胰岛α细胞胰岛素抵抗与炎症通路激活的关系及机制

目的 探讨高脂饲养大鼠胰岛α细胞炎症通路分子基因的表达变化及吡格列酮干预的影响.方法 8周龄雄性SD大鼠随机分为3组(每组15只):正常饲养组(NC)、高脂饲养组(HF)、高脂+吡格列酮组(HP).喂养20周后检测空腹血胰岛素(FIns)、胰高血糖素(Glc)、游离脂肪酸(FFA)、高敏C反应蛋白(hsCRP)水平;正常血糖高胰岛素钳夹试验评价外周胰岛素抵抗程度;离体胰岛细胞表面灌注检测高糖状态Glc分泌的动态变化,同时3组大鼠各随机入组8只给予大剂量链脲菌素去β细胞处理,分为正常去β细胞组(NC-B),高脂去β细胞组(HF-B),高脂+吡格列酮去β细胞组(HP-B),采用定量PCR方法比较3组去β细胞大鼠α细胞NF-κB、NF-κB抑制蛋白α(IκBα)mRNA表达的情况.结果 (1)HF组葡萄糖输注率(GIR)明显低于NC组,血FIns、Glc、FFA及hsCRP水平均显著高于NC组;而HP组以上各项指标较HF组均明显改善.(2)胰岛细胞表面灌注,HF组基础Glc的分泌高于NC组(P＜0.01),16.7 mmol/L葡萄糖灌注后HF组胰岛的Glc分泌未受抑制,HP组与NC组比较差异无统计学意义.(3)与NC-B组相比,HF-B组α细胞NF-κB mRNA 的表达增高20.5%,IκBα mRNA表达降低24.3%(P值均＜0.01).HP-B组较HF-B组NF-κB、IκBα mRNA分别改善78.3%、58.8%.(4)HF组血FFA水平与GIR呈负相关(r=-0.675,P＜0.01);与NF-κB mRNA表达呈正相关(r=0.775,P＜0.05).结论 高脂饲养导致胰岛α细胞胰岛素抵抗,同时激活了α细胞炎症通路基因的表达且与FFA升高有关.吡格列酮干预能改善上述变化.

钙通道拮抗剂对大鼠胰岛细胞胰岛素分泌的影响

目的研究钙通道拮抗剂对大鼠胰岛细胞分泌胰岛素的影响和机制.方法用放免和荧光方法分别检测不同治疗血浓度的硝苯地平(NIF)、维拉帕米(VER)、地尔硫NFDA7(DIL)等药物对低糖和高糖刺激状态下胰岛细胞Ca2+含量和胰岛素分泌量的影响.结果低糖状态组:NIF、VER、DIL在25、50、100 μg/L药物浓度下未对胰岛细胞内Ca2+含量和胰岛素分泌量产生影响,其结果与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05).在高糖状态组,NIF、VER、DIL在25 μg/L药物浓度下不抑制胰岛素分泌,NIF在50、100 μg/L浓度时,胰岛细胞内Ca2+浓度和胰岛素分泌量明显减少,与对照组相比差异有显著性(P<0.05)并呈剂量相关(P<0.01).VER在50 μg/L时胰岛素分泌有减少趋势,100 μg/L时明显减少(P<0.05).DIL在100 μg/L时胰岛素分泌量减少与对照组相比差异具有显著性(P<0.05).结论高浓度药理治疗量的NIF、VER 、DIL具有抑制高糖作用下的胰岛细胞外钙内流和使胰岛素分泌减少的作用.

应用高葡萄糖钳夹技术评价糖耐量异常的Graves病患者胰岛β细胞功能及胰岛素抵抗

目的 应用高葡萄糖钳夹技术评价糖耐量异常(IGT)的Graves病(GD)患者胰岛β细胞功能及胰岛素抵抗.方法 筛选合并IGT的GD患者6例(均为初诊未治),应用高葡萄糖钳夹技术检测胰岛素分泌及胰岛素敏感性,并与正常对照组10例进行比较,所有研究对象均检测谷氨酸脱羧酶(GAD)抗体.结果 合并IGT的GD组与正常对照组比较,第一时相胰岛素分泌[(636.31±105.54)mIU/L比(233.56±21.33)mIU/L]、第二时相胰岛素分泌[(146.68±25.0)mIU/L比(67.06±6.23)mIU/L]、大胰岛素分泌量[(195.05±32.94)mIU/L比(87.64±9.78)mIU/L],胰岛素敏感性指数(11.52±1.90比21.72±3.25),差异均有统计学意义(P值均＜0.05).所有研究对象GAD抗体检测均为阴性.结论 GAD抗体阴性的GD合并IGT患者胰岛素分泌呈亢进状态,胰岛素敏感性显著低于正常对照组.

他汀类调脂药对大鼠胰岛胰岛素分泌的影响及机制研究

目的 观察不同他汀类药物对大鼠胰岛葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)的抑制作用及机制.方法 新鲜分离或经24 h培养的胰岛均匀分为对照组、阿托伐他汀组、氟伐他汀组和普伐他汀组,对照组给予Kreb-Ringer碳酸氢盐缓冲液,他汀类药物组分别给予100μmol/L阿托伐他汀、氟伐他汀和普伐他汀,水浴30 min或过夜培养24 h.各组经2.8、5.5、11.1、16.7、25.0 mmol/L葡萄糖刺激后,37℃水浴法测定胰岛GSIS变化,生物化学发光法测定三磷酸腺苷(ATP)含量.结果 100μmol/L阿托伐他汀水浴30 min后,在16.7 mmol/L葡萄糖刺激下,与相应对照组比较,ATP含量[(9.54±1.64)pmol/胰岛比(12.33±1.89)pmol/胰岛]及胰岛素分泌(1.60±0.21比2.39±0.30)均下降(P＜0.05);100 μmol/L氟伐他汀过夜培养24 h后,在16.7 mmol/L葡萄糖刺激下,与相应对照组比较,ATP含量[(10.24±2.01)pmol/胰岛比(12.31±2.16)pmol/胰岛]及胰岛素分泌(3.12±0.32比4.17±0.37)也均下降(P＜0.05).结论 阿托伐他汀、氟伐他汀通过抑制胰岛ATP的生成而抑制GSIS,抑制程度与其脂溶性强弱有关.

球型脂联素对高糖诱导胰岛β细胞株NIT-1活性氧簇产生的影响

β细胞功能障碍是2型糖尿病发病机制的一个重要环节;但长期高血糖如何损害β细胞功能的分子机制仍未完全清楚.研究表明氧化应激参与β细胞的"葡萄糖毒性"[1].球型脂联素(globular adiponectin,gAd)与机体氧化应激水平有关,可能是通过还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸[NAD(P)H]氧化酶相关机制[2],而NAD(P)H氧化酶途径是β细胞中活性氧簇(ROS)产生增加的重要途径之一[3].本实验探讨gAd对高糖诱导胰岛β细胞株NIT-1ROS的产生是否有影响,及其可能的相关机制.

新生期小鼠胰岛细胞凋亡及其机制的研究

目的 观察新生期小鼠胰岛细胞凋亡的变化特点并分析细胞凋亡相关基因的表达差异,初步探讨相关机制.方法 采用胶原酶消化法分离纯化第1、3和8周小鼠胰岛细胞,以磷脂结合蛋白V-绿色荧光素/碘化丙啶双染法流式细胞术检测细胞凋亡率.透射电镜观察胰岛细胞凋亡形态,原位末端脱氧核苷酸转移酶标记(Tunel)/胰岛素免疫荧光双染法检测凋亡.采用实时定量PCR技术检测凋亡相关基因mRNA的表达.采用Western blotting技术检测促凋亡基因和抗凋亡基因的表达.多组间统计数据比较采用单因素方差分析.结果 (1)新生期小鼠胰岛细胞凋亡率在3周时显著增加,明显高于1周和8周[分别为(10.53±2.61)％、(1.80±0.69)％、(3.26±0.94)％,F=32.09,P＜0.01].透射电镜结果显示新生第3周小鼠胰岛细胞核出现凋亡早期改变.3周时Tunel/胰岛素双阳性细胞数明显高于1周和8周.(2)新生期小鼠胰岛细胞凋亡相关基因的表达呈动态变化,3周时,促凋亡基因Fas和FasL的mRNA表达均明显高于1周和8周(分别为1.53±0.21、1.00±0.00、0.46±0.24,F=24.85,P＜0.01;2.63±0.56比1.00±0.00、0.52±0.14,F=32.77,P＜0.01),抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表达明显低于1周和8周(分别为0.30±0.23、1.00±0.00、1.71±0.00,F=78.06,P＜0.01).(3)3周时,Fas、FasL和裂解的Caspase-3蛋白表达均明显高于1周和8周(分别为2.05±0.16、1.00±0.00、0.59±0.24,F=61.47,P＜0.01;3.54±0.86、1.00±0.00、0.72±0.26,F=27.04,P＜0.01;5.74±0.59比1.00±0.00、3.11±0.20,F=128.79,P＜0.01);Bcl-2蛋白表达明显低于1周和8周(0.62±0.13比1.00±0.00、1.90±0.10,F=151.08,P＜0.01).结论 Fas/FasL以及Bc1-2介导的细胞凋亡信号通路可能参与新生期小鼠胰岛细胞凋亡的调控.

围妊娠期小鼠胰岛细胞增殖及Survivin表达变化的研究

目的 观察围妊娠期小鼠胰岛β/α细胞量、细胞增殖、Survivin表达变化以及大鼠胰岛细胞瘤细胞株INS-1干扰Survivin表达后催乳素刺激细胞增殖的变化,探讨Survivin与妊娠期胰岛细胞扩增的关系.方法 采用免疫组化染色法检测C57 BL/6雌性小鼠非妊娠对照组(NP)和妊娠10.5、14.5、18.5 d(P10.5、P14.5、P18.5)、产后4、8 d(AP4、AP8)(每组各25只)胰岛β/α细胞量的变化.采用胶原酶消化法分离纯化小鼠胰岛,以流式细胞术检测细胞周期,实时定量聚合酶链反应及Western blotting法检测Survivin mRNA和蛋白的表达.采用脂质体转染siRNA方法干扰INS-1细胞Survivin的表达,催乳素刺激后检测细胞周期.多组数据组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用小差异显著性分析.结果 妊娠期胰岛β/α细胞量均显著增加,高峰在P18.5,与NP组相比,β细胞量增长2.1倍(3.84±0.38比1.81 ±0.09,t =4.75,P＜0.05),α细胞量增长1.6倍(0.92±0.13比0.56 ±0.08,t =2.69,P＜0.05),至AP8恢复至NP水平.妊娠期小鼠胰岛细胞增殖显著增加,高峰在P14.5,与NP组相比,增殖指数增长2.7倍(23.07±1.88比7.72±1.12,t=10.89,P＜0.05),产后恢复正常.Survivin mRNA表达水平在妊娠期明显增高,高峰在P14.5,与NP组相比,增长6.7倍(6.69±1.61比1.00 ±0.00,t =4.57,P＜0.05),产后恢复正常.P10.5时Survivin蛋白开始表达,高峰在P14.5,与P10.5相比增长3.6倍(3.63±0.26比1.00±0.00,t=9.98,P＜0.05),P18.5时表达逐渐下降,P20.5时表达消失.催乳素可显著刺激INS-1细胞增殖,而siRNA干扰INS-1细胞Survivin表达后,细胞增殖受阻.结论 妊娠期小鼠胰岛细胞出现明显扩增,并伴有Survivin的动态表达.Survivin介导催乳素刺激的胰岛β细胞扩增作用.

利拉鲁肽对小鼠胰岛β细胞产生成纤维细胞生长因子-21的影响及其潜在机制

目的 研究胰高糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂利拉鲁肽对小鼠胰岛β细胞系Min6细胞产生成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)的调控作用及其潜在机制.方法 培养Min6细胞,在添加或不添加GLP-1受体拮抗剂exendin(9-39)的情况下,给予利拉鲁肽干预24 h后,采用实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blotting检测细胞FGF-21 mRNA和蛋白表达,利用ELISA检测上清液FGF-21水平.在另外的实验中,Min6细胞给予10 nmol/L利拉鲁肽和(或)5 μg/ml FGF-21中和抗体孵育24 h后,ELISA法检测上清液胰岛素水平.组间比较采用单因素方差分析和LSD-t检验.结果 与对照组相比,1、10及100 nmol/L利拉鲁肽可剂量依赖性上调Min6细胞FGF-21 mRNA(分别为1.26± 0.24、1.52±0.41、1.21±0.26比1,F=3.523,P=0.021)和蛋白(分别为1.61±0.27、1.70±0.45、1.27±0.10比1, F=5.052,P=0.006)表达,增加FGF-21分泌[分别为(0.21 ± 0.05)、(0.25 ± 0.08)、(0.26 ± 0.07)比(0.19 ± 0.06)μg/mg蛋白,F=16.44,P=0.007],添加exendin(9-39)可削弱10 nmol/L利拉鲁肽的上述效应[mRNA表达水平:0.85±0.15比1.31±0.16,t=4.133,P=0.026;蛋白表达水平:1.27±0.13比1.74±0.06,t=10.55,P=0.009;分泌水平:(0.23±0.11)比(0.26±0.10)μg/mg蛋白,t=4.159,P=0.025].与对照组相比,10 nmol/L利拉鲁肽可促进Min6细胞的胰岛素分泌[(1.22±0.47)比(0.55±0.23)μg/mg蛋白,t=3.19,P=0.024],添加FGF-21中和抗体可消除该效应[(0.67±0.28)比(1.22±0.47)μg/mg蛋白,t=4.371,P=0.007].结论利拉鲁肽可呈GLP-1受体依赖性地促进小鼠β细胞系Min6的FGF-21表达和分泌,FGF-21可能以自分泌或旁分泌方式参与介导利拉鲁肽促进Min6细胞胰岛素分泌的效应.

胰岛新生相关蛋白对胰岛β细胞增殖和胰岛素分泌功能的影响

目的 观察胰岛新生相关蛋白对胰岛β细胞增殖和胰岛素分泌功能的影响.方法 INS-1细胞购自上海拜力生物科技有限公司.葡萄糖刺激实验中,INS-1细胞被分为实验组(50 mg/L胰岛新生相关蛋白与INS-1共培养)和对照组,经2.8、16.7 mmol/L含葡萄糖1640培养液刺激1 h后,采用放射免疫法检测上清液中胰岛素含量.另设立24、48 h组,分别以1、10、25、50、100、250、500 mg/L胰岛新生相关蛋白、INS-1细胞共培养,24或48 h后检测吸光度值.逆转录聚合酶链反应中,INS-1细胞被分为实验组(50 mg//L胰岛新生相关蛋白与INS-1共培养)和对照组,检测PCNA、Cyclin d1、Cdk4、P27、p38MAPK、JNK mRNA表达水平.采用t检验和单因素方差分析进行数据统计.结果 2.8 mmol/L葡萄糖刺激下,实验组胰岛素释放量高于对照组[分别为(74±16)、(39±9)mU/L,t=3.96,P＜0.05];16.7 mmol/L葡萄糖刺激下,实验组胰岛素释放量亦高于对照组[分别为(78±9)、(46±10)mU/L,t=4.72,P＜0.01].随着胰岛新生相关蛋白浓度增加,INS-1细胞增殖更为明显,具有剂量依赖性,且刺激48 h的效应强于24 h.50 mg/L胰岛新生相关蛋白干预24 h后,实验组和对照组相比,PCNA、Cyclin d1、Cdk4 mRNA表达上调(t值分别为7.64、5.98、12.87,均P＜0.01),P27、p38MAPK、JNK mRNA表达下降(t值分别为10.61、27.64、2.95,均P＜0.05).结论 胰岛新生相关蛋白干预后,INS-1细胞胰岛素释放水平增加,胰岛细胞数量增多,这可能与其影响细胞周期调控基因的表达有关.

新生小鼠胰岛增殖及口袋蛋白家族、E2F转录因子表达变化

目的 观察新生小鼠胰岛细胞、细胞周期和视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)、视网膜母细胞瘤样蛋白1(p107)、视网膜母细胞瘤样蛋白2(p130)及E2F转录因子的变化特点,探讨其与胰岛细胞增殖的关系.方法 采用免疫组化法检测出生第1、3和8周小鼠胰岛β/α细胞量、单个细胞面积和细胞数量的变化.采用胶原酶消化法分离纯化小鼠胰岛,以流式细胞术检测细胞周期,实时定量PCR及蛋白印迹技术检测Rb、p107、p130和E2F转录因子mRNA和蛋白表达.结果 (1)小鼠3周和8周胰岛β/α细胞量显著高于1周(P＜0.05);单个β/α细胞面积在3周时无明显差异,8周时扩大1.7倍(P＜0.01);而β/α细胞数量在3周增加约3.5/3.7倍(P＜0.01),8周与3周无明显差异.(2)1周和3周时G0/G1期细胞比8周明显减少(81.3±1.2、82.8±3.3比92.6±1.3,F=6.5,P＜0.05),而G2/M期显著增多(13.4±1.4、12.2±1.8比5.5±0.5,F=6.3,P＜0.05),细胞增殖指数明显增加(P＜0.05).(3)8周时Rb mRNA表达明显低于1周和3周(P＜0.01);3周和8周时p107 mRNA显著低于1周(P＜0.05),而p130 mRNA显著高于1周(P＜0.05),E2F-1、E2F-2 mRNA均显著低于1周(均P＜0.01);8周时E2F-3 mRNA显著低于1周(P＜0.05);而E2F-4、E2F-5 mRNA在3周和8周时表达增加.(4)8周时Rb和p107蛋白表达均比1周明显降低,p130表达显著增高,3周和8周时E2F1表达显著降低(均P＜0.05).结论 新生小鼠胰岛细胞量扩增明显,以细胞数量增加为主,细胞增殖显著.Rb、p107、p130及其相关E2F转录因子的表达存在动态变化,可能参与细胞增殖的调控.

新生期小鼠胰岛细胞自噬及其机制研究

目的：观察新生期小鼠胰岛细胞自噬的变化，分析自噬相关基因的表达差异并初步探讨相关调控机制。方法采用胶原酶消化法分离纯化第1、3和8周小鼠胰岛细胞，透射电镜观察自噬体显微结构。采用免疫荧光双染法检测胰岛中微管相关蛋白1轻链3（LC3）与胰岛素双阳性细胞比例的变化。采用实时定量PCR技术检测自噬相关基因（Atg）mRNA水平的表达。采用Western blotting法检测目的蛋白的表达。多组间数据比较采用单因素方差分析。结果（1）透射电镜结果显示，3周小鼠胰岛细胞出现内含胞浆或细胞器成分的具有双层膜结构的自噬体。免疫荧光结果显示，LC3在3周小鼠胰岛β细胞胞浆中着色较深，表达高于1周和8周（57.6±2.3比24.4±1.3、28.1±2.3，t=-21.44、-15.66，均P<0.01）。（2）3周时，p53 mRNA表达明显高于1周和8周，而哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）mRNA表达显著低于1周和8周（均P<0.01）。新生期小鼠胰岛细胞Atg的表达呈动态变化。与1周和8周相比，3周时Atg1激酶同源蛋白(ULK-1)、Beclin1和Map1lc3b表达明显增高（P<0.05）。与1周相比，3周时PI3Kc3、Atg5、Map1lc3a和Atg16l1表达显著增高（P<0.05）；3周和8周时Atg4d的表达显著增高（P<0.05）。Atg4c表达在3周时明显高于8周（P<0.05）。（3）Western blotting显示，与1、8周相比，3周时p53、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（pAMPK）、Beclin1和LC3-II蛋白表达均显著增高（F=29.14~56.05，均P<0.01），而mTOR蛋白表达明显低于1周和8周（0.61±0.06比1.00±0.02、0.89±0.09，F=29.41，P<0.01）。结论 p53/pAMPK/mTOR/Beclin1介导的自噬信号通路可能参与新生期小鼠胰岛细胞自噬的调控。

围妊娠期小鼠胰岛细胞视网膜母细胞瘤蛋白的表达及其与β细胞扩增的关系

目的 观察围妊娠期小鼠胰岛细胞视网膜母细胞瘤(Rb)蛋白的表达变化,探讨其与妊娠期胰岛β细胞扩增的关系.方法 将适合繁衍的6～8周龄体重20～25 g的C57BL/6小鼠合笼配繁,检测阴栓形成,留取未孕(NP)、孕14.5 d(P14.5)、孕18.5 d(P18.5)、产后4 d(AP4)、产后8 d(AP8)等围妊娠期天数的小鼠.采用胶原酶消化法分离纯化小鼠胰岛,Western blot法检测Rb、磷酸化Rb(p-Rb)及转录因子E2F1的蛋白表达,免疫荧光技术检测Rb和p-Rb的分布.配繁胰腺特异性Rb基因敲除小鼠,留取NP、P14.5和P18.5的小鼠.以腹腔葡萄糖耐量试验评估小鼠P14.5时的糖耐量变化.体内及体外试验检测葡萄糖刺激下的胰岛素分泌.免疫组化法检测基因敲除小鼠胰岛β细胞量、数目及面积的变化,免疫荧光法检测Ki67阳性β细胞比例变化.各组间比较采用独立样本t检验.结果 (1)小鼠胰岛细胞Rb、p-Rb和E2F1在妊娠期表达显著升高,高峰出现在P14.5,表达量分别为NP组的2.16、2.96和2.09倍(t=9.31、24.23、8.31,均P＜0.01),均于分娩后逐渐恢复至孕前水平;Rb主要表达于胞核,而p-Rb主要表达于胞浆.(2)NP时基因敲除小鼠糖耐量优于野生型小鼠,血糖曲线下面积(AUC)显著降低[(1 343±19)比(1 511±16)mmol· L-1·min-1,t=10.48,P＜0.01];P14.5 d时基因敲除鼠糖耐量仍优于野生型孕鼠,AUC显著降低[(1 073±117)比(1 359±101) mmol·L-1·min-1,t=3.71,P＜0.01];P14.5 d时,基因敲除孕鼠葡萄糖刺激的胰岛素分泌在2 min和30 min时显著高于野生型孕鼠[分别为(0.69±0.10)比(0.55±0.10) ng/ml、(0.46±0.08)比(0.36±0.08) ng/ml,t=2.40、2.30,均P＜0.05],体外葡萄糖刺激下基因敲除孕鼠的胰岛素分泌水平也高于野生型孕鼠[低糖和高糖状态下分别为(233±48)比(93 ±49) U/ml和(365±46)比(230±94)U/ml,t=4.30、2.62,均P＜0.01].NP时,基因敲除鼠的β细胞量、数目、Ki67阳性细胞比例较普通小鼠均增加(t=4.53、3.46、7.68,均P＜0.05),但进入妊娠期后未出现进一步增加.结论 围妊娠期小鼠胰岛细胞中Rb及E2F1表达增高,与妊娠期胰岛β细胞扩增相关.

抑制叉头状转录因子O1表达可促进人胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化

目的 探讨叉头状转录因子O1(FoxO1)对人胚胎干细胞(hESCs)定向分化为胰岛素分泌细胞(IPCs)的调控作用.方法 体外诱导hESCs定向分化为IPCs,应用定量聚合酶链反应(PCR)和Western blotting分析FoxO1的动态表达,采用定量PCR检测八聚体结合转录因子4(Oct4)、叉头转录因子a2(Foxa2)、胰十二指肠同源盒因子1(Pdx1)及胰岛素表达的动态变化.在分化第3阶段细胞(胰腺前体细胞)中通过慢病毒感染敲减或过表达FoxO1,应用定量PCR检测胰腺前体细胞Foxa2、Pdx1及胰岛素的表达;利用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测葡萄糖刺激的胰岛素分泌.两组数据的比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析.结果 在hESCs定向分化为IPCs的五个阶段中,FoxO1 mRNA和蛋白水平可见持续稳定表达;Oct4表达水平随着分化进程呈显著进行性降低;Foxa2表达水平呈先升后降的趋势,在分化第3阶段达到高峰;Pdx1和胰岛素表达水平随着分化进程逐渐升高.与相应的对照组相比,敲减FoxO1可显著上调胰腺前体细胞中Foxa2(4.31±0.74比1.00± 0.34,t=7.08,P<0.01)、Pdx1(2.91±0.24比1.00±0.15,t=11.62,P<0.01)及胰岛素mRNA(2.60±0.25比1.00±0.12,t=10.08,P<0.01)表达水平,过表达FoxO1可显著下调胰岛素mRNA表达(0.81±0.07比1.00± 0.03,t=4.19,P<0.05),而对Foxa2和Pdx1的mRNA表达未有显著影响.此外,敲减FoxO1既可增加低糖(2 mmol/L葡萄糖)状态下的胰岛素分泌(7.53±2.02比1.00±0.05,t=3.23,P<0.05),又可促进高糖(20 mmol/L葡萄糖)刺激下的胰岛素分泌(17.39±3.04比6.45±1.34,t=3.30,P<0.05);而过表达FoxO1对低糖状态下的胰岛素分泌无明显影响,但可抑制高糖刺激下的胰岛素分泌(2.02±0.50比4.85±1.42, t=2.61,P<0.05),从而使细胞丢失对葡萄糖的反应性.结论 FoxO1在hESCs定向分化为IPCs的过程中发挥负性调控作用,抑制FoxO1表达可能是促进IPCs分化成熟的一种潜在策略.

内吗啡肽对过氧化氢诱导的大鼠胰岛损伤的保护作用

目的 研究过氧化氢(H2O2)对胰岛的损伤及内吗啡肽(EMs)对这种损伤的保护作用.方法 成年雄性Wistar大鼠18只,体质量200～300 g,体外分离、纯化和培养Wistar大鼠胰岛,双硫腙(DyTZ)染色鉴定,锥虫蓝染色检测细胞活力,葡萄糖刺激实验检测胰岛生物活性.四唑蓝(MTT)分析不同浓度的H2O2对胰岛的损伤;放射免疫法检测EMs对H2O2诱导的胰岛细胞胰岛素分泌量的影响;流式细胞技术检测EMs对H2O2诱导的细胞周期影响.Western blot检测EMs和H2O2对p21蛋白表达的影响.多组间均数比较采用方差分析.结果 胰岛获得率为95%±2%,活力为96%±3%,生物学功能正常.与对照组比较,H2O2处理组胰岛细胞胰岛素释放量降低[分别为(67±9)mU/L,(153±11)mU/L,P＜0.01],而EMs+H2O2组胰岛素释放量与H2O2组相比增加[分别为(108±13)mU/L,(116±12)mU/L,P＜0.05];H2O2处理组细胞周期G0/G1期细胞数目与对照组比较增多(分别为63.9%±3.1%,41.3%±1.9%,P＜0.05);S期的细胞数目与对照组比较减少(分别为27.2%±1.1%、35.3%±2.6%,P＜0.05);而用EM1预孵后与只加H2 O2处理的细胞比较,G0/G1期细胞数目减少(44.4%±2.1%,66.9%±3.1%,P＜0.05),EM2预孵后再加H2O2处理的细胞与只加H2O2处理的细胞比较G0/G1期细胞数目减少(分别为47.6%±2.8%,66.9%±3.1%,P＜0.05),EM1预孵后与只加H2O2处理的细胞比较S期的细胞数目增加(分别为32.1%±1.2%,24.2%±1.1%,P＜0.05),EM2预孵后与只加H2O2处理的细胞比较S期的细胞数目增加(分别为31.2%±1.8%,24.2%±1.1%,P＜0.05).H2O2处理组细胞p21蛋白表达增加(1.10±0.16,P＜0.05),而EMs组细胞p21蛋白表达降低(分别为0.35±0.05,0.30±0.04,P＜0.05).结论 内吗啡肽对过氧化氢诱导的胰岛损伤具有保护作用,其可能是通过降低p21蛋白表达和抗氧化损伤等机制实现的.

miR-375在人胚胎干细胞定向分化为胰岛素分泌细胞过程中对肝细胞核因子1β表达的调控作用

目的 探讨miR-375对人胚胎干细胞(hESC)定向分化为胰岛素分泌细胞(IPCs)的调控作用及其潜在机制.方法 体外诱导hESC定向分化为IPCs,分析miR-375与其预测靶基因肝细胞核因子1β(HNF-1β)之间表达水平的动态变化关系;以miR-375过表达的慢病毒载体感染分化第二阶段细胞,实验分为空白对照组、阴性对照(GFP)组及miR-375过表达组;应用实时定量PCR和(或) Western blotting法检测各组分化细胞中miR-375、HNF-1β、胰岛细胞分化或功能相关的关键基因的表达.两组间比较用t检验,多组间比较用单因素方差分析和Q检验.结果 hESC分化五个阶段中miR-375表达水平呈先高后低的变化趋势,相对表达量分别为100%、(472.25 ± 33.53)%、(768.00 ± 25.65)%、(54.25±5.74)%、(30.75±5.70)% (F=1137.57,P<0.001).HNF-1β表达水平在分化第三阶段开始明显上升,在分化第四阶段达到高峰[分别为(279.50 ± 21.30)%、(645.00 ± 64.55)%,F=224.86,P<0.001],变化趋势与1/miR-375的变化趋势相似.慢病毒感染后,miR-375过表达组的HNF-1βmRNA表达水平与GFP组、空白对照组无显著差异(F=1.467,P>0.05),而miR-375过表达组的HNF-1β蛋白表达水平则下降至GFP组的(38.75±9.22)% (F=60.69,P<0.001).与GFP组相比,miR-375过表达组分化第四阶段细胞的胰十二指肠同源盒因子1(Pdx-1)表达水平显著升高,分化第五阶段细胞(IPCs)的Nkx6.1、配对盒因子4(Pax-4)及胰岛素的表达水平则显著降低(F=105.19~484.05,均P<0.001).结论 miR-375对hESC向IPCs定向分化具有重要的调控作用,该作用可能是通过影响转录因子HNF-1β表达而实现的.

年龄对胰腺部分切除的小鼠胰岛细胞再生和凋亡的影响

目的 探讨年龄对胰岛细胞再生的影响,初步揭示胰岛再生的机制以及与老龄性糖尿病的关系.方法 对清洁级3月龄[n=12,体重(16.7±1.9)g]、6月龄[n=12,体重(25.4±2.3)g]、12月龄[n=12,体重(28.5±3.0)g]近交品系C57B6小鼠胰腺切除65%～70%,在饮用水中加入BrdU以标记增殖细胞,各组动物分别于1、2、4周处死取材,通过测量空腹血糖、静脉糖耐量并应用免疫组织化学的方法对胰岛细胞的再生以及胰岛细胞的凋亡进行全面的研究.所得数据通过Graphpad Prism 5.0软件的2-way ANOVA进行统计学处理.结果 在3月龄的年轻小鼠部分胰腺切除后,术后1、2、4周胰岛β细胞再生率分别为15.1%±10.0%、25.5%±8.1%、45.7%±14.6%;6月龄小鼠胰岛再生率分别为23.9%±8.7%、28.3%±7.6%和27.2%±5.7%;而对于12月龄老龄的小鼠,胰岛细胞再生率分别为4.4%±6.9%、6.1%±5.8%和5.1%±7.0%,用GraphPad Prism 5.0软件进行2-way ANOVA分析表明时间、年龄对胰岛再生均有影响(P＜0.0001,P＜0.05),各组间差异有统计学意义.3月龄的小鼠1、2、4周胰岛β细胞凋亡率分别为2.7%±2.4%、3.7%±3.4%、3.1%±3.6%,12月龄的小鼠1、2、4周胰岛β细胞凋亡率分别为5.6%±1.4%、5.8%±4.3%、6.7%±2.6%,3月龄小鼠凋亡的β细胞数量明显少于12月龄的小鼠(P＜0.05).结论 随着年龄的增长,小鼠胰岛β细胞的再生能力明显降低,并且更易发生凋亡.这可能是导致老龄人群糖尿病发病率升高的主要原因之一.

恒河猴胰岛的半自动分离和纯化

目的 探讨恒河猴胰岛分离和纯化的技术方法.方法 采用自制的半自动胰腺消化分离装置,对3只成年恒河猴胰腺进行消化分离,用非连续密度梯度高渗枸橼酸盐嘌呤溶液( HCA液)-蔗聚糖液(Ficoll液)纯化恒河猴胰岛,通过双硫腙染色在倒置显微镜计数胰岛的数量和纯度,用胰岛素释放试验检测胰岛的分泌功能.分离和纯化结果采用配对t检验进行统计分析.结果 消化后平均每个胰腺可获得( 101 420±12 054)胰岛当量(IEQ),纯化后平均每个胰腺可获得(71 480±8054) IEQ,平均每克恒河猴胰腺组织可获得(2310±252) IEQ,纯化后胰岛平均纯度为(89.8±8.7)％,活率为(93.1±2.8)％.纯化后的胰岛对葡萄糖刺激反应良好,高糖(16.7 mmol/L)时胰岛素的释放量为低糖(3.3 mmol/L)时的5.9倍(t=45.2,P＜0.01).分离胰岛在移植到糖尿病大鼠肾包膜下后能够影响降低血糖至支持水平.结论 通过采用半自动胰腺消化分离装置,胶原酶P灌注消化及非连续密度梯度法纯化,能获取较高纯度及生物活性良好的恒河猴胰岛.

一种改良的小鼠胰岛分离方法

目的 探讨一种简单快捷、廉价高效的小鼠胰岛分离与纯化方法.方法 采用自制的穿刺针由胆总管逆行穿刺并灌注胶原酶Ⅴ消化胰腺,使用仅一种密度梯度介质离心结合手工挑选的方法分离纯化6~8周龄雄性ICR小鼠胰岛.同时,以单纯手工挑选法纯化胰岛作为对照组.双硫腙染色鉴定获取胰岛纯度,吖啶橙/碘化丙啶染色鉴定胰岛活力.采用不同浓度葡萄糖(低糖2.8 mmol/L,高糖20.0 mmol/L)刺激的胰岛素释放实验检测胰岛功能.采用t检验比较两组间的差异.结果 采用自制穿刺针及密度梯度离心的新方法提取5只小鼠胰岛整体耗时152 min,而单纯手工挑选法则耗时347 min;新方法每只小鼠平均可得胰岛(95±8)个,略低于单纯手工挑选组的(124±10)个(t=4.027,P=0.016);但新方法所得胰岛纯度为92.6%±1.3%,显著高于单纯手工挑选法79.2%±5.5%(t=4.075,P=0.015).同时新方法所提取的胰岛活力与手工挑选法获得的胰岛的活力相当.新方法获得的胰岛在低糖和高糖刺激下上清中胰岛素分泌量分别为(66±13)和(256±46)μg/L(t=7.042,P=0.002),提示这种新方法获取的胰岛对糖的反应很灵敏.结论 采用自制的穿刺针及密度梯度离心的方法所得胰岛产量、纯度、活力及胰岛功能都相对良好,是一种简单快捷、廉价高效的小鼠胰岛分离方法.

糖尿病合并冠心病的治疗策略\应用口服降糖药治疗的2型糖尿病患者血糖波动与餐后胰岛B细胞功能密切相关\2型糖尿病合并冠心病的治疗:随机对照临床试验

转录因子在内分泌胰腺发育和功能中的作用

本文复习了胰腺内分泌系统的发育生物学,重点讨论转录因子在胰腺内分泌细胞发育和功能维持中的作用.对这些重要转录因子的理解将有助于阐明糖尿病发病机制和胰岛再生机制,从而有效地对糖尿病诊断、预防和治疗.