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NGF和GDNF对大鼠嗅鞘细胞体外增殖和分化的影响
本研究旨在比较神经生长因子(NGF)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对大鼠嗅鞘细胞(OECs)体外增殖和分化的影响.在体外分离培养大鼠OECs的培养液中不加神经营养因子(对照组)或加入不同的神经营养因子(NGF组和GDNF组),倒置显微镜下进行观察,并通过S-100免疫荧光组织化学染色检测各组大鼠OECs体外增殖和分化情况.结果显示:NGF组和GDNF组OECs增殖和分化明显好于对照组(P<0.01),NGF组又明显好于GDNF组(P<0.01).这些结果提示NGF能促进大鼠OECs体外增殖和分化.
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嗅鞘细胞联合神经干细胞脑内移植改善Parkinson病大鼠行为的观察
为了观察嗅鞘细胞(OECs)联合神经干细胞(NSCs)脑内移植对Parkinson病(PD)的治疗作用,首先将6-OHDA注射至左侧黑质致密部和腹侧被盖区制备PD大鼠.将成功制备的PD大鼠随机分为5组,即0.9%生理盐水对照组、单纯移植 NSCs 或OECs组、OECs+NSCs 共移植组和PD模型对照组.将培养并传至第3代的NSCs、OECs和OECs+NSCs分别移植到PD大鼠的纹状体内,于移植后7、14、30、60 d 检测 PD 大鼠旋转行为变化后处死,取脑做冰冻切片,行BrdU、酪氨酸羟化酶(TH)、p75 免疫荧光和TH免疫组织化学检测.移植后21 d 以内,各组大鼠的旋转行为无明显变化;30 d 和 60 d 时,单纯移植NSCs或OECs组和OECs+NSCs共移植组与生理盐水和模型对照组相比,旋转行为有较明显的改善(P＜0.05),其中 OECs+NSCs 共移植组的旋转行为改善更为显著.在移植后30 d 和 60 d,单纯移植NSCs或OECs组在移植区可见少数 TH 阳性神经元,而OECs+NSCs 共移植组的TH 阳性神经元明显多于单纯移植NSCs或OECs组(P＜0.05).上述结果表明:OECs能促进胚鼠中脑来源的NSCs向TH阳性神经元分化;单纯移植NSCs或OECs和OECs+NSCs共移植,均能不同程度地改善PD大鼠的旋转行为,但联合移植优于单纯移植.
关键词： 嗅鞘细胞 神经干细胞 脑移植 Parkinson病 大鼠 -
pH对体外培养成年大鼠嗅鞘细胞存活的影响
为了研究不同pH培养环境对体外培养大鼠嗅鞘细胞(OECs)存活的影响,本研究采用成年大鼠嗅球培养OECs,培养第8 d用S-100免疫组化鉴定纯度后,改用不同pH值(6.8,7.0,7.4,7.8)的DF12培养液继续,在相差显微镜下观察OECs的形态学变化.在不同pH条件下继续培养第3 d时采用MTT方法检测不同pH环境中的细胞活力,并用碘化丙啶(PI)和Ho-echst33342荧光双重染色观察细胞死亡率.结果显示:大鼠OECs纯度为(70±4)%;pH 7.4组OECs生长旺盛,pH 6.8组及pH7.0组OECs生长增殖受到不同程度的抑制,出现死亡细胞;pH 7.8组OECs广泛死亡;MTT试验表明,pH 7.4组的OD值显著高于其他各pH组.PI/Hoechst33342双重荧光染色显示,在pH 6.8、pH 7.0和pH 7.8组死亡OECs的百分比分别为(27.6±7.8)%、(31.7±7.2)%和(62.3±5.6)%.在pH 7.4组未见到死亡的OECs.研究结果表明OECs对酸、碱性环境改变均较敏感,尤其是碱性环境.
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嗅鞘细胞对神经干细胞增殖与分化的影响
观察嗅鞘细胞(OECs)对神经干细胞(NSCs)增殖与分化的影响.取孕14 d的SD胚鼠嗅球和腹侧中脑组织,分为OECs+NSCs共培养组和NSCs单独培养组进行培养.用p75免疫组化法,p75、BrdU/nestin、GFAP、NF(神经原纤维)和p75/nestin免疫荧光法分别鉴定OECs和NSCs并观察其增殖与分化.在培养7 d时,绝大多数OECs呈梭形且发出2～3个突起,少量呈扁平椭圆形,两者均呈p75阳性.在7 d时,单独培养的NSCs表现为典型的神经球悬浮生长,呈BrdU/nestin阳性;14 d后偶见神经球贴壁分化,球中的少数细胞呈绿色荧光标记的NF阳性,大部分呈GFAP阳性.在5 d时,OECs+NSCs共培养组形成神经球;10d时球体积不断增大,球心透亮度良好;12 d后神经球的体积不再增大,开始贴附在OECs上生长,可见神经球向四周伸出突起并开始分化;14d时NSCs紧贴OECs生长并同OECs广泛交织在一起,可见NSCs和OECs分别呈nestin和p75阳性,NSCs中的大部分呈NF阳性,小部分为GFAP阳性.NSCs单独培养组和OECs+NSCs共培养组中NF阳性细胞率分别为47.2%和69.5%,前者明显少于后者(P＜0.05).以上研究结果提示OECs有促进NSCs增殖和诱导其分化的作用.
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嗅鞘细胞在含Schwann细胞冻融周围神经移植物内的存活及对成年大鼠视神经再生的影响
为了研究嗅鞘细胞(OECs)在含Schwann细胞(SCs)及预先溃变的冻融周围神经内的存活及对成年大鼠视神经再生的影响,我们将30只动物左视神经眶内断端分别移植冻融周围神经、预溃冻融周围神经、含OECs预溃冻融周围神经、含SCs冻融周围神经或含OECs和SCs冻融周围神经,4周后观察OECs在神经移植物中的存活和分布,计数各组以5%荧光金逆行标记的再生RGCs数量.结果显示,OECs仅存活于含SCs冻融周围神经移植物内,含OECs-SCs冻融周围神经组及含SCs冻融周围神经组视网膜内可见荧光金标记的RGCs,前组再生RGCs均数(346±42)较后组(205±59)显著增高(P＜0.05).这些结果提示预溃冻融周围神经不适宜OECs生存.OECs在含有SCs的冻融周围神经移植物中能够存活,并发挥较单用SCs更强的促进视神经再生的作用.
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成年大鼠嗅粘膜细胞原代培养及形态学研究
为了探讨大鼠嗅粘膜嗅鞘细胞(OECs)的分离与纯化培养方法并对其形态学进行研究,我们自鼻腔嗅粘膜取材后采用差速贴壁、机械刮除和阿糖胞苷(Ara-c)抑制相结合的纯化培养方法培养嗅粘膜细胞,并分不同阶段进行镜下观察及p75NGFR和GFAP免疫组化染色鉴定.结果显示,自嗅粘膜组织可以培养出四种细胞:梭形细胞、双极细胞、窝形细胞和大细胞.其中大部分梭形和双极细胞呈p75NGFR或GFAP免疫反应阳性,属于OECs.结果提示本文介绍的培养方法可以培养出嗅粘膜OECs;差速贴壁、机械刮除和Ara-c抑制相结合方法可纯化OECs.
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嗅鞘细胞与神经细胞体外共培养的研究进展
嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)分布于嗅球和嗅上皮基底膜,同时具有中枢神经系统星形胶质细胞和周围神经系统雪旺细胞特性,其生物学功能极为广泛.近年研究证实OECs具有支持和促进多种神经元存活和轴突再生的作用,目前已被广泛应用于中枢神经系统损伤的修复[1,2].
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嗅鞘细胞对培养脊髓神经元生长状态的影响
目的研究嗅鞘细胞(OECs)对体外培养脊髓背根神经节神经元生长状态的影响.方法取新生大鼠脊髓背根神经节细胞与嗅鞘细胞共培养,在显微镜下观察神经元生长发育情况,染色后进行细胞计数,并测定细胞活性.结果共培养组细胞密度明显高于对照组,神经元胞体大而饱满,突起较长,细胞活性较高.结论嗅鞘细胞可明显促进体外培养脊髓背根神经节神经元的生长,提高细胞活性.
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嗅鞘细胞移植治疗多发性硬化1例
作者在治疗晚期脊髓损伤的基础上[1],采用嗅鞘细胞移植治疗脊髓多发性硬化1例,取得较好效果.
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细胞移植治疗脊髓损伤的进展
脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是一种严重的中枢神经系统创伤性疾病,具有高发生率、高致残率、高消耗等特点.目前SCI修复面临的主要问题是:原发和继发性神经元死亡,大量的轴突变性和弥漫性脱髓鞘;损伤后胶质瘢痕构成阻碍轴突生长的物理屏障;局部炎症反应和神经营养因子、神经生长因子的缺乏,以及SCI后损伤区微环境中大量的抑制因子的产生(如硫酸软骨素蛋白多糖、髓磷脂相关糖蛋白等).
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嗅鞘细胞移植在眼科领域应用的研究进展
嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)是目前唯一一种在成熟阶段还具有生长能力的特殊类型的胶质细胞,是继神经干细胞和雪旺细胞之后能促进神经纤维再生的一种新型细胞.它的生物学性能广泛,不但对神经元具有支持、营养、引导及促进存活的作用,而且能够改善受损轴突生长的环境,使其避免接触周围环境中不利于再生的因素,起到一定的隔离作用.OECs是目前神经外科和眼科用于细胞移植的种子细胞之一.现就近年来OECs在眼科领域的研究作一综述.
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嗅鞘细胞移植联合应用GDNF对大鼠视神经不全损伤后功能恢复的作用
目的:探讨嗅鞘细胞(OEC)移植和人重组胶质细胞源性神经营养因子(recombinant human glial cell line-derived neurotrophic factor,rhGDNF)对大鼠视神经不全损伤后功能恢复的作用.方法:采用无创血管夹在成年大鼠制作视神经不全损伤模型,分为玻璃体腔注射rhGDNF、视神经损伤处注射OEC、rhGDNF+OEC联合治疗组和对照组.在损伤前、损伤后即刻及伤后1,2,4,8和12wk检测伤眼闪光视觉诱发电位.结果:视神经损伤后即刻闪光视觉诱发电位波形呈熄灭状.伤后1wk各治疗组和对照组潜伏期基本恢复至损伤前水平.振幅恢复缓慢,伤后1～2 wk治疗组与对照组比较无显著差异(P＞0.05);4wk以后rhGDNF组和OEC组与对照相比间差异显著(P＜0.05),GDNF+OEC组与对照组相比差异非常显著(P＜0.01).8wk时对照组恢复至损伤前的43.1%,GDNF治疗组恢复至损伤前的51.5%,OEC治疗组恢复至损伤前的57.4%,而GDNF+OEC联合治疗组恢复至损伤前的68.7%,12wk后达75%.结论:嗅鞘细胞(OEC)移植和rhGDNF对大鼠视神经不全损伤后视神经功能的恢复有明显的促进作用,二者联合治疗效果更显著.
关键词： 视神经 不全损伤 人重组胶质细胞源性神经营养因子 嗅鞘细胞 闪光视觉诱发电位 -
嗅鞘细胞在冻融的周围神经移植物中的存活及分布
目的:观察嗅鞘细胞在成年大鼠视神经眶内断端移植的冻融周围神经中存活、生长与分布随存活时间的变化及对视神经再生的影响.方法:取成年大鼠坐骨神经反复冻融后,自两端注入10μL嗅鞘细胞悬液(105/μL),再移植于同种异体动物经眶内切断的视神经眶内断端上,分别于术后2d;1,2,3及4wk取移植物,切片观察嗅鞘细胞在其中的存活、生长及分布,并计数术后3,4wk动物视网膜内经移植物远端以50g/L荧光金逆行标记的再生视网膜节细胞.结果:嗅鞘细胞自注射部位增殖并迁移至周围神经全段,2wk时数量达到高峰,3,4wk时仅见神经周边部位残存极少量嗅鞘细胞,且视网膜内未见任何轴突再生的视网膜节细胞.结论:嗅鞘细胞可在冻融周围神经移植物中存活2～3wk,神经周边部位较实质内更有利于嗅鞘细胞生长,这种移植物不能发挥促进视神经再生的作用.
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嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤的护理
1临床资料2004-07/2005-06我院施行嗅鞘细胞移植术治疗脊髓损伤30(男26,女4)例,年龄14～49岁,瘫痪卧床时间6 mo～9 a,均为外伤所致. 本组患者均符合手术适应证[1]: 脊髓损伤后时间超过6 mo,脊髓损伤部位没有压迫病变,脊髓没有横断性解剖断裂. 按美国脊髓损伤学会制定的评分标准[2],结果30例患者损伤的脊髓功能均有改善.
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人参皂甙Rb1对嗅鞘细胞生物学活性的影响
目的 探讨人参皂甙Rb1对嗅鞘细胞(OECs)增殖及神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质源性神经营养因子(GDNF)和神经细胞黏附分子(N-CAM)的表达和分泌等细胞生物学活性的影响,从而调节OECs对脊髓损伤的修复作用.方法 从成年SD大鼠嗅球取材获得OECs体外培养、纯化,四甲基偶氮噻唑(MTT)法测定人参皂甙Rb1在0,10,20,40,80 μg/ml浓度梯度下分别干预12,24,36,48,60 h对OECs增殖的影响,得出人参皂甙Rb1对OECs 作用的适浓度和干预时间,并以此适浓度和干预时间继续实验:细胞分成空白对照组和人参皂甙Rb1适浓度和干预时间组(人参皂甙Rb1组),RT-PCR检测两组细胞NGF、BDNF、GDNF及N-CAM的mRNA表达,ELLSA法检测两组培养上清液中NGF、BDNF及GDNF分泌量.结果 MTT结果显示,人参皂甙Rb1不同浓度均能促进OECs增殖,与0μg/ml比较,20 μg/ml作用48 h增殖效应达峰值[(0.648 ±0.019)∶(0.547 ±0.024)] (P ＜0.05).RT-PCR结果显示,人参皂甙Rb1组较对照组显著上调OECs NGF、BDNF、GDNF及N-CAM的mRNA表达[(0.620±0.011)∶ (0.180 ±0.011)、(0.511 ±0.090)∶ (0.293 ±0.051)、(0.343 ±0.042)∶ (0.064 ±0.005)、(0.839 ±0.017)∶(0.717 ±0.044)] (P ＜0.05).ELISA结果显示,人参皂甙Rb1组较对照组显著促进OECs NGF、BDNF及GDNF的分泌[(200.167 ±8.361)∶(51.467 ±3.815)、(156.700 ±4.190)∶(96.500±2.707)、(26.264±5.864)∶(4.917±10.894)] (P ＜0.05).结论 人参皂甙Rb1对OECs增殖及相关因子的表达和分泌等生物学活性具有显著促进作用,从而有利于脊髓损伤的修复.
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嗅鞘细胞联合甲基强的松龙对大鼠脊髓损伤区神经中丝表达的影响
目的 观察嗅鞘细胞(olfactory ensheating cells,OECs)移植联合甲基强的松龙(methyprednisolone,MP)对大鼠脊髓损伤区神经中丝(neurofilament,NF)mRNA及蛋白表达的影响,探讨OECs移植联合应用MP促进损伤脊髓修复的机制.方法 以NYU脊髓打击法建立大鼠急性T10脊髓损伤模型.按随机数字表法分为A组空白组10只;B组损伤组、C组DF12组、D组OECs组、E组MP组、F组OECs+MP组,各30只.于治疗后不同时相点,取各组大鼠损伤区脊髓应用免疫组织化学染色、反转录PCR和Western blot的方法检测NF mRNA及蛋白表达变化.结果 OECs组、MP组、OECs+MP组与损伤组、DF12组比较,术后7,14,28 d损伤区脊髓组织NFmRNA及蛋白表达显著升高(P＜0.05).OECs+MP组与OECs组、MP组比较,术后7,14,28d损伤区脊髓组织NF mRNA及蛋白表达显著升高(P＜0.05).结论 OECs移植或单纯应用MP可促进大鼠脊髓损伤区促轴突再生因子NFmRNA及蛋白表达,二者联合应用,可显著促进脊髓损伤区NF mRNA及蛋白表达,具有协同作用效果.此结果提示OECs+MP可调控NFmRNA及蛋白表达,且此调控作用可能是OECs+MP促进脊髓损伤修复的可能机制之一.
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嗅鞘细胞对脊髓源性神经干细胞分化的影响
目的探讨嗅鞘细胞对脊髓源性神经干细胞分化的作用. 方法应用Millicell插入式细胞培养皿,大鼠脊髓源性神经干细胞与嗅鞘细胞在无血清培养液中共培养,通过免疫化学染色方法,检测脊髓源性神经干细胞分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的比例. 结果共培养7 d后,脊髓源性神经干细胞分化为神经元的比例高达43.5%,明显高于对照组的21.4%. 结论嗅鞘细胞提供的微环境可促进脊髓源性神经干细胞分化为神经元.
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嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤的研究进展
来源于嗅觉系统的嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells，OECs)具有外周与中枢胶质细胞特性，能够终生促进哺乳动物嗅神经再生。动物实验表明，OECs 移植治疗脊髓损伤能促进受损的运动、呼吸等功能恢复[1]，且已在临床用于人类脊髓损伤的治疗。笔者就OECs生物学特性、OECs在脊髓损伤部位的迁移、促进轴索再生、提供神经营养、形成轴索髓鞘、OECs移植治疗脊髓损伤的安全性与可靠性、临床应用等方面的研究进展作一综述。
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移植修复脊髓损伤的研究现状及进展
脊髓是神经发挥作用的中介通路.脊髓损伤及其继发的病理生理效应可直接导致神经功能的丧失,造成组织器官功能的障碍,因而具有相当高的致残率和死亡率.到目前为止,虽然修复人类损伤脊髓仍然是一个非常棘手的难题,但动物实验中已取得的一些令人鼓舞的进展为损伤脊髓的修复带来了新的希望.近年来,在脊髓损伤的实验研究中,周围神经移植、雪旺细胞移植、嗅鞘细胞(OECs)移植、胚胎组织细胞移植、神经干细胞移植以及与基因治疗相接合的联合移植等已成为研究的热点.笔者就上述几种移植治疗研究的现状及其进展综述如下.
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嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤的研究现状
脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是一种严重威胁人类健康的疾病,由于损伤后可导致损伤平面以下的感觉、运动及植物神经功能障碍,给患者、家庭和社会带来沉重的负担.目前对脊髓损伤的实验研究主要集中在改善SCI的生长环境、组织移植、细胞移植等,能参与脊髓损伤神经细胞移植的细胞有神经膜细胞、嗅鞘细胞、少突胶质细胞和被周围神经激活的单核吞噬细胞等[1].
