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嗅鞘细胞静脉移植治疗陈旧性脊髓损伤的实验研究
目的：探讨嗅鞘细胞（OECs）静脉移植治疗陈旧性脊髓损伤的可行性以及疗效。方法制备 wistar 大鼠T10左侧脊髓半切损伤模型（不做任何处理，自行恢复1个月），大鼠的神经功能恢复变缓慢，进入平台期，并通过CBS 评分法，大鼠的评分在47分左右，随机分成3组（每组10只）：OECs 静脉移植组（A 组）、D/ F12细胞培养液静脉移植组（B 组）、空白对照组（C 组）。通过 CBS 评分法定期对大鼠的神经功能进行评价，通过组织形态学观察脊髓损伤部位组织的修复情况。结果 CBS 评分显示：从第2周开始在每个时间段 A 组与 B 组、C 组均有显著差异（P ＜0.05），B、C 组之间没有显著性差异（P ＞0.05）。镜下观察可见：A 组与 B 组、C 组有明显差别，A 组瘢痕组织小于 B 组和 C 组，可见神经纤维轴突再生，脊髓修复明显优于 B 组、C 组，B、C 组无明显差别。结论 OECs 静脉移植对陈旧性脊髓损伤修复有一定的疗效。此种移植方式既操作简单，又具有较好的疗效，并且可以重复多次进行，具有良好的临床推广和应用价值。
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不同剂量嗅鞘细胞静脉移植修复脊髓损伤的实验研究
目的：研究和探讨嗅鞘细胞静脉移植修复脊髓损伤的疗效与移植剂量的关系，探求较佳的静脉移植剂量。方法制备Wistar大鼠T10脊髓左侧半切模型，随机分成五组：嗅鞘细胞大剂量移植组（ A组）、嗅鞘细胞中剂量移植组（B组）、嗅鞘细胞小剂量移植组（C组）、培养液D/F12移植组（D组）、空白对照组（E组）。定期行大鼠神经功能评价及组织形态学观察，评价脊髓恢复情况。结果 A、B组神经功能恢复和组织学改变与C、D、E组有显著差别（P<0.05）；C组与D、E组间虽有差别（P<0.05），但是其差别较小；A、B组之间无显著差别（P>0.05）；D、E两组无显著差别（P>0.05）。结论嗅鞘细胞静脉移植对修复脊髓损伤有一定的疗效，其疗效与移植剂量在一定范围内存在正向关系。细胞移植的较佳剂量为2×106，低于此剂量则不能达到良好的疗效，多于此剂量，疗效无明显提高。此种移植方式既使操作简单容易，又具有较好的疗效，并且可以重复多次进行，具有良好的临床推广和应用价值。
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嗅鞘细胞联合血管内皮生长因子促进周围神经再生的实验研究
目的 探讨嗅鞘细胞(OECs)与血管内皮生长因子(VEGF)联合移植促进坐骨神经再生的协同作用.方法 取SD大鼠60只,随机分成4组,即生理盐水(CON)组、VEGF组、OECs组和VEGF+ OECs组.制作大鼠坐骨神经缺损模型,在再生室内分别注入CON、VEGF、OECs、VEGF+ OECs.术后观察各组大鼠一般状态,并于术后4周和12周在光镜、电镜下观察再生室神经再生情况,检测大鼠坐骨神经电生理情况等.结果 VEGF组、OECs组和VEGF+OECs组坐骨神经单位横断面有髓神经纤维计数及其直径,电生理检测结果及腓肠肌湿质量均高于CON组(P均＜0.05).VEGF+ OES组神经纤维的组织形态学优于VEGF、OECs组.结论 OECs移植联合VEGF对大鼠神经再生均有明显的促进作用,二者有协同作用.
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嗅鞘细胞移植治疗EAE的研究
目的探讨嗅鞘细胞(OECs)移植对实验性免疫性脑脊髓炎(EAE)的治疗作用.方法用新生wistar大鼠嗅球培养OECs.OECs移植组将OECs悬液注入EAE大鼠的侧脑室,假手术组注入等量生理盐水;观察两组大鼠运动功能评分、脑组织病理学变化及热休克蛋白70(HSP70)的表达.结果OECs移植组运动功能评分显著优于假手术组(P＜0.05);OECs移植组髓鞘修复明显优于假手术组;OECs移植组在各时间点上HSP70的表达均明显高于假手术组(P＜0.05).结论OECs移植可以促进EAE鼠的髓鞘修复,改善其运动功能,同时可使其脑组织HSP70大量表达,对损伤后的神经细胞有保护作用.
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嗅鞘细胞移植促进脑损伤大鼠神经功能恢复及其作用机制研究
目的 观察嗅鞘细胞移植对脑损伤大鼠神经功能恢复及神经元存活的影响并探讨其作用机制.方法 对经培养纯化的嗅鞘细胞作NGFRp75免疫细胞化学染色鉴定并制备移植用细胞悬液,部分细胞预作荧光标记用于移植后观察存活情况;24只SD大鼠平均分成3组:假手术无损伤组(A组),大鼠脑皮质运动区损伤组(B组),相同脑损伤后嗅鞘细胞移植组(C组);术后当天及第3,7,14天分别对各组动物进行神经功能缺损严重程度(NSS)评分;术后第14天取损伤部位组织作神经元核心抗原免疫组化(NeuN)检测并计数阳性细胞数量;数据采用SPSS17.0软件进行统计学分析.结果 (1)培养的嗅鞘细胞呈NGFRp75阳性,阳性率90%;(2)移植14d后核荧光标记的嗅鞘细胞在宿主体内存活良好;(3)术后第14天B组NSS评分为[(2.00±0.53)分],C组为[(1.25±0.46)分],明显优于B组(P<0.05);(4)NeuN阳性细胞计数B组为[(39.2±7.1)分],C组为[(45.8±6.0)分],明显优于B组(P<0.05).结论 嗅鞘细胞移植可明显促进脑损伤大鼠神经功能恢复,其机制可能与嗅鞘细胞促进宿主神经元存活有关.
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痿症方对嗅鞘细胞增殖影响的药效学研究
目的:探讨痿症方对嗅鞘细胞(Olfactory ensheathing cells OECs)增殖影响的血清药理学实验方法的建立.方法:采用MTT法检测各组给药剂量、采血时间、血清浓度的痿症方的血清培养大鼠OECs 9天后的OD值.结果:5倍剂量组(给药剂量),1小时组(采血时间)的OD值,与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05),各组培养血清浓度OD值10%组＞20%组＞5%组.结论:痿症方5倍剂量灌胃,末次给药1小时后腹主动脉采血,制备血清后,以 10%的浓度培养,能较好的促进大鼠OECs的增殖.
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嗅鞘细胞移植联合跑台训练抑制脊髓损伤大鼠慢性期瘢痕形成的机制
目的 探讨嗅鞘细胞移植联合跑台训练对脊髓损伤大鼠慢性期瘢痕形成的影响及作用机制.方法 40只成年SD大鼠随机分为假手术组、对照组、跑台组、细胞组、联合组各8只.对照组、跑台组、细胞组、联合组采用T10脊髓全横断法制备脊髓损伤模型,假手术组仅行椎板切除术、不损伤脊髓.术后第28天,跑台组给予跑台训练;细胞组硬脊膜注射嗅鞘细胞悬液;联合组于第1次跑台训练后硬脊膜注射嗅鞘细胞悬液;假手术组、对照组不进行任何干预.分别于术后第1、7、28、35、56天行BBB(Basso-Beasttie and Bresnahan,BBB)评分评估大鼠运动功能;术后第28、56天,各组分别处死2、6只大鼠,取脊髓组织行HE染色观察损伤局部组织空洞大小及瘢痕形成情况;术后第56天行免疫组织化学染色检测瘢痕区及损伤近端、远端神经丝蛋白200(neurofilament protein 200,NF200)表达,采用Western blot法检测NG2蛋白聚糖、神经型钙黏蛋白和β-连环蛋白表达.结果 术后第35、56天,BBB评分在假手术组(21.00±0.63、21.00±0.89)、联合组(13.80±0.98、18.80±1.17)、跑台组(12.60±1.02、16.80±1.47)、细胞组(9.80±0.75、12.00±0.63)、对照组(8.00±0.89、8.20±0.75)逐渐降低(P＜0.05);术后第28天,假手术组大鼠脊髓组织未出现损伤,对照组、细胞组、跑台组、联合组大鼠脊髓组织损伤区出现空洞及瘢痕,术后第56天损伤均加重,但细胞组、跑台组及联合组损伤程度较对照组轻,其中联合组损伤轻;术后第56天,脊髓损伤瘢痕区及损伤近端NF200表达在假手术组(195.64±5.19、194.42±4.55)、联合组(163.51±6.24、184.85±4.24)、跑台组(144.51±5.25、161.18±7.36)、细胞组(126.25±4.99、142.92±4.99)和对照组(104.01±5.35、117.01±4.42)逐渐下降(P＜0.05);5组损伤远端NF200表达比较差异无统计学意义(P＞0.05);术后第56天神经型钙黏蛋白和β-连环蛋白表达在联合组(0.28±0.01、0.25±0.01)、跑台组(0.22±0.01、0.20±0.02)、细胞组(0.14±0.01、0.17±0.01)逐渐下降(P＜0.05),且均高于对照组(0.09±0.01、0.09±0.01)和假手术组(0.10±0.01、0.10±0.01) (P＜0.05);术后第56天,NG2蛋白聚糖表达在假手术组(0.04±0.01)、联合组(0.11±0.01)、跑台组(0.15±0.01)、细胞组(0.22±0.02)和对照组(0.26±0.01)逐渐增高(P＜0.05).结论 跑台训练、嗅鞘细胞移植均可抑制脊髓损伤大鼠慢性瘢痕形成,促进神经突生长及脊髓损伤慢性期功能恢复,二者联合应用疗效更为明显.
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甲钴胺在脑性瘫痪患儿嗅鞘细胞移植治疗中的应用效果观察
目的 探讨甲钴胺在脑性瘫痪患儿嗅鞘细胞移植治疗中的疗效.方法 32例脑性瘫痪患儿随机分为2组,对照组予常规嗅鞘细胞移植治疗,观察组予甲钴胺+嗅鞘细胞移植治疗,应用小儿脑瘫粗大运动评价量表(GMFM-88)对患儿治疗前及治疗疗程结束4周后运动功能的肌力进行评估,应用改良Ashworth法评估患儿的肌张力,同时应用脑瘫日常生活活动能力量表(ADL)评价患儿日常生活活动能力.结果 治疗后2组GMFM-88评分、ADL评分均明显提高,小腿肌张力明显降低,且观察组GMFM-88评分、ADL评分明显高于对照组,小腿肌张力明显低于对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 嗅鞘细胞移植治疗小儿脑性瘫痪具有确切的疗效,同时联合应用甲钴胺可进一步改善患儿的运动功能及肌张力,提高日常生活活动能力.
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嗅鞘细胞在视网膜神经节细胞再生方面的研究进展
嗅鞘细胞起源于嗅基板,是包裹嗅神经的神经胶质细胞,能终身保持再生.大量实验研究显示嗅鞘细胞移植能够促进中枢神经轴突再生,为此本文复习了大量关于嗅鞘细胞的细胞来源、生物学特性以及与其他胶质细胞区别的文献,并对其在中枢神经系统损伤以及视网膜神经节细胞再生方面的研究现状进行综述.
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腺病毒介导睫状神经营养因子基因转染嗅鞘细胞移植治疗颅内段视神经损伤
目的 研究腺病毒介导睫状神经营养因子(CNTF)转染嗅鞘细胞移植对大鼠颅内段视神经损伤的修复作用.方法 构建额下显微外科入路大鼠颅内段视神经损伤动物模型并分组,观察损伤后不同时间点各组大鼠闪光视觉诱发电位(F-VEP)的改变,通过荧光金逆行标记的方法,检测损伤后不同时间点各组大鼠荧光金标记的视网膜神经节细胞(RGC)计数.结果 F-VEP检测显示大鼠伤后P1波振幅降低,峰潜时延长(P＜0.05),腺病毒介导CNTF转染嗅鞘细胞移植组较对照组波幅高,峰港时短(P＜0.01)；伤后腺病毒介导CNTF转染嗅鞘细胞移植组视网膜荧光金标记RGC计数较对照组明显增加(P＜0.01).结论 腺病毒介导CNTF转染嗅鞘细胞移植对大鼠颅内段视神经损伤后早期功能的恢复有明显的促进作用.
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不同时间嗅鞘细胞移植联合电针对大鼠脊髓损伤后Nestin表达的影响
目的 在不同时间点,应用嗅鞘细胞联合电针治疗脊髓损伤大鼠,观察脊髓巢蛋白(Nestin)阳性细胞的表达情况,确定佳的治疗“时间窗”.方法 将大鼠分为对照组、模型组、嗅鞘细胞联合电针治疗组(按不同时间点分为:立即移植组、3天后移植组、7天后移植组),分别按相应时间点移植入培养好的嗅鞘细胞,电针干预时间同嗅鞘细胞移植时刻,2周后,取各组大鼠损伤节段脊髓,进行免疫组织化学检测,观察各组巢蛋白阳性细胞的表达情况.并对损伤区域进行HE染色,观察脊髓损伤1周内局部区域的病理结构的改变过程,以及各组脊髓损伤后8周的脊髓的修复情况.采用改良Rivlin斜板试验和脊髓运动功能BBB评分法对各组大鼠脊髓损伤后的行为及后肢运动功能进行评定.对各组实验结果进行统计学分析.结果 7天组8周后HE染色、巢蛋白阳性细胞、BBB评分、斜板实验结果显示:7天组均优于其他各组.结论 大鼠脊髓损伤7天后应用OECs联合电针治疗,优于立即和3天后应用OECs联合电针治疗.
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低功率半导体激光照射对体外培养嗅鞘细胞的影响
目的 研究低功率810 nm半导体激光对体外培养嗅黏膜嗅鞘细胞增殖的影响.方法 取成年SD大鼠嗅黏膜,采用差速贴壁法获得嗅鞘细胞,对细胞进行不同功率密度的半导体激光照射,波长为810 nm,在10.3 mW/cm2功率密度下分别照射30,60,120 s,每日1次,连续3 d,各次间隔24 h.后一次照射后细胞培养.主细胞培养第3,5,8天时采用细胞计数法和四氮唑蓝(MTT)法分别检测照射后不同时间细胞增殖的变化.结果 后一次照射后细胞培养第3天时,不同时间照射组和对照组细胞增殖无差异.细胞培养第5天和第8天时,不同时间照射组细胞数均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);60 s和120 s照射组OD值高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);但30 s照射组OD值与对照组差异无统计学意义.其中以60 s照射组细胞增殖为明显.结论 低功率半导体激光对体外培养嗅黏膜嗅鞘细胞的增殖有促进作用,其作用与照射的时间剂量有关.佳照射时间是每日1次,连续3 d,各次间隔24 h.
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细胞外基质凝胶支架与嗅鞘细胞体外生物相容性的研究
目的:体外研究细胞外基质凝胶支架与新生大鼠嗅鞘细胞的生物相容性.方法:利用自备的细胞外基质凝胶支架分别建立二维与三维的培养体系,通过免疫荧光技术、倒置相差显微镜观察和MTT法研究嗅鞘细胞在ECM凝胶支架中的形态特点、生长与增殖的情况.结果:本实验观察到在2种培养体系中嗅鞘细胞均生长良好,尤其在三维培养体系中细胞密度和胞体体积大于对照组,支架内嗅鞘细胞与对照组相比展现了更好的形态特征.MTT法检测二维培养体系中实验组与对照组的吸光度值,两者无明显差异(P＞0.05).结论:体外ECM凝胶支架与嗅鞘细胞有良好的生物相容性,由两者构成的三维结构和生物活性的复合体有可能应用于神经组织工程.
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人鼻腔嗅粘膜嗅鞘细胞的原代培养和免疫组化观察
目的 建立人鼻腔嗅粘膜嗅鞘细胞(OECs)的体外培养方法. 方法 利用鼻窦镜选取上鼻甲嗅区粘膜,原代培养嗅鞘细胞,进行形态学观察. 结果 成功培养出人鼻腔嗅粘膜OECs,为扁平的双极、多极形态,对P75、GFAP呈阳性反应,纯度在5%左右. 结论 人鼻腔嗅粘膜培养OECs的方法实用可行,但须在取材部位和纯化方面进一步探讨.
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不同来源嗅鞘细胞的生长特性和生物学活性观察
目的 探讨来源于乳鼠嗅球与成年大鼠嗅粘膜嗅鞘细胞(OECs)生长特性和生物学活性的区别,为临床应用不同来源OECs提供理论支持.方法 选取成年SD大鼠嗅粘膜和乳鼠嗅球的OECs,通过原代培养,在不同时间观察细胞形态和生长趋势,测定培养细胞上清中神经营养因子-Ⅲ(NT-3)的含量.结果 培养出相应OECs,同时期源自乳鼠嗅球OECs细胞活性高于嗅粘膜OECs,进入平台期后二者生物学活性一致.结论 不同来源的OECs生长特性有差别,但其生物学活性一致.
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人参皂甙Rg1促进嗅鞘细胞修复脊髓损伤的研究
目的 观察人参皂甙Rg1对嗅鞘细胞(OECs)移植修复脊髓损伤能力的影响.方法 新生SD大鼠嗅球组织体外培养、纯化OECs,人参皂甙Rg1干预并设置对照,Allen打击建立大鼠脊髓损伤模型,随机分成3组:对照组(Con组)、OECs移植组(OECs组)和Rg1干预OECs移植组(Rg1+OECs组),于移植后第1、3、7、14、28天分别进行肢体活动大鼠脊髓损伤[Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)]评分,并于第28天取损伤部位脊髓组织制作石蜡切片进行免疫组织化学检测;反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分别测定OECs组和Rg1+ OECs组脊髓组织中睫状神经营养因子(CNTF)和血管内皮生长因子(VEGF)的mRNA表达.结果 Rg1+ OECs组大鼠后肢运动恢复情况优于OECs组和对照组[(15.0 ±1.0)、(12.0±2.0)、(7.4±0.9)分,P＜0.05],组织切片示Rg1+ OECs组神经元数量明显高于OECs组和对照组[(64±3)、(38±2)、(26±2)个,P＜0.01],胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达量(以GFAP染色阳性细胞平均积分吸光度值作为检测指标)显著低于OECs组和对照组(8.65±0.32、4.93±0.25、2.21±0.17,P＜0.01),苏木素-伊红(HE)染色示Rg1+ OECs组脊髓组织结构清晰,囊性病变及细胞水肿坏死数量明显少于其他各组;RT-PCR结果显示人参皂甙Rg1显著上调OECs在移植宿主体内CNTF、VEGF mRNA表达(0.78±0.03、0.39±0.03;0.86±0.03、0.61±0.02,P＜0.05).结论 人参皂甙Rg1能够通过上调OECs在宿主体内CNTF、VEGF的表达,提高OECs移植修复脊髓损伤的能力.
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嗅鞘细胞对神经干细胞增殖分化的影响
目的研究嗅鞘细胞(OECs)和神经干细胞(NSCs)分别及共培养的相互作用,为CNS神经损伤修复提供移植的理论依据.方法分离培养NSCs和OECs,在无血清DMEM/F12液中NSCs和OECs共培养,用免疫细胞化学和激光共聚焦显微术来分析结果.结果共培养7 d观察OECs能促进NSCs增殖分化,分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,其中神经元比例高达78.2%.结论 OECs可促进NSCs的增殖分化,其分化的神经元比例高.
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人嗅鞘细胞的免疫学特性研究
目的探讨人嗅鞘细胞的免疫学特征.方法应用流式细胞仪分析人嗅鞘细胞的相应标记抗原的阳性表达率,用单向混合淋巴细胞反应测定人嗅鞘细胞的组织相容性和免疫耐受性,并与骨髓间充质干细胞对比.结果人嗅鞘细胞与骨髓间充质干细胞表面与移植免疫排斥发生密切相关的标志:HLA-DR、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD40和CD40L均为阴性.单向混合淋巴细胞反应显示人嗅鞘细胞、骨髓间充质干细胞均对混合淋巴细胞反应无明显的刺激作用.结论人嗅鞘细胞可能是一种免疫缺陷细胞,在体外有诱导细胞移植免疫耐受性的作用.
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人胚嗅鞘细胞不同取材及培养方法对纯度的影响
目的通过对多种方法的比较获得较为理想的取材和纯化嗅鞘细胞的措施.方法应用3种不同的取材方法各获取20份样本,对取材引起的细胞损伤以及同一条件下培养10 d后细胞纯度进行对照;在将细胞接种密度统一调整到106/ml后应用3种纯化方法各对20份样本处理并作纯度比较;同样密度和接种数量的原代细胞各取10份种植于3种不同培养皿,对细胞贴壁速度和终纯度进行检验;对3种常用的细胞接种密度104/ml、105/ml、106/ml统一其他培养条件后作比较.结果我们从中筛选出佳取材方法为直接挤压法,其获得的细胞纯度为82.56%,明显高于传统分离法(66.24%)和机械过滤法(61.35%);好的纯化嗅鞘细胞方法为免疫吸附法,其细胞纯度达到94.66%,而差速贴壁法(81.59%)和化学试剂法(76.45%)均由于损失细胞太多不可取;同时发现包被培养皿对纯化细胞意义重大,P75包被组不仅培养细胞的纯度高(87.69%),而且还有利于OECS的快速贴壁;高密度接种细胞对提高细胞的终纯度也是非常有利,3组(接种密度分别为104/ml、105/ml、106/ml)培养10 d后的p75阳性细胞率差异巨大,分别为34.61%,49.39%,71.55%.结论应用佳取材及培养方法收获大量嗅鞘细胞将对其进一步的基础研究以及将来应用于临床奠定基础.
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剪切分散法提取嗅鞘细胞及其三步顺序法纯化培养
嗅鞘细胞(OECs)移植是治疗脊髓损伤有前景的方法之一,近年来成为研究热点.传统OECs的提取需经胰酶消化、洗涤离心等多道步骤,过程繁琐、耗时,易造成细胞损伤、活力下降~([1]).OECs的纯化也是难点,目前尚无统一的标准~([1]).本实验旨在建立剪切分散法提取OECs及低浓度胰酶有限消化、短时差速贴壁、抗有丝分裂三步顺序法纯化细胞.
