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冠心病气虚血瘀证的蛋白质组学特征研究
目的 应用高解析离子淌度质谱与纳升级超高效液相色谱联用新技术(LC-MSE),寻找冠心病不稳定性心绞痛气虚血瘀证的血浆特征分子,探索冠心病不稳定性心绞痛气虚血瘀证在蛋白质组学层面的特征.方法 采用美国Agilent公司多克隆抗体亲和柱去除冠心病不稳定性心绞痛气虚血瘀证、非气虚血瘀证患者和健康人血浆中6种丰度高的蛋白后,进行LC-MSE分析.结果 初步发现肌动蛋白(Actin)仅在冠心病不稳定性心绞痛气虚血瘀证患者血浆中表达;纤维连接蛋白(FN)、栽脂蛋白H(ApoH)、膜联蛋白(ANXA6)仅在冠心痛不稳定性心绞痛气虚血瘀证患者中高表达.此外,与健康人比较,血清淀粉样蛋白(SAA)、铜蓝蛋白(CP)、肌球蛋白H11(MYH11)及补体C6在冠心病不稳定性心绞痛气虚血瘀证患者中高表达;载脂蛋白A4(ApoA4)、凝溶胶蛋白(GSM)、血红蛋白B(HBB)及转铁蛋白(TF)等6种蛋白在冠心病不稳定性心绞痛气虚血瘀证患者中低表达.结论 冠心病不稳定性心绞痛气虚血瘀证可能属于一种炎症反应;冠心病不稳定性心绞痛气虚血瘀证患者可能同时存在心肌损伤、凝血因子异常、脂代谢紊乱与氧运输障碍;这些方面相互影响,互为因果.新发现的差异蛋白可能为研究或发现抗心绞痛药物作用的新靶标提供线索.这种非标记定量蛋白质组学新技术是疾病及证候生物标志物研究的有效手段.
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缺血性心肌病心力衰竭气虚血瘀证患者特异性血清标志物研究
目的 探讨缺血性心肌病心力衰竭气虚血瘀证患者标志性的差异多肽,寻找其特异性血清标志物.方法 收集缺血性心肌病心力衰竭气虚血瘀证患者30例(观察组)以及健康体检者20例(正常对照组)的血清标本,通过特异的液体磁珠分选后,进行基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析得到缺血性心肌病心力衰竭气虚血瘀证患者的血清多肽谱,采用生物信息学分析软件Clinprot tools2.1,运用不同统计学方法进行差异分析,建立缺血性心肌病心力衰竭气虚血瘀证患者诊断的血清多肽谱模型.结果 观察组和正常对照组差异表达的蛋白峰有47个,筛选佳标志物共得出5个峰用来建模型,其中1866.17Da、7761.49Da、1848.81Da、2037.57Da在观察组低表达,2660.54Da在观察组高表达;进一步通过多肽氨基酸序列库查询这5种蛋白峰,共得到3种肽段的氨基酸序列,分别是补体C3 f、纤维蛋白原和热休克蛋白60.结论 补体C3 f、纤维蛋白原和热休克蛋白60是缺血性心肌病心力衰竭气虚血瘀证患者特异标志物.
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健胃愈疡颗粒对乙酸性胃溃疡复发大鼠作用的蛋白质组学研究
目的 分析健胃愈疡颗粒(JWYY)对乙酸性胃溃疡复发大鼠蛋白质表达谱的影响,寻找JWYY抗胃溃疡复发作用的相关蛋白.方法 采用二维凝胶电泳(2-DE)分离JWYY处理组和JWYY未处理组大鼠胃组织的总蛋白,图像分析识别差异表达的蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱得到相应的肽质量指纹图,NCBInr及SWISS-PROT数据库搜索鉴定蛋白质.结果 所获2-DE图谱分辨率高、重复性好,质谱分析共鉴定了12个差异蛋白质点,其中JWYY处理组有8个蛋白质点表达上调,4个蛋白质点表达下调,大多数蛋白与溃疡复发的形成、生长、凋亡及免疫等环节相关.结论 JWYY抗胃溃疡复发作用可能与多种蛋白直接或间接相关,这些蛋白质的鉴定及进一步研究有助于抗溃疡复发药物新型靶标的发现.
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质谱在生命科学领域中的应用进展
近年来,质谱在生命科学领域中被广泛应用且发展迅速,涉及了多个学科.质谱兼有高灵敏度、高准确度、快速、易于自动化等特点,较之传统分析方法有较大优势.本文综述了近几年来质谱在核酸,小分子、大分子化合物,微生物检测,药物分析等生命科学领域中的新应用进展以及发展前景.
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全降解冠脉雷帕霉素洗脱支架系统有机溶剂残留分析
目的：采用顶空进样-气相色谱-质谱联用法（ headspace sampling-gas chromatography-mass spectrometry，HS-GC-MS）测试全降解冠脉雷帕霉素洗脱支架系统有机溶剂残留的情况，终建立顶空进样-气相色谱-氢火焰离子化检测器（ headspace sampling-gas chromatography-flame ionization detector， HS-GC-FID）定量测定丙酮残留量的检测方法。方法采用 HS-GC-MS，全扫描模式对全降解支架系统中的含药支架、球囊、输送系统、支架原料及裸支架5种被测对象进行残留有机溶剂的定性分析，并采用HS-GC-FID 对其中残留较多的丙酮进行了定量分析。结果5种被测对象中均有多种有机溶剂残留，主要为芳香烃类（甲苯）、酮类（丙酮）、卤化烃类（二氯甲烷、三氯甲烷）、醇类（乙醇等）、酯类（乙酸乙酯等）。丙酮在9.0~44.8μg / mL 浓度范围内线性良好，相关系数为0.9995，平均加样回收率为100.3%（n =6，RSD =1.2%），精密度为2.0%（n =5）。结论新产品注册检测含药支架有机溶剂残留的同时，建议考察支架原料、裸支架的有机溶剂残留。建立的定量检测方法简便、快速、准确，可用于全降解支架系统中残留有机溶剂的检测与质量控制。
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与PIH1D1相互作用的蛋白分析
目的 分析细胞中与PIH1D1相互作用的蛋白.方法 构建稳定表达FLAG-HA双标签标记的PIH1D1蛋白的HEK293T细胞株,利用FLAG-HA串联亲和纯化(TAP)双标签纯化实验,对目的条带进行质谱分析.结果 成功构建稳定表达FLAG-HA双标签标记的PIH1D1细胞株.通过质谱分析得到了PIH1D1相互作用的蛋白数据,包括细胞质内RNA PolⅡ组装复合物成员RPAP3、UXT、PFD2和PFD6等,凋亡复合物成员MONAD/WDR92等,钙调蛋白信号通路中的PIP和CALM1以及代谢通路中的PKM和LCN1等.结论 PIH1D1与细胞中RPAP3、UXT、PFD2、PFD6、MONAD/WDR92、PIP、CALM1、PKM和LCN1等相互作用,提示PIH1D1可能参与细胞中RNApol Ⅱ组装、细胞凋亡、钙调蛋白通路等多种生理过程.
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SELDI蛋白质芯片筛选差异蛋白分子的二级鉴定
目的 探讨以SELDI蛋白质芯片筛选后的细胞差异表达蛋白的分离和鉴定方法及其意义.方法 以经体外培养及10 μmol/L褪黑素药物干预的内皮祖细胞差异表达蛋白质为研究对象,分别采用Tricine-SDS-PAGE和双向凝胶电泳方法进行差异蛋白分离及结果比较,以FT-MS二级质谱鉴定.结果 经Tricine-SDS-PAGE分离后,选取分子量为53 ku左右的趋势性差异表达蛋白进行FT-MS分析,质谱鉴定为微管蛋白-α3(吻合度评分为87).经双向凝胶电泳分离后,于凝胶近酸性端、分子质量在72 ～95 ku之间区域,选取蛋白表达量较高的一点,质谱鉴定其为人热休克蛋白90-α(吻合度评分为91).结论 Tricine-SDS-PAGE对于大致35～62 ku范围的蛋白分离较清晰、重复性好且样品用量少,2-DE对低上样量有较严格要求,但它能提供分子质量、等电点双重参数来更准确定位所感兴趣蛋白点,且对大分子质量蛋白的分离效果更佳,经质谱鉴定结果理想.
关键词： SELDI Tricine-SDS-PAGE 双向凝胶电泳 质谱 -
血液蛋白质组与质谱仪检测流程标准化初探
目的 探讨不同的标本处理和储存条件对蛋白指纹图谱技术检测血清多肽及低分子量蛋白质(1～30 ku)的影响.方法 将血液凝固后马上分离得到的血清分装后分别置于-80 ℃ 6个月以上以及室温、4 ℃条件下2～72 h进行蛋白质质谱分析.结果 血清样本在-80 ℃6个月以上以及4 ℃或者25 ℃保存2 h或者反复冻溶1次,对多肽及低分子量蛋白质的影响相对较小.将血清用U9缓冲液稀释后放置于室温,在24 h内结果稳定.溶血会对蛋白质组的结果造成很大影响.结论 建议血液标本的处理、运送、操作及储存的蛋白质质谱分析的标准条件是:4 ℃下处理血液标本,2 h内尽快分离血清及细胞.用U9缓冲液稀释血清后,可以24 h内在室温下运送或对血清及WCX磁珠结合过程进行操作.血清应分装并长期储存在-80 ℃,但限冻溶1次.溶血标本应弃用,建议重新取血.
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癌胚抗原阴性的结直肠癌检测和结直肠癌预后相关生物标记
目的 探讨结直肠癌的发生、发展过程中患者血清质谱多肽蛋白图谱的变化, 筛选与结直肠癌预后及癌胚抗原(CEA)阴性检测相关的肿瘤标记分子.方法 用蛋白指纹图谱技术检测结直肠癌,结直肠管状腺瘤患者和健康者血清质谱多肽蛋白图谱.结果 初步筛选出对结直肠癌有代表性的7个差异蛋白;2个与其淋巴结转移相关的差异蛋白;4个与其远处转移相关的差异蛋白;3个在其根治性切除后表达下降的差异蛋白;而由3398.3 u、5477.1 u和8453.9 u组成的诊断模型对CEA阴性表达结直肠癌的阳性检测率为100%.结论 蛋白指纹图谱技术可筛选出有意义的生物标记差异蛋白,这对结直肠癌预后判断、CEA阴性的结直肠癌检测和改变结直肠癌的进程具有重要意义.
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蛋白质组学研究方法及其在生物医学中的应用
蛋白质组学方法发展迅速,并日见成熟.蛋白芯片技术、双向电泳-质谱技术、多维液相色谱-质谱技术等,已被广泛应用于寻找疾病相关的差异表达蛋白质、疾病相关的生物标记分子以及药物靶点用于临床诊断、药物设计、以及疾病发病机理的研究等.本文对上述研究进展作了简要综述.
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糖蛋白质组研究进展
糖蛋白质组学作为蛋白质组学的一个重要分支,是目前蛋白质组学领域中的热点.本文就糖蛋白分类及研究现状、糖蛋白/糖肽富集方法、糖蛋白/糖肽鉴定技术及糖蛋白质组学的应用作了简要概述.
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蛋白质组学技术在泛素-蛋白酶体系统研究中的应用
泛素-蛋白酶体系统(ubituitin-proteasome system,UPS)是一条高效的、具有选择性并依赖能量的蛋白降解途径.目前应用蛋白质组学技术的重要研究工具之一质谱(mass spectrometry,MS)技术研究UPS系统还处于起步阶段.本综述主要介绍了应用蛋白质组学技术研究UPS系统的研究现状以及存在的问题.
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二维电泳和质谱技术鉴定肝细胞癌相关N-连接糖蛋白
目的 鉴定与肝细胞癌(HCC)发生发展相关的差异表达N-连接糖蛋白.方法 采用刀豆凝集素A(ConA)、晶状体凝集素(LCH)、雪花凝集素(GNA)等3种植物凝集素组成的亲和层析柱,分别从肝永生化细胞系L02和HCC细胞系Huh7、PLC5、SNU449中纯化N-连接糖蛋白、二维电泳分析差异表达的蛋白质斑点,质谱、生物信息学等技术鉴定差异表达蛋白,Western blotting验证了转录调控肿瘤蛋白(TCTP)、上皮细胞黏附分子(EpCAM)和膜联蛋白A2(annexin A2)在肝永生化及HCC细胞和HCC及癌旁组织中的表达规律,体外侵袭实验检测TCTP沉默后对SNU449的侵袭力影响.结果 质谱、生物信息学等技术共鉴定出42个差异表达的蛋白质分子/异质体(HCC细胞中高、低表达的蛋白/异质体分别为14个、28个),代表32个蛋白质分子,其中的22个蛋白含有至少1个N糖基化位点(NetNGlyc l.0预测).这些差异表达的蛋白主要参与氧化还原内稳态维系、碳水化合物/能量代谢、糖酵解、抗凋亡等生物学过程.Western blotting检测表明,TCTP、EpCAM和annexin A2在6个肝癌细胞系PLC5、HepG2、SNU449、Huh7、HCC7721和SNU473及肝癌组织中表达显著升高,siRNA介导的TCTP沉默明显抑制了HCC细胞系SNU449的体外侵袭能力.结论 TCTP、EpCAM和annexin可能参与了HCC发生发展过程,TCTP可能成为HCC靶向治疗的分子靶点之一.
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肝细胞癌中差异表达 N-连接糖蛋白的分析鉴定
目的：分析鉴定与肝细胞癌（ HCC）发生发展相关的差异表达的N-连接糖蛋白。方法应用刀豆蛋白凝集素（ConA）、晶状体凝集素（LCH）和雪花凝集素（GNA）组成的亲合层析柱富集10对HCC和癌旁非癌组织中N-连接糖蛋白、二维电泳（2DE）比较分析差异表达的蛋白质点、串联质谱鉴定差异表达蛋白，Western blotting 验证人羧酸酯酶1（hCE1）、触珠蛋白（HP）及组织蛋白酶D（CD）的差异表达；体外侵袭实验检测CD表达沉默后对HCC的侵袭力影响。结果质谱、生物信息学等技术鉴定了28个与HCC相关的差异表达蛋白（ HCC中高表达和低表达的蛋白均为14个），Western blotting验证hCE1、HP在HCC中明显低表达，组织蛋白酶D前体（ pCD）在HCC中高表达；而ConA亲和层析柱富集的ConA-CD在HCC中显著高表达。 CD-siRNA介导的CD表达沉默能够显著降低肝癌细胞系SNU449、SNU473的体外侵袭能力。结论 HP、hCE1蛋白表达变化和CD N-糖链变异可能参与了HCC发生发展过程。
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蟑螂变应原Cr-PI包涵体的变复性研究
本研究优化了GST-Cr PI融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达条件和GST-Cr PI包涵体的复性条件;采用Glutathione SepharoseTM 4B亲和层析分离纯化融合蛋白,以Xa酶切去掉其GST标签后,对Cr PI进行了电喷雾电离串联质谱分析(ESI-MS/MS).结果表明,IPTG浓度对该蛋白的诱导效果影响不大,OD600值为0.6时诱导效果佳;复性蛋白浓度和L-精氨酸浓度对稀释复性结果有重要影响.纯化融合蛋白经Xa酶切、分子筛层析去掉GST标签后,重组蛋白的纯度达95%,经质谱进一步鉴定为蟑螂Cr PJ变应原.
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蛋白质组学技术及其在心血管疾病研究中的应用
蛋白质组学是旨在研究蛋白质表达谱和蛋白质与蛋白质之间相互作用的新的领域.蛋白质组学的研究必须依赖高通量、自动化程度很高的技术.双向电泳、液相色谱和生物质谱技术的发展推动了蛋白质组学的研究.蛋白质组学为疾病发病机制的研究提供了新的思路和方法,本文重点介绍了蛋白质组学技术在心血管疾病研究中的应用.
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蛋白质组学技术在感染研究中的应用
蛋白质组学的目标在于阐明特定生物体、组织、细胞或亚细胞结构中全部蛋白质的表达模式和功能模式,其技术平台由高通量的蛋白质分离技术、鉴定技术和生物信息学组成.在许多研究领域,蛋白质组学技术为阐明疾病过程和生命现象的分子机制提供了全面、网络和动态的蛋白质组信息.感染是重要的基本致病因素之一,蛋白质组学的研究策略和技术方法有利于快速分离鉴定病原体蛋白质组、宿主免疫细胞蛋白质组、感染相关蛋白、疫苗候选抗原蛋白、生物标志物和药物靶标,从而明显加快病原体、宿主反应、感染发病机制以及感染预防、诊断和治疗等相关研究的进程.
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蛋白质组中蛋白质磷酸化研究进展
随着后基因组时代的到来,对生命体器官、组织或细胞的全部蛋白质的表达、修饰及相互作用的研究已成为蛋白质组学的重要任务.蛋白质磷酸化是细胞内信号转导和酶调控常见的机制之一,人类基因组约2%的基因编码500种激酶和100种磷酸酶.蛋白质磷酸化和去磷酸化作为原核和真核细胞表达调控的关键环节,了解其对功能的影响可以深入理解生命系统在分子水平的调控状况.目前蛋白质组磷酸化研究仍是功能基因组面临的重大课题,本文对此作一综述.
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慢性弓形虫感染大鼠脊髓组织蛋白质的双向电泳分析和质谱鉴定
目的 观察慢性弓形虫感染大鼠脊髓蛋白质组的变化与差异表达,为探讨慢性弓形虫感染对脊髓损伤的分子机制奠定基础. 方法 将6只SD雄性大鼠随机分为对照组和感染组,每组3只.感染组每鼠腹腔感染纯化的RH株弓形虫速殖子107/ml×2 ml,对照组每鼠腹腔注射灭菌生理盐水2 ml.大鼠感染弓形虫10周后解剖,采用双向凝胶电泳分离脊髓总蛋白,经考马斯亮蓝染色后用Image Master图象分析系统分析,从胶中选取分离蛋白质点,通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析获取肽质量指纹图谱(PMF),采用Mascot软件搜索MSDP、SWISS2PROT数据库鉴定蛋白质. 结果 慢性弓形虫感染大鼠和正常对照组大鼠脊髓蛋白斑点数分别检出(268±13)个和(301±15)个,对2张电泳图进行匹配后发现有7个蛋白斑点在2组大鼠脊髓组织中的含量发生了3倍以上的变化,有差异的7个蛋白斑点经质谱鉴定的数据检索发现3个差异表达蛋白质,分别为甘油三磷酸脱氢酶(similar to glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、含缬酪肽蛋白(valosin-containing protein)和类肌动蛋白[cytoplasmic 2(Gamma-actin)]. 结论 慢性弓形虫感染对大鼠脊髓神经的损伤机制可能与能量代谢受阻和细胞增殖有关.蛋白差异点有可能成为慢性弓形虫感染的治疗靶点.
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应用蛋白质组学方法研究低剂量辐射对人骨髓间充质干细胞的影响
本研究应用蛋白质组学方法探讨低剂量辐射对人骨髓间充质干细胞的影响.利用双向凝胶电泳建立低剂量照射组与假照组人骨髓问充质干细胞组蛋白质组二维凝胶电泳图谱,利用MALDI-TOF-MS生物质谱对差异表达的蛋白质进行鉴定分析.结果发现,低剂量照射后人骨髓间充质干细胞中表达上调的蛋白有12个,表达下调的蛋白有12个,消失的蛋白有3个.质谱鉴定出12个差异蛋白.结论:鉴定出的12种蛋白,其中某些蛋白如脯氨酰羟化酶、二氢嘧啶酶、ARP3放射相关蛋白、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白、磷酸甘油酸变位酶等可能与低剂量辐射作用机制相关,本研究为低剂量辐射对造血系统的作用机制提出了一些新的认识.
