补肾健脾方对骨质疏松骨骼肌线粒体氧化应激的影响

目的:探讨补肾健脾方对骨质疏松骨骼肌线粒体氧化应激的调控作用.方法:6月龄的雌性SD大鼠随机分为模型组、雌激素组、中药组和空白对照组.治疗3个月后,收集肌肉组织进行线粒体通透转换孔和细胞色素C氧化酶的活性检测.结果:在线粒体通透转换孔活性比较方面,雌激素组、空白对照组与模型组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05);在细胞色素C氧化酶比较方面,空白对照组与模型组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).中药组与模型组在上述两组比较,差异均无统计学意义.结论:雌激素表现出对线粒体氧化应激功能的调控能力,因此认为以骨骼肌作为药物靶点治疗骨质疏松症是可能实现的.而中药尽管在实验中均没有出现阳性结果,但数值表明仍值得我们进一步研究.

大鼠肢体缺血再灌注损伤与骨骼肌呼吸链电子漏的关系

肢体缺血再灌注损伤是临床骨科常见的病征.它是指肢体在血液灌注停止或不良,即经历缺血、缺氧后,循环重新建立,血供恢复后给肢体组织带来的损伤.其发生机制尚未完全阐明.既往大量研究多集中在活性氧代谢物导致该损伤.对线粒体呼吸链在该损伤机制中的作用报道很少,且局限于心肌、脑缺血/再灌注损伤.由于抗氰呼吸是非磷酸化的耗氧,呼吸链电子漏路径的耗氧对氰化物不敏感[1]故本实验通过对骨骼肌线粒体抗氰呼吸的测定,探讨肢体缺血/再灌注损伤与线粒体呼吸链电子漏的相关性.

呼吸链温和解偶联:运动中骨骼肌线粒体抗氧化分子调控的早期事件

目的:研究急性运动诱导线粒体活性氧(ROS)生成的过程中,线粒体内解偶联蛋白(UCPs)介导的温和解偶联(mild uncoupling)和抗氧化酶这两种抗氧化体系可能的分工与协同关系及其生物学意义.方法:以SD大鼠3级递增负荷跑台运动为实验模型,分别选取安静态、运动45min、90min、120min和150min为实验观察点(time course),测定骨骼肌线粒体ROS生成和脂质过氧化水平(MDA)、线粒体Mn-SOD酶活性、Mn-SOD和解偶联蛋白3(UCP-3)mRNA及蛋白表达.结果:运动过程中ROS生成呈先上升后下降的变化趋势,在运动120min达到峰值,其中运动45min、90min、120min和150min时均较安静时呈显著性升高(分别为P＜0.05、P＜0.001、P＜0.001和P＜0.01),150min时下降并具有显著性(P＜0.001).线粒体MDA含量总体呈上升趋势,但变化无显著性.运动过程中Mn-SOD酶活性及其mRNA和蛋白表达水平均无显著性变化,而UCP-3 mRNA和蛋白表达水平总体呈上升趋势.其中UCP-3 mRNA在运动至90min、120min、150min时较安静时均呈显著性升高(分别为P＜0.001、P＜0.01和P＜0.01),其蛋白表达水平相对滞后一个时间段,运动120min、150min时较安静时显著升高(均为P＜0.001).结论:长时间运动过程中,以UCP-3的先行诱导表达对骨骼肌线粒体氧化还原状态进行调节,相对于Mn-SOD的抗氧化作用,UCP-3的诱导表达是运动中抗氧化的"早期事件".

"解偶联蛋白库"参与急性运动中骨骼肌线粒体解偶联蛋白3的迅速表达

目的:研究急性运动中和运动后,骨骼肌线粒体活性氧(ROS)生成与解偶联蛋白3(UCP3)表达的相互关系,探讨骨骼肌胞浆中解偶联蛋白库的作用.方法:采用修正的SD大鼠三级递增负荷跑台运动模型,分别选取安静态、运动45、90、120、150min和运动后3、6、12、24h为实验观察点(time course),荧光法测定骨骼肌线粒体ROS生成;荧光定量PCR测定UCP3 mRNA;蛋白印迹法测定骨骼肌和线粒体UCP3蛋白表达;免疫荧光分析检测骨骼肌线粒体外是否存在UCP3蛋白.结果:(1)急性运动中及运动后UCP3 mRNA含量和线粒体UCP3蛋白水平均呈先上升后下降的变化趋势:UCP3 mRNA含量在运动45min时显著高于安静态(P＜0.01),并持续增高到150min时.虽然在运动后明显下降,但仍显著高于安静态(P＜0.05);线粒体UCP3蛋白含量在运动120min和150min时显著高于安静态(P＜0.001),而骨骼肌UCP3蛋白含量各时间点均未见显著性差异(P＞0.05);(2)免疫荧光分析显示,安静态胞浆内存在大量UCP3蛋白,运动120分钟时明显减少;(3)急性运动中及运动后骨骼肌线粒体ROS生成呈先上升后下降的变化趋势:运动45min开始显著升高(P＜0.05),并持续升高至运动120min(P＜0.001),150min时有所下降,但仍显著高于安静态(P＜0.01);运动后3、6、12、24hROS生成均高于安静态,12、24h显著高于安静态(P＜0.05).结论:骨骼肌细胞胞浆内存在"UCP3蛋白库",可在运动应激条件下快速动员装载入线粒体,发挥运动抗氧化的快速应答效应.

急性运动中线粒体能量转换调节的生物力能学分析:ROS和UCP3的作用

目的:研究1次耐力性运动过程中,骨骼肌线粒体ROS生成与UCP3表达与线粒体生物力能学改变的关系,及其在线粒体能量转换调控中的作用.方法:建立SD大鼠3级递增负荷跑台运动实验模型,分别以安静态、运动45min、90min、120min和150min时为实验观察点(time course),测定骨骼肌线粒体ROS生成,膜电位水平,态4呼吸速率,ATP合成速率,线粒体解偶联蛋白3(UCP-3)mRNA及其蛋白表达.结果:运动过程中ROS生成呈先升高后下降的变化趋势,运动120min时达峰值,其中运动45min、90min、120min和150 min时ROS生成均较安静时显著升高(P＜0.05,P＜0.001,P＜0.001和P＜0.01),运动150min时ROS生成较120min时显著下降(P＜0.001).态4呼吸速率亦呈先升高后下降的并行性变化趋势,其中运动90和120min时较安静时显著增加(P＜0.01和P＜0.001),并于120min时达到峰值,150min时较120min时显著降低(P＜0.001).各实验观察点大鼠线粒体膜电位无显著差异(P＞0.05).ATP合成速率于运动45min时增加随后减小,150min时较45min时显著减小.UCP3 mRNA和蛋白表达水平总体呈升高趋势,其中UCP3 mRNA表达在运动至90min、120min及150min时均较安静时显著升高(P＜0.001,P＜0.01和P＜0.01),其蛋白表达水平升高相对滞后一个时间段,在运动至120min及150min时较安静时显著升高(均P＜0.001).结论:一次性耐力运动初期ROS大量产生这一过程使线粒体膜维持适宜的跨膜电位,线粒体ATP合成速率降低是ROS线粒体能量转换过程调节线粒体功能的初始环节.随着ROS大量生成,其可能通过"ROS-质子漏"和"ROS-UCP3-质子漏"两条途径在运动中线粒体能量转换的精确调控中起"分子开关"作用,并作为始动因素参与了呼吸链电子传递与能量转换的能量分配的反馈调节,调控ATP生成.

运动性疲劳的线粒体膜分子机制研究.Ⅰ.急性力竭运动中线粒体电子漏引起质子漏增加及其相互作用

以大鼠渐增负荷力竭性跑台跑为运动性疲劳模型,观察了运动后大鼠骨骼肌线粒体电子漏和质子漏的变化.测定线粒体超氧阴离子生成量和脂质过氧化水平.分别测定线粒体以苹果酸+谷氨酸和以琥珀酸为底物的态4呼吸、态3呼吸、呼吸控制比及磷氧比.结果表明,运动性疲劳状态下大鼠骨骼肌线粒体超氧阴离子生成增加,脂质过氧化水平也显著增加;以苹果酸+谷氨酸或以琥珀酸为底物的态4呼吸速率明显加快,呼吸控制比、磷氧比显著下降.结果提示,力竭性运动后下大鼠骨骼肌线粒体电子漏导致线粒体质子漏增多,是运动性疲劳状态下线粒体氧化磷酸化偶联程度下降的重要因素.实验结果支持电子漏引起质子漏的假说.

急性运动中骨骼肌线粒体活性氧生成与解偶联的反馈调节

目的:线粒体呼吸链电子漏是运动性内源活性氧(ROS)生成的重要机制之一.目前的研究表明,线粒体呼吸链"温和解偶联"机制也参与了线粒体内的抗氧化防御过程.本研究拟证实运动是否也不同程度地诱导和/或启动了线粒体呼吸链"温和解偶联"生物抗氧化机制,并探讨其可能的分子调节作用和生理意义.方法:以SD大鼠三级递增负荷跑台运动为实验模型,分别选取安静态、运动45、90、120和150min为实验观察点(time course),测定骨骼肌线粒体ROS生成、线粒体态4呼吸速率、骨骼肌解偶联蛋白3(UCP-3)mRNA和线粒体UCP-3蛋白表达.结果:运动过程中ROS生成呈先上升后下降的变化趋势,其中运动至45、90、120 min时均较安静时显著升高(分别为P<0.05、P<0.001和P<0.001),于120min达到峰值,随后(150min时)显著下降(与120min组相比,P<0.001);态4呼吸速率亦呈先上升后下降的并行性变化趋势,其中运动90、120min较安静时显著增加(分别为P<0.01和P<0.001),并于120min达到峰值,随后(150min时)显著降低(与120min组相比,P<0.001);UCP-3 mRNA在运动至90、120、150min时均较安静时显著升高(分别为P<0.001、P<0.01和P<0.01),其蛋白表达水平则相对滞后1个时间段,先后在运动至120、150min时较安静时显著增加(均为P<0.001).结论:线粒体态4呼吸速率、ROS生成和UCP-3表达随运动时间的变化表明,ROS可能贡献于运动中骨骼肌线粒体UCP-3的激活和/或诱导表达;运动中UCP-3表达增加的意义在于抑制ROS生成,并且由ROS→UCP-3→质子漏→ROS形成一个复杂而精确的激活、诱导表达与抗氧化的反馈调节环路,使线粒体能够尽早预防运动可能引发的氧化应激和脂质过氧化,维持线粒体及细胞内的氧化还原状态.

骨骼肌线粒体对细胞能量需求的快速应答:mfn1/2与fis1基因在急性运动中的动态表达

目的:本研究探讨在细胞能量需求急剧变化的条件下,骨骼肌线粒体能量代谢与线粒体融合基因mfn1/2和分裂基因fis1表达的动态变化,并分析这两者之间的关系.方法:以SD大鼠一次递增负荷跑台运动为实验模型,测定骨骼肌线粒体ROS生成速率和态3、态4呼吸速率,ATP合成酶活性和膜电位水平,并观察运动中及其恢复期骨骼肌线粒体mfn1/2和fis1 mRNA表达变化.结果:(1)150分钟运动过程中mfn1 mRNA表达逐渐降低,其中E45、E90、E120和E150组分别较安静组下降了21、42、70、77%(均P＜0.01),PE-3h、PE-6h、PE-12h和PE-24h组则分别较安静组增加至144、152、134和135%(P＜0.01);mfn2 mRNA表达呈相似表现,在运动中至运动后6小时较安静时分别下降了36、73、96、64、57和59%(均P＜0.01),PE-12h和PE-24h组则增加至148和154%(均P＜0.01);对应以上时问点,fis1 mRNA表达在运动中各时间点较安静时显著增加,并在运动后3小时达到峰值,分别增加至264、213、252、406和450%(均P＜0.01),随后逐渐下降,但仍高于安静值(P＜0.01).(2)在运动中及运动后各时间点,ROS生成速率均较安静组显著增高,其中FA5、E90和E120组ROS生成速率持续增高,E150、PE-3h、PE-6h、PE-12h和PE-24h组较E120组明显下降;整个过程中线粒体能化态膜电位无显著变化.E45组ATP合成酶活性与安静组比较明显增加,但PE-3h组显著降低,其余各组无明显变化;除E150组线粒体态3呼吸速率较安静组显著降低外,其它各组无明显差异.结论:(1)急性运动中骨骼肌mfn 1/2 mRNA表达显著减少,fis1 mRNA表达明显增加;运动后骨骼肌mfn1/2 mRNA水平逐渐明显增加,fis1 mRNA转录逐渐减少.(2)线粒体能量代谢耦联效率能够对机体的能量需求作出快速应答反应,线粒体分裂与融合基因的动态表达是线粒体对细胞能量需求急剧增加的快速应答反应的一个组成部分.

不同时长高强度间歇训练与中等强度持续运动对大鼠骨骼肌AMPK、PGC-1α表达量及大摄氧量的影响

目的:探讨不同时长高强度间歇训练(high intensity interval training,HILT)与中等强度持续运动对骨骼肌氧化能力相关因子AMPK和PGC-1α表达量及大摄氧量(VO2max)的影响,为制定有效的运动健身负荷提供参考.方法:120只6周龄SPF级雄性Wistar大鼠按体重随机分为安静对照组、中等强度持续运动组与HIIT组三组,每组各40只.安静对照组大鼠不运动,中等强度运动组以60％～70％VO2max强度进行持续训练,HIIT组以50％VO2max、70％VO2max、90％VO2max的强度交替训练.跑台训练每周5天,每天50分钟.每周日上午8:00～9:00进行体重测量.每组大鼠分别在训练2、4、6、10周后取比目鱼肌,每组每次随机选取10只大鼠,取材前均进行VO2max测试.随后采用Western Blot检测比目鱼肌中AMPK、PGC-1α蛋白的表达情况.结果:(1)大鼠运动周数和运动方式分别对大鼠体重具有非常显著的影响且具有非常显著的交互作用(P＜0.01);(2)相同训练周期下,10周HIIT组大鼠骨骼肌PGC-1α含量显著高于安静对照组(P＜0.05),VO2max显著高于安静对照组和中等强度运动组;(3)相同训练方式下,10周HIIT组大鼠VO2max与0、2、4、6周时相比均有显著增高(P＜0.05),中等强度持续运动组训练至第4周时骨骼肌AMPK蛋白表达量显著高于第2周和第6周,同时显著高于2周安静组(基准值)(P＜0.05),HIIT组第2至第10周期间PGC-1 α蛋白表达量均显著高于2周安静对照组(基准值)(P＜0.05);(4)10周内HIIT组PGC-1α蛋白表达量与大摄氧量时序性变化趋势具有显著相关关系(P＜0.05).结论:(1)10周HIIT可以有效提高大鼠骨骼肌AMPK和PGC-1α的蛋白表达量以及大摄氧量;(2)10周HIIT相对于传统中等强度持续有氧运动对提高骨骼肌氧化能力和机体心肺耐力更为快速有效.

运动训练中骨骼肌线粒体生物发生的基因表达与调控

线粒体是真核细胞中普遍存在的重要的细胞器之一,它不仅是细胞内的"动力工厂",还是非常敏感多变的细胞器.线粒体受核基因(nDNA)和线粒体基因(mtDNA)的双重控制,共同维持了线粒体乃至细胞的正常功能.mtDNA是动物体内惟一存在的核外遗传物质,具有半自主性,母性遗传和隔离复制的特性.

益气健脾法对脾虚证大鼠模型骨骼肌线粒体ATPase活性的影响

目的 观察益气健脾法代表方剂对实验性脾虚证大鼠模型骨骼肌线粒体腺苷三磷酸酶(ATPase)活性的影响.方法 取SD大鼠60只随机分为6组,即正常对照组、脾虚模型组、四君子汤组、当归补血汤组、黄芪四君子汤组、当归补血汤合四君子汤组,采用破气苦降加饥饱失常法复制脾虚证大鼠模型,用定磷法检测大鼠骨骼肌线粒体ATPase的活性.结果 益气健脾方药能显著升高脾虚证大鼠模型骨骼肌线粒体ATPase的活性.结论 从微观的角度验证了中医"脾主四肢""脾主肌肉"的理论.

耐力训练抑制急性低氧时骨骼肌线粒体生物能学变化:ROS和UCP3的作用

骨骼肌线粒体解耦联蛋白3(uncoupling protein 3,UCP3)在低氧时的牛理作用尚不清楚.本研究观察了大鼠在耐力训练前后,模拟急性高原低氧各时间点的骨骼肌线粒体UCP3 mRNA和蛋白表达、线粒体呼吸功能、活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生速率以及锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,MnSOD)表达和活性的变化.急性低氧导致线粒体一系列生物能学功能障碍.未训练大鼠UCP3蛋白在4 h时比静息时升岛了60%,而MnSOD蛋白含量及活性在低氧暴露过程中无显著变化;UCP3蛋白上调通过降低电子传递链耦联程度抑制02产生,但同时降低了ATP合成效率.耐力训练显著抑制急性低氧诱导的骨骼肌UCP3蛋白上调(67% vs 42%).训练组大鼠的ROS产生速率在低氧2 h、4 h和6 h时显著低于未训练组;MnSOD蛋白含量及活性分别较未训练组提高了50%和34%.训练组人鼠MnSOD上调可增加线粒体对ROS的耐受力,进而抑制UCP3蛋白表达,从而提高氧化磷酸化效率.急性低氧中,未训练组大鼠呼吸控制比(respiratory control ratio,RCR)和磷氧比(ADP to oxygen consumption ratio,P/O)显著降低,而训练组RCR和P/O保持相对稳定.以上结果提示:(1)模拟急性高原低氧可诱导UCP3 mRNA及蛋白表达升高,从而降低升高了的线粒体膜电位(△Ψ),使ROS的产生减少;(2)耐力训练可抑制低氧诱导的UCP3表达上调,提高ROS酶学清除能力,从而提高线粒体氧化磷酸化效率.

早期或进展期的2型糖尿病不伴有在体骨骼肌线粒体机功能失常/遗传药理学在治疗糖尿病和肥胖中的潜在作用/网络胰岛素剂量计算器在重症患者血糖控制中的应用

休克再灌注后早期UCP-2对线粒体膜电位的影响作用

目的:通过观察休克-再灌注大鼠肠上皮、骨骼肌、心肌细胞线粒体UCP-2的变化规律及其对线粒体膜电位(MP)的影响,探讨休克再灌注后不同组织线粒体功能发生差异性损伤的机制 .方法:取150-220 g Wistar大鼠,复制休克再灌注模型,差速离心法游离肠上皮、心肌、骨骼肌细胞线粒体,用Western blot法测量UCP-2含量,用荧光分光光度计法测量线粒体膜电位.实验分组如下:对照组(假手术)、单纯休克组(40 mmHg 90 min)、再灌注(单纯休克+回输全部失血量及2倍失血量的晶体液)2 h组、再灌注6 h组、再灌注12 h组、再灌注24 h组.结果:(1)失血性休克90 min后,3种组织线粒体UCP-2均有升高,与对照组相比有显著差异(P＜0.05),肠上皮线粒体UCP-2在再灌注后24 h 内均高于对照组(P＜0.05),心肌线粒体UCP-2于再灌注后2 h高于对照组,但再灌注后6 h与对照组相比无显著差异(P＜0.05), 骨骼肌线粒体UCP-2于再灌注后6 h高于对照组,但再灌注后12 h与对照组相比无显著差异 (P＜0.05);(2)在测量MP的各组实验中,加入UCP-2抑制剂GDP后MP均高于无GDP处理组(P＜ 0.01);(3)休克及再灌注后24 h内,肠上皮细胞线粒体MP均比对照组降低,心肌线粒体 MP于休克及再灌注后2 h低于对照组,于再灌注后6 h与对照组相比无显著差异,骨骼肌线粒体MP于休克及再灌注后2 h低于对照组,于再灌注后6 h与对照组相比无显著差异,但再灌注后12-24 h骨骼肌线粒体MP又低于对照组(P＜0.05).讨论:近来认为,UCP-2使质子泄漏引起M P降低,其结果导致氧化磷酸化解偶联,ATP合成效率降低,同时能够降低4态呼吸时线粒体内ROS的产生.本实验也证实,加入GDP抑制UCP-2的质子转运活性,线粒体MP增高.休克导致线粒体UCP-2表达上调,再灌注后UCP-2水平逐渐恢复,但不同组织中UCP-2的变化规律不同,心肌细胞线粒体UCP-2水平恢复较快,骨骼肌及肠上皮恢复较慢,这可能与休克时不同组织的缺血程度不同有关,其结果与MP及线粒体功能的恢复可能有关,这可能是导致休克再灌注后不同组织线粒体功能发生差异性损伤的机制之一.结论:本实验结果提示UCP-2可能介导休克-再灌注后MP的调节,休克再灌注后,不同组织中线粒体UCP-2的变化规律不同, 可能与休克再灌注后不同组织线粒体功能发生差异性损伤有关.

人参皂苷Rg3对模拟高原缺氧大鼠的抗疲劳效应和骨骼肌线粒体功能的影响

目的 观察人参皂苷Rg3在模拟高原环境下提高大鼠的抗疲劳能力和对骨骼肌线粒体功能的影响.方法 40只大鼠按随机数字表法分成4组,每组10只,分为正常对照组、Rg3+正常对照组(NG +Rg3)、缺氧模型组(model group,MG)、Rg3+缺氧模型组(MG+Rg3).MG组和MG+ Rg3组在模拟海拔5000m高度的低压舱中喂养,大鼠每日从模拟高原环境中取出1h行Rg3灌胃,剂量为20 mg/(kg·d).连续灌胃15 d后,观察大鼠在正常环境和模拟高原环境下力竭游泳时间.力竭游泳实验结束后30 min,腹主动脉采血并检测大鼠总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、血糖(glucose,GLU)、血氨(blood ammonia,BA)和血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)的变化.同时迅速分离大鼠股四头肌,检测骨骼肌线粒体丙二醛(malon-dialdehyde,MDA)、锰超氧化物歧化酶(Mn-superoxide dismutase,Mn-SOD)以及呼吸链复合物Ⅲ、Ⅳ活性的变化.结果 Rg3显著延长正常环境和模拟高原环境下大鼠的力竭游泳时间(P＜0.01);显著上调正常环境和模拟高原环境下大鼠血清TC、TG、LDH、GLU浓度(P＜0.05,P＜0.01)和骨骼肌线粒体Mn-SOD活性及骨骼肌线粒体呼吸链复合物Ⅲ、Ⅳ活性(P＜0.01);显著下调模拟高原环境下大鼠的BUN含量和骨骼肌线粒体MDA含量(P＜0.01).结论 人参皂苷Rg3在模拟高原环境下可延长大鼠力竭游泳时间,改善疲劳相关的生化指标,提高骨骼肌线粒体对自由基的消除作用和供能效力.