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不同时间基因转染对兔下颌骨牵引区BMP-2表达的影响
目的 探讨于不同时间体内转染重组质粒人形态蛋白-2和人血管内皮生长因子-165真核细胞共表达载体(pIRES-hBMP2-VEGF165)对兔下颌骨牵引区骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)表达的影响.方法 48只新西兰大白兔随机分为A、B、C、D4组,均于双侧下颌骨截骨后置入内置式下颌骨牵引器,经过3d潜伏期后开始牵引,牵引速度0.8 mm/d,连续牵引10d进入固定期.A、B、C组动物分别于术后立即、术后3和14d,在双侧牵引区注射2μg(0.1 μg/μl)重组质粒pIRES-hVEGF165-hBMP2.D组不进行基因转染,4组动物均施加电穿孔刺激.各组动物分别于注射后固定l、2、4周处死,取材行免疫组化检测新生骨中BMP-2的表达情况,并应用CMIAS系列多功能真彩色病理图像分析系统定量分析.结果 BMP-2在牵引区肉芽组织中的炎性细胞如单核细胞、成纤维细胞,以及少量沿牵张方向排列的新生幼稚骨小梁表面的成骨细胞、骨细胞和骨周围结缔组织中表达.固定1和2周,B组阳性表达蛋白平均吸光度(MA)值和积分吸光度(IA)值,B组(0.58 ±0.03和0.34±0.02),与A组(0.42±0.02和0.31 ±0.01)、C组(0.32±0.01和0.30±0.01)、D组(0.27±0.01和0.23 ±0.02)比较,差异有统计学意义(P＜0.05);A组(0.42±0.02和0.31 ±0.01)、C组(0.32±0.01和0.30±0.01)与D组(0.27 ±0.01和0.23±0.02)比较,差异也有统计学意义(P＜0.05);固定4周时A、B、C、D各组BMP-2表达均减弱,组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 在牵引开始时进行基因转染更能促进牵引过程中BMP-2的表达,从而刺激牵引区骨基质合成和诱导成纤维细胞、成骨细胞、血管内皮细胞、骨细胞等的增殖分化,更能有效地促进骨的生长和修复,提示牵引开始时转染可能是基因转染的佳时间.
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电穿孔介导的基因治疗兔下颌骨牵引成骨模型的建立
目的 探讨电穿孔技术介导的重组质粒体内转染兔下颌骨牵引成骨的可行性.方法 以新西兰大白兔为实验动物模型,于术后3 d开始下颌骨牵引,每天0.8 mm,连续牵引7 d后,将实验动物分为3组:质粒+电穿孔组(A组),质粒组(B组),生理盐水组+电穿孔组(C组).各组动物分别于注射后3 h及1、3、7、14 d处死,切取牵引区组织0.4 cm×0.4 cm行冰冻切片检查,采用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)表达以检测外源基因的表达.检测兔血清肝功能指标丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)和肾功能指标尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)和心、肝、肾组织学检查.结果 A组转染新西兰大白兔,3 h可观察到GFP的表达,1 d时GFP的表达增强,3 d时GFP的表达强,其后开始逐渐下降,7 d后GFP的表达减少,14 d仍可观察到微弱GFP的表达.B组的GFP的表达时限与A组相同,但各时相点的GFP的表达强度明显弱于A组,C组在各时间段均未观察到GFP的表达.3组肝、肾功能指标两两比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 电穿孔技术介导的带有荧光标记的重组质粒体内转染,可在兔下颌骨牵引区组织内表达,电穿孔能明显提高重组质粒的体内转染效率,提示电穿孔技术介导的重组质粒体内转染兔下颌骨牵引成骨的动物模型是可行的,用于体内试验是安全的.
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电穿孔介导的基因治疗对兔下颌骨牵引过程中细胞周期蛋白表达的影响
目的 探索电穿孔介导的基因治疗对兔下颌骨牵引成骨过程中细胞周期调节蛋白表达的影响。方法 45只新西兰大白兔，双侧下颌骨截骨后3d开始以0.8 mm/d速度行下颌骨牵引，连续牵引7d后，随机分为A、B、C、D、E5组，每组9只，分别在牵引区注射2μg（0.1 μg/μ1）重组质粒plRES-hVEGF165-hBMP2、pIRES-hBMP2、plRES-hVEGF165、空质粒pIRES和相同剂量的生理盐水后，均施加电穿孔刺激。各组分别于固定期第7、14、28天处死动物取材，行免疫组织化学检查细胞周期蛋白Cyclins A、D1、E的表达情况，并利用CMIAS-2001A病理图像分析系统分析，结果采用单因素方差分析和q检验。结果 Cyclin A、D1、E主要在肉芽组织中的炎性细胞如单核细胞、成纤维细胞及少量沿牵张方向排列的新生幼稚骨小梁表面的成骨细胞、骨细胞和骨周围结缔组织中表达；固定7d时表达强烈，14 d下降，28 d时表达较弱。图像分析结果显示，固定7d时C组阳性表达蛋白的吸光度A值(0.59 +0.14)表达较强，与A(0.41±0.13)、B(0.38 +0.14)、D(0.34±0.12)、E(0.31 +0.10)组比较差异有统计学意义(P ＜0.05，P＜0.01)；A、B组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)，但与D、E组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；固定14 d和28 d时，A(0.39±0.11)、B(0.34±0.10)、C(0.33 +0.09)组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)，但与D(0.19±0.12)、E(0.14 +0.04)组比较差异有统计学意义(P ＜0.05，P＜0.01)。各时相点基因治疗组明显强于对照组。结论 电穿孔介导的基因治疗能使细胞周期蛋白CyclinsA、D1、E在牵引区的表达增强、时限延长，可能促进细胞的分裂增殖与分化，促进牵引区细胞基质的形成和新骨生成。
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电穿孔介导质粒基因在皮肤和线性伤口中的表达
目的 研究在线性伤口中进行电穿孔基因转染的可行性.方法 于12只Sprague-Dawley大鼠背部皮肤内注射增强型绿色荧光蛋白(EGFP)质粒(1 μg/μl)后,在注射局部进行电穿孔(800 V/cm,6个方波,每个持续20ms,间隔为200ms).电穿孔后24 h在电穿孔部位做线性切口,于第2、4、6、14天收集标本.观察EGFP表达并计算其真皮内积分光密度(IOD).然后进行HE染色.结果 电穿孔使EGFP在表皮、真皮以及肉膜内表达,真皮内表达量在第2天高(IOD=3.50±1.45),至第14天消失,而单纯质粒注射真皮内无表达(IOD=0).结论 电穿孔能够介导质粒在线性伤口中高效而广泛地表达.
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构建睫状神经营养因子绿色荧光蛋白融合表达载体电穿孔转染雪旺细胞的研究
目的 构建睫状神经营养因子-绿色荧光蛋白(CNTF-GFP)融合表达质粒,以电穿孔法辅助转染培养的雪旺细胞,为优化细胞移植、促进视神经再生提供效果更好且便于观察的方法.方法 实验研究.构建重组质粒pcDNA3.1/CNTF-GFP;经测序鉴定后,电穿孔法辅助转染培养的雪旺细胞;荧光显微镜下动态观察转染效果,流式细胞计数;转染24 h后,用RT-PCR及免疫组化法检测基因转染及蛋白表达情况.结果 重组质粒经测序鉴定无误;在3 h即可见部分荧光,12 h逐渐增多,24～72 h到达高峰,持续至7 d仍有表达;流式细胞计数得转染率为44.93%±12.92%,转染24 h后,RT-PCR示目的 基因有较高转录,免疫组化示有CNTF蛋白的高表达,并与GFP蛋白表达部位完全重合.结论 成功构建了CNTF-GFP融合表达质粒;电穿孔法转染雪旺细胞后,表达良好,为制备转基因的种子细胞从而促进视神经再生的研究奠定了基础.
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超声引导不可逆电穿孔消融山羊肝脏的实验研究
目的 探讨超声引导经皮穿刺不可逆性电穿孔(IRE)微创消融山羊肝脏组织的可行性、B超影像学特点及其病理学变化.方法 4～6月龄山羊4只,体重25～30kg,采用同定脉宽100μs、频率1Hz、电压2000V的脉冲电场,120个脉冲,经彩色超声探头引导电极针经皮定位穿刺处理肝脏组织,观察处理过程中及处理后即刻、24h靶区B超灰度变化和肝脏坏死轮廓,并与仿真电场相比较,同时在对应时间点各取材2只行HE组织病理切片观察.结果 超声引导经皮IRE消融靶区组织定位准确,与周围正常组织回声明显不同,坏死组织轮廓与电极的电场仿真图像相吻合;光镜观察处理区肝细胞完全坏死,与周同正常细胞分界清楚.结论 超声实时引导定位IRE消融范围精确、可控,并可监测处理后坏死区回声变化范围,为IRE的临床应用提供了大动物实验依据.
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不可逆性电穿孔致山羊肝脏组织凋亡与坏死的实验研究
目的 评价不可逆性电穿孔(IRE)消融山羊肝脏组织的效果,以及消融区域肝细胞坏死、凋亡与电场分布的关系.方法 取4～6月龄山羊作为研究对象,对其给予IRE处理:经彩色超声探头引导电极针经皮定位肝脏,施加120个脉冲电场(固定电压2000V、脉宽100<,μs>、频率lH<,z>).24h后处死动物,取电极针周围肝脏组织标本(包括脉冲电场处理区域中心部分和处理区域与正常组织交界区)和正常组织(作为对照).将标本进行处理后,分别行HE染色观察组织的病理学变化;采用DNA ladder和TUNEL法检测组织细胞凋亡,采用流式细胞仪分析细胞周期.结果 病理学观察可见,消融处理区的肝细胞完全坏死,与正常组织分界清晰,围绕电极针的中心区域呈现凝固性坏死.TUNEL法显示凋亡细胞主要集中在处理区与正常组织的交界区.DNA ladder法在处理区与正常组织交界区组织检测到400～1000bp的梯状条带.流式细胞术分析显示,脉冲电场处理区细胞DNA二倍体峰前面出现亚二倍体凋亡峰.结论 采用IRE消融山羊肝脏组织,细胞在电场强度分布高处(即围绕电极针的中心区域)呈现凝固性坏死;在电极针周边处理区域,随电场强度衰减,肝细胞仍呈现出凋亡迹象.
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关于电穿孔对咖啡因透皮过程影响的一种数学建模方法
目的建立描述电穿孔促渗药物经皮渗透的数学模型,分析电脉冲对经皮渗透过程的影响.方法以咖啡因为模型药物,测定不同电脉冲强度(电压、脉冲数等)下的渗透速率,建立快-慢响应双通道假设的近似数学模型. 结果对1组咖啡因实验资料,在仅视慢响应通道扩散系数的大增加量D1和快响应扩散通道的大有效面积分数a2为条件相关参数的假定下,模型偏差远小于重复实验误差,而且这两个参数与脉冲总能量E的线性相关系数各为0.955(P=0.00)和0.924(P=0.00).结论模型很好地拟合数据,关于Fick扩散律及快-慢响应双通道假设均可接受;而且可视D1和a2为条件相关参数,余为条件无关参数.
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非病毒基因递送技术研究进展
基因递送是生物学和医学研究中一项重要且常用的技术,分为病毒感染法和非病毒转染法两大类.病毒载体具有较高转染效率,但产生不良反应等缺陷限制了其应用.非病毒载体具有低细胞毒性、低免疫原性、生物相容性好、可以生物降解等优点,而且不受基因大小的限制,具有很好的应用前景,但转染效率不高是其主要的瓶颈,目前研究人员正致力于寻找和开发高效率的非病毒转染方法.文中阐述了几种主要的生化转染法(阳离子多聚物、阳离子脂质体、磷酸钙)及物理转染法(电穿孔、超声/微气泡、显微注射和基因枪)的原理、优缺点以及研究进展.
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电场方向对电穿孔技术促进咖啡因经皮渗透的影响
目的研究电场方向对电穿孔技术促进咖啡因经皮渗透的影响.方法应用水平双室扩散池,Ag-Ag/AgCl电极和人尸体皮肤,进行咖啡因的经皮渗透实验,考察电场方向对电穿孔(指数衰减型脉冲,脉冲幅度为350 V,脉冲率为4 pulses·min-1,脉冲数为25,电容为22μF)促渗作用的影响,并与离子导入(0.25 mA·cm-2,持续4小时)进行比较.结果1)电穿孔与离子导入均可显著增加咖啡因的经皮渗透速率和累积渗透量.2)阳极离子导入(电场方向为从供应室到接受室)的促渗作用显著大于阴极离子导入(电场方向为从接受室到供应室)的促渗作用.3)阳极电穿孔的促渗作用与阴极电穿孔的促渗作用无显著差异.4)阳极离子导入的促渗作用显著大于阳极电穿孔及阴极电穿孔的促渗作用.结论电场方向对离子导入的促渗作用有显著影响,而对电穿孔的促渗作用没有影响.
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经皮给药电穿孔技术研究进展
目的 综述经皮给药电穿孔技术的新研究进展.方法 查阅国内外相关文献.结果 脉冲形态、脉冲电压、脉冲时间、脉冲数、脉冲能量等是促进药物经皮渗透的主要因素.电脉冲促进药物经皮渗透的机制主要是依赖新孔道假设理论,脉冲能量转移到皮肤,皮肤出现局部转运区(LTRs)结构变化可能是促进药物经皮渗透的直接原因,但还缺乏皮肤结构动态观察的直接证据,复合技术可以进一步提高促渗率.结论 安全性、起效时间、药物渗透剂量是该技术面临的重要问题.
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电穿孔法对分枝杆菌进行高效基因转化
目的:探讨卡介苗(Bacille Calmette-Guerin, BCG) 分枝杆菌的电穿孔转化方法及其影响因素.方法:在基因脉冲仪上用电穿孔法对快生长型耻垢分枝杆菌--M. Smegmatis mc2155和BCG电转化大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒ME-65.结果:电穿孔法可以成功地转化两种分枝杆菌,筛选出卡那霉素抗性菌 株.通过对转化子提取质粒进行酶切鉴定和PCR扩增均证明为阳性重组体.转化效率达104/μgDNA.重组质粒可以在分枝杆菌中稳定复制.初步结果表明,质粒DNA的构象和浓度、初始培养物的浓度和活力、电转化参数包括电压、电阻以及转化前对菌体的冰浴时间等都对转化效率有一定的影响.结论: BCG重组疫苗研制中分枝杆菌的基因转化问题的解决为研制能表达分枝杆菌及其它感染性疾病或肿瘤抗原的BCG多价重组疫苗提供了实验基础.
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电穿孔转染K562细胞的效率研究
目的:探讨脂质体转染与电穿孔转染的效率,观察电转染对K562细胞凋亡的影响.方法:以GFP为报告基因,通过脂质体转染及电穿孔两种方式转染K562细胞,荧光显微镜下观察并计算转染效率,Annexin V和PI观察细胞凋亡率.结果:电转染较脂质体转染K562细胞的效率高,电穿孔转染效率10%左右,脂质体转染效率小于1%.电穿孔时K562细胞凋亡率为40%.结论:电转染较脂质体转染K562细胞的效率高,但细胞凋亡率也高.
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原代大鼠肾小球系膜细胞佳电转染条件的探索和验证
目的 探索并验证原代大鼠肾小球系膜细胞佳电转染条件.方法 设立不同的电压与电容组合、电击前孵育温度、质粒DNA浓度等电转染条件,将绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C1导入原代大鼠肾小球系膜细胞.24h后比较各组细胞存活率和绿色荧光蛋白表达情况,确立佳电转染条件.再以此条件电转染质粒pcDNA3.1和pcDNA3.1-FHL2,48h后收取两组细胞RNA和蛋白.应用RT-PCR和Western印迹检测目的 基因FHL2的核酸和蛋白表达,验证电转染效果.结果 在电击前室温孵育,40μg质粒,340V电压、550μF电容的佳电转染条件下,原代大鼠肾小球系膜细胞的电转染效率可达40%以上,细胞存活率在50%左右.转染FHL2质粒组较对照组检测FHL2的核酸和蛋白表达水平明显升高(P<0.05).结论 适当的电转染条件可以有效转染原代大鼠肾小球系膜细胞.
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电穿孔介导白细胞介素-1受体阻滞剂抑制大鼠骨性关节炎实验
目的 探讨非病毒载体电穿孔(electroporation,EP)对大鼠早期骨性关节炎的基因治疗效果.方法 选用8周龄健康级雄性SD大鼠,通过切断右膝前交叉韧带及切除内侧半月板前脚的方法建立早期骨性关节炎模型.选择白细胞介素-1受体阻滞剂(interleukin-1 receptor antagonist,IL-1Ra)为目的基因.造模术后1周,对患有早期骨性关节炎的膝关节进行治疗,根据不同治疗方式将实验分为4组:单纯骨性关节炎未治疗组(OA组,n=1S)、骨性关节炎单纯目的基因治疗组(NP组,n=15)、骨性关节炎电穿孔目的基因治疗组(EP组,n=15)和正常对照组(n=15).各组在治疗后1周、2周、3周、4周处死大鼠,抽取右膝关节液20μl用于ELISA检测,分析其中IL-1Ra及白细胞介素-1 β(IL-1 β)蛋白质含量,游离右侧膝关节滑膜及软骨组织用于PCR检测,分析其中IL-1Ra及IL-1 β基因表达情况;在治疗后4周,分离右膝股骨髁进行大体观察及病理学组织检查.结果 大体观察结果显示,OA组与NP组股骨内侧髁负重区关节软骨大面积损伤,EP组软骨表面完整光滑;病理结果显示,OA组及NP组中软骨严重破坏、细胞外基质大量丢失,EP组软骨损伤仅局限在表层;PCR结果显示,EP组IL-1Ra基因的相对表达程度明显高于其他组(P＜0.01),4周时是正常组的4.29倍,IL-1 β基因表达水平在观察周期内与正常组差异无统计学意义(P＞0.05),ELISA检测结果趋势与PCR一致.结论 电穿孔转染IL-1Ra能够抑制大鼠骨性关节炎的发展,为骨性关节炎基因治疗的临床研究提供新手段.
关键词： 基因治疗 骨性关节炎 电穿孔 白细胞介素-1受体阻滞剂 大鼠 -
活体电穿孔导入法增强恶性疟原虫核酸疫苗免疫反应研究
目的 采用活体电穿孔免疫方法,研究恶性疟原虫DNA核酸疫苗不同免疫剂量对于动物免疫反应的影响,并对载体中CpG寡脱氧核苷酸基序的免疫刺激活性进行了初步探讨.方法 将恶性疟原虫多表位嵌合抗原M.RCAg-1基因克隆于真核表达载体VR1012中,使用电穿孔导入方法免疫小鼠,采用ELISA检测抗体效价、ELISPOT测定细胞因子分泌水平,探索基因疫苗佳免疫剂量以及考察免疫反应类型.使用计算机分析恶性疟核酸疫苗中特殊CpG基序组成,实验验证基因疫苗中CpG基序的免疫刺激活性.结果 相同DNA免疫剂量下,电穿孔免疫法与单纯肌内注射免疫法相比较,小鼠血清IgG抗体效价提高118倍,且能显著诱导体内特异性Th1和Th2型细胞反应.电穿孔免疫小鼠血清可识别天然虫体抗原,抗体效价可达1∶1200.恶性疟原虫核酸疫苗抗原DNA含有24个CpG免疫活性基序,可以有效的刺激人外周血单个核细胞(PBMCs)增殖与IL-6分泌.结论 活体电穿孔方法可以显著提高恶性疟原虫DNA疫苗体液免疫和细胞免疫水平.
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电穿孔法介导 siRNA 高效转染小鼠原代软骨细胞
目的：建立小鼠原代软骨细胞高效电转siRNA的方法。方法常规分离得到的小鼠原代软骨细胞继续用链丝菌蛋白酶消化3h，然后应用高效电转缓冲液和优化的电转参数转染pCMV－EGFP表达质粒或siRNA，用台盼蓝检测细胞存活率；转染后48h分析转染效率和siRNA靶分子的mRNA和蛋白表达水平。结果电穿孔后原代软骨细胞的存活率＞80％，质粒的转染效率达到37．3％±5．2％；siRNA靶分子的mRNA和蛋白表达水平分别下调了75％和66％。结论成功建立了通过电穿孔介导siRNA转染小鼠原代软骨细胞的方法，达到了很好的基因沉默效果且保持了较高的细胞存活率。
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利用电磁脉冲使细胞膜电穿孔及癌症治疗
一、电穿孔现象电穿孔(Electroporation)是指在脉冲电场的作用下,导致细胞膜或组织膜半透性丧失,膜上出现穿孔的生物物理现象,目前主要集中于研究单个或数个高强度脉冲电场作用下细胞的穿孔现象,其场强一般在l05～106V/m之间,而脉冲持续时间一般为10-6～10-3s量级,Weaver,Song,和Zimmermann等学者对高强度电脉冲导致电穿孔的机制和应用做了详细的研究[1].
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自杀基因治疗肿瘤研究现状
自杀基因疗法是指利用转基因方法,将哺乳动物不含有的药物酶基因转入肿瘤细胞内,该基因表达的产物可以将无毒性的药物前体转化为有毒的药物,影响细胞的DNA合成,从而引起该细胞死亡.基因转导的方法有多种,如基因直接注射、电穿孔、脂质体转导,磷酸钙沉淀以及病毒载体转导方法.因为常以病毒作为载体,称为病毒介导的酶解药物前体治疗.
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阳离子多聚物PEI结合电穿孔实现小鼠精子的核内转染
目的 联合运用阳离子多聚物PEI和方波电穿孑L两种不同机制的转染手段,以期克服精子难转染的问题.方法 采用FITC标记的线性阳离子多聚物JetPEI-FluoF与适量的质粒pCX-EGFP形成复合物作为转染示踪物质进行转染,通过激光共聚焦显微镜,检测复合物在细胞的分布情况.结果 与对照组单纯使用PEI转染相比较,联合使用组虽然精子活力和活率有一定程度的下降,但是无论胞质还是胞核荧光物质的携带量都有很大程度的提高,实现了对精子的核内转染.结论 本实验为我们以后开展大动物精子载体法的研究提供了一个成功的模式.
关键词： 电穿孔 JetPEI-FluoF 小鼠精子 核内转染 精子载体法
