用提供参考,促进精准医疗推广应用.
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高通量测序数据的数据库分析技术及应用
随着高通测序成本的降低，每个普通的生物医学研究者或临床医生都有可能面对高通数据分析工作，现提出一种利用数据库语言进行高通测序数据挖掘的方法，构建了ACCESS高通测序分析数据库，数据库包含人类染色体基因位置、启动子位置等基本表，借助该数据库提供的查询范例，用户可以方便完成高通测序结果的peaks文件的数据挖掘。
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高通量测序分析胆囊结石患者microRNA表达谱差异
目的：探讨胆囊结石和非结石患者胆囊黏膜中miRNA表达谱的差异。方法选取30例胆结石患者（结石组）和30例胆囊息肉患者（非结石组）的胆囊黏膜组织，采用Illumina HiSeq 2500高通量测序技术进行深度测序，比较2组的microRNA表达差异。对差异表达的miRNAs进行筛选与靶基因预测，并进行GO和KEGG功能显著性富集分析。荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）对差异表达miRNAs进行验证。结果结石组和非结石组分别获得2215832和1424770条序列，平均长度22 nt。2组间显著差异表达的miRNA共计17个，其中9个表达上调，8个表达下调。GO分析结果示靶基因富集于离子的结合和转运、载脂蛋白结合、钙离子通道激活、蛋白激酶活性等分子功能以及大分子的合成和代谢、类固醇激素生物合成和代谢等生物进程。KEGG通路富集分析示靶基因多集中于癌症相关通路，包括WNT、Hippo等信号通路。qRT-PCR结果示差异性miRNA的表达趋势与测序结果相一致。结论差异表达的miRNA可能在胆囊结石的形成中具有重要作用。
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补气升提法对糖尿病复杂性肛瘘患者术后创面局部微环境影响的研究
目的 通过高通量测序技术评估补气升提法对糖尿病复杂性肛瘘患者术后创面局部微环境的影响.方法 选取24例复杂性肛瘘患者进行研究,将其中伴糖尿病的16例患者随机分为治疗组与阳性对照组,不伴糖尿病的8例患者作为阴性对照组,3组均行复杂性肛瘘切除术,术后给予常规抗感染及外用马应龙麝香痔疮膏和局部红外线照射,治疗组同时给予芪参固托汤口服,3组疗程均为2周.采用高通量测序技术检测3组术后第1天及第14天局部创面分泌物中菌群,以验证补气升提法促进创面愈合的作用机制.结果 治疗第14天,在门水平上,治疗组厚壁菌门高于阳性对照组(P均<0.05),变形菌门、放线菌门、拟杆菌门、蓝藻门均低于阳性对照组(P均<0.05),治疗组与阴性对照组分布相似;在属水平上对肠球菌属、柔嫩梭菌属、瘤胃球菌属、普氏菌属、链球菌属、双歧杆菌属、萨特式菌属、罗氏菌属、棒状杆菌属、科林斯式菌属、乳酸杆菌属11个优势菌属进行分析,治疗组的柔嫩梭菌属、链球菌属、萨特式菌属、罗氏菌属、乳酸杆菌属高于阳性对照组(P均<0.05),其余菌属低于阳性对照组(P均<0.05),治疗组与阴性对照组分布相似.结论 糖尿病复杂性肛瘘患者术后创面局部微环境中的菌群与不伴糖尿病患者的菌群多样性和种群结构明显不同,特别是在门水平上.补气升提法能使糖尿病复杂性肛瘘患者术后创面局部微环境中的菌群物种、丰度分布发生变化,由门水平至属水平上将其调节到与不伴糖尿病患者菌群相似.
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三叶青转录组SSR信息分析
目的 通过对三叶青转录组数据的分析,开发三叶青SSR分子标记技术,为三叶青遗传多样性分析和资源保护提供方法.方法 将三叶青高通量测序获得的Unigene进行简单重复序列(SSR)位点挖掘和分析.结果在84433条Unigene搜索出8263条符合条件的SSR,发生频率为9.79%,平均每11.72 kb中出现1个SSR位点.共有174种重复基元,四核苷酸重复基元多有68种,(A/T)n、(T/A)n、(GA/TC)n的比例较高,四、五、六核苷酸出现频率较低占比例为1.61%.SSR的长度集中在10~24 bp,其中10 bp多有1531个,其次为15 bp,为1042个,11、12、14、18 bp的个数超过500个,分别为689、970、576、895.三叶青SSR长度在12~20 bp为4880条,占59畅02%,在理论上具有中等以上的多态性.结论 通过对三叶青转录组序列SSR信息分析和挖掘,为三叶青遗传多样性分析、分子育种、分子标记开发及遗传资源保护等方面提供了参考依据.
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中国Alport综合征一家系的基因突变检测与临床表型分析
目的:应用高通量测序技术,检测一个中国遗传性肾病家系的致病基因突变,探讨靶区域捕获和高通量测序方法在遗传性肾病基因筛查中的可行性. 方法:收集家系临床资料和外周血样本;分析先证者的临床资料,并观察肾穿组织病理,采用目标区域捕获和高通量测序技术,对先证者355个遗传性肾病相关基因的外显子进行突变筛查;应用Sanger测序,在其他家庭成员中进行突变位点验证及突变-表型共分离分析,并对突变位点进行多物种的保守性分析. 结果:结合临床检验结果和肾活检病理观察,先证者符合慢性肾小球肾炎,不排除Alport综合征的可能. 基因筛查发现,该家系可确诊为X染色体显性遗传Alport综合征,家系中所有女性患者均为X染色体COL4A5基因c. 3641G>A( p. Gly1214Glu)杂合突变,而男性患者均为该位点的半合子. 且该位点在多个物种中具有高度的序列保守性. 结论:该遗传性肾病家系是X染色体显性遗传Alport综合征,致病突变位点为COL4A5 c. 3641G>A(p. Gly1214Glu). 靶区域捕获和高通量测序技术成本低、高通量、准确性高,适用于遗传性肾病家系的基因突变筛查.
关键词： 遗传性肾病 Alport综合征 高通量测序 COL4A5基因突变 -
第2代和第5代人脐带间充质干细胞外泌体miRNA谱的比较
背景:研究发现外泌体具有部分间充质干细胞的功能,了解间充质干细胞外泌体中发挥代表性作用的物质,可以为进一步探索人工合成外泌体类似物提供线索.目的:研究第2代和第5代人脐带间充质干细胞来源外泌体中miRNA的表达谱差异.方法:采用超高速离心法提取第2代和第5代人脐带间充质干细胞培养上清液中的外泌体,并使用高通量测序技术,对建立的文库进行测序,再将结果进行分析,了解不同外泌体之间所表达的 miRNA,并做聚类分析.结果与结论:①第2代人脐带间充质干细胞来源外泌体能够检测出427 657种miRNA,占检出总miRNA的68.93%;第5代人脐带间充质干细胞来源外泌体能够检测出119 283种miRNA,占检出总miRNA的19.22%,其中二者共有的miRNA有73 526种,占检出总 miRNA的11.85%;②经生物信息学分析(聚类分析)表明这些miRNA 可能参与了161种生物过程,包括细胞修复、免疫、抗衰老等;③随着传代次数的增加,外泌体miRNA成分发生了较大的变化,部分miRNA拷贝数水平明显减低,其中含量高的前5个miRNA(has-miR-146a-5p、has-miR-191-5p、has-miR-493-3p、has-miR-423-5p、has-miR-134-5p)有望做为合成外泌体类似物的组成部分.
