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用小鼠胚胎肢体器官培养研究锌对骨发育的影响
用自制浸浴式一次通气旋转装置对孕龄16d小鼠胚胎前肢进行培养,采用组织学分析及检测骨组织中AKP活性的方法研究锌对骨发育的影响.结果表明,与对照组相比,锌缺乏组和过量补锌组(终浓度含锌120μmol/L)的骨组织发育延迟,骨组织中AKP活力降低;而适量补锌组(终浓度含锌45μmol/L及70μmol/L)则促进成骨细胞向骨细胞增殖、分化,增加类骨质的分泌与合成,促进类骨质向骨质转化,提示适量补锌有潜在促进骨形成的作用.
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小鼠胚胎肢体器官培养模型的建立
为建立一套能简便、客观研究单因素对骨形成影响的方法,应用自制浸没式一次通气旋转装置对孕龄16天的小鼠肢体器官进行体外培养,采用X-ray摄片及组织学切片技术分析骨发育情况.结果显示,经过6天培养后,骨密度增加,骨组织呈活跃增殖,分化相,骨小梁增多,成骨区明显.提示胚胎肢体器官能在体外培养中存活并继续生长、发育,证明本模型成功.
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循环机械压力诱导下兔椎间盘器官模型ANK蛋白的表达
目的 建立兔椎间盘器官培养模型,在此基础上施以循环机械压力(CMP),观察兔椎间盘器官细胞成活率、组织形态学的变化及ANK蛋白的表达情况,并观察外源性转化生长因子(TGF)-β1对ANK蛋白表达的调控作用.方法 6月龄新西兰大白兔随机分为加力组和对照组,无菌条件下完整取出带部分椎骨的腰段椎间盘,放入含有20％胎牛血清的培养液里进行培养.加力组椎间盘应用加力器对其施以0.2 MPa压力值,每日1次,每次30 min.2组器官模型培养选取0、7、14天3个时间点,HE染色观察大体组织形态学变化;氯化硝基四氮唑蓝(NBT)染色及4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAH)复染检测细胞成活率;Western blot检测ANK蛋白的表达.另外,在加力组培养至第7天时,培养液中加入外源性TGF-β1再培养4h,Western blot检测ANK蛋白的表达.结果 对照组培养至第7天时,其组织形态学、细胞成活率及ANK蛋白的表达与0天相比差异无统计学意义(P＞0.05);培养至第14天时,组织形态学破坏,细胞成活率下降、ANK蛋白的表达下调,差异有统计学意义(P值均＜0.05).加力组培养至第7天时,组织形态学无明显变化,但细胞成活率下降、ANK蛋白的表达下调(P值均＜0.05);培养至第14天时,组织形态学破坏、细胞成活率下降及ANK蛋白的表达下调均更明显(P值均＜0.05).另外,加力组培养至第7天时加入外源性TGF-β1后,ANK蛋白的表达上调(P＜0.05).结论 CMP载荷可明显增加兔椎间盘器官模型细胞和组织学结构的破坏,使ANK蛋白的表达明显下调,可能与椎间盘退变的发生、发展密切相关.而外源性TGF-β1对ANK蛋白的表达具有正向调控作用,可能对CMP作用导致的退变椎间盘具有一定的修复作用.
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低切应力对体外培养动脉形态学重建的影响
目的研究低切应力对血管的生物学作用,探讨切应力与血管形态学重建的关系.方法采用血管体外应力培养系统,培养猪颈总动脉,通过组织学、免疫组织化学和图像分析等方法,探讨低切应力作用下动脉重建的形态学改变.结果切应力减小时,动脉发生显著的结构重建,其特征为管径缩小,壁面积减小,管壁增厚,壁厚/内径比增加;低切应力作用使动脉部分中膜VSMC由收缩型转变为合成型,表现为α-肌动蛋白含量下降,细胞核朝向改变,发生扭曲,变大变圆,核仁明显.结论低切应力和血压改变所致的血管重建在形态学方面有很大不同,提示:切应力和血压改变对血管重建的作用机制不同;中膜VSMC的表型转换是低切应力引起血管重建的基础.
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循环机械压力诱导下兔椎间盘退变器官模型的建立及意义
背景：力学因素是导致椎间盘退变（IDD）的重要诱因，建立力学相关性IDD的器官模型能为IDD机制的研究提供理想的模型基础。
目的：建立兔椎间盘器官模型，并施以循环机械压力，探究循环机械压力载荷对IDD的影响。
方法：6月龄新西兰大白兔随机分为加力组和对照组，静脉给予1.3 ml肝素（5000 U/ml），待肝素体内循环5 min后处死。无菌条件下完整取出带部分椎骨的腰段椎间盘，放入20%胎牛血清的培养液中培养。加力组应用加力器施以0.2 MPa压力值，每日加压1次，每次30 min。经过各个时段的培养后，苏木精-伊红（HE）染色观察椎间盘大体组织形态学变化；氯化硝基四氮唑蓝（NBT）染色及4',6-二眯基-2-苯基吲哚（DAPI）复染检测椎间盘细胞成活率；Realtime RT-PCR和Western-blotting检测蛋白多糖（AGN）、Ⅱ型胶原（COLⅡ）的mRNA和蛋白表达。
结果：对照组和加力组培养至第7 d的组织形态学无明显变化，培养至第14 d均表现为组织形态学破坏，且以加力组表现更为明显。对照组培养至第7 d的细胞成活率及AGN、COLⅡ表达与0 d相比无明显变化；对照组培养第14 d与0 d比较，培养第7 d加力组与对照组比较，培养第14 d加力组与对照组比较，均表现为细胞成活率明显下降，AGN、COLⅡ表达下调。
结论：成功建立短周期兔椎间盘体外器官模型，并在此模型基础上阐明循环机械压力载荷可直接导致椎间盘退变样改变。 -
退变大鼠椎间盘器官培养模型的建立及其意义
背景:椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)是慢性腰背疼和脊柱功能损害的主要原因,建立退变的椎间盘器官培养模型能为IDD机制的研究提供一个更好的试验平台.目的:建立退变大鼠椎间盘器官培养模型,观察正常和退变大鼠椎间盘的组织形态及细胞活性,以评价培养结果.方法:选取SD大鼠30只,老年组15只,青年组15只.反转录-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)法分别检测2组椎间盘蛋白多糖(aggrecan,AGN)和Ⅱ型胶原(type Ⅱ collagen,COL Ⅱ)的基因表达.无菌条件下完整取出两组大鼠腰段椎间盘,在培养液中经过不同时段培养后HE染色观察椎间盘组织学变化,氯化硝基四氮唑蓝(NBT)和4’,6-二眯基-2-苯基吲哚(DAPI)复染检测椎间盘细胞存活率.结果:老年组大鼠椎间盘较青年组发生明显退变,可视为退变椎间盘组织.两组大鼠椎间盘器官在体外培养4周,其组织学特点和细胞存活率无明显变化.结论:成功建立退变大鼠椎间盘器官培养模型,为研究椎间盘退变机制提供理想的实验模型.
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椎间盘灌注培养条件下压应力频率对纤维环细胞基质合成的影响
目的:观察压应力频率对椎间盘纤维环(AF)细胞基质合成的影响.方法:获取4~6月龄巴马香猪胸腰段椎间盘72个后,随机分为无应力对照组和应力组(分别为0.1Hz组、0.5Hz组、1Hz组、3Hz组、5Hz组),每组12个样本,将各组椎间盘置于生物反应器中进行灌注培养.无应力对照组不施加应力刺激,各应力组每天施加对应频率的应力刺激2h.灌注培养5d后分离全层纤维环组织行HE染色、阿利新蓝染色、胞外基质基因Ag鄄grecan、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅱ定量PCR、糖胺多糖(GAG)含量和羟脯氨酸(HYP)含量的检测.结果:培养5d后,各组纤维环组织仍保持天然的层状叠加结构.与对照组比较时,除5Hz组外其他应力组(0.1Hz、0.5Hz、1Hz、3Hz)纤维环组织阿利新蓝染色强度增强、各胞外基质基因的表达得到维持(0.1Hz)或上调(0.5Hz、1Hz、3Hz)、GAG和HYP的含量也维持在同等水平(0.1Hz)或显著升高(0.5Hz、1Hz、3Hz).然而各应力组组间比较时,5Hz组纤维环组织阿利新蓝染色强度、胞外基质基因的表达水平及GAG 和HYP 的含量比其他应力组(0.1Hz、0.5Hz、1Hz、3Hz)都下调(P<0.05).结论:椎间盘体外灌注培养条件下,压应力刺激频率影响纤维环细胞的基质合成,低频率(0.1~3Hz)的应力刺激增加基质合成,高频率(5Hz)的应力刺激减少基质合成.
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豚鼠内耳椭圆囊斑体外原代培养
目的探讨豚鼠内耳椭圆囊斑体外正常培养状态及其在体外用氨基糖苷类抗生素庆大霉素后的毒性损伤特征,以期建立前庭外周器官体外实验模型.方法豚鼠被随机分成三组:①正常未培养对照组;②正常原代培养组,利用体外组织培养方法对豚鼠内耳椭圆囊斑进行正常原代培养;③庆大霉素损伤原代培养组.正常原代培养组和庆大霉素损伤原代培养组在培养期间每天用相差显微镜观察生长晕,正常培养组在培养的第5天和第10天固定用石蜡包埋切片光镜观察.庆大霉素组在48小时用树脂包埋半薄切片观察.结果正常原代培养组在培养10天过程中,用相差显微镜观察椭圆囊斑在培养第1～4天无明显生长晕,在培养第5天明显从椭圆囊边缘长出.随培养时间延长,生长晕不断扩大,以成纤维细胞为主.庆大霉素损伤原代培养组在培养2天内每天用相差显微镜观察椭圆囊斑未见明显生长晕.正常原代培养至第5和第10天,石蜡包埋切片显示支持细胞和毛细胞存活.庆大霉素组在48小时,用树酯包埋半薄切片观察,感觉上皮层的毛细胞溶解破坏,支持细胞存活.结论椭圆囊斑器官体外培养方法可行,并培养成功,为今后进一步研究椭圆囊斑提供了实验模型.
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庆大霉素对小鼠耳蜗毛细胞损害的离体培养试验模型
目的建立庆大霉素损坏小鼠耳蜗毛细胞的离体培养试验模型.方法应用耳蜗基底膜分离取材技术,耳蜗器官离体培养技术和毛细胞纤毛荧光染色技术定量观察了不同浓度庆大霉素对新生C57小鼠全耳蜗毛细胞的损害规律.结果庆大霉素对耳蜗毛细胞的损害程度随着剂量的增加而加重,耳蜗毛细胞的损害首先发生在外毛细胞,其病变规律是从耳蜗的底回向顶回发展.结论庆大霉素对离体培养耳蜗毛细胞的损害规律与动物活体试验的损害规律基本相同.
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器官培养法保存角膜对角膜内皮细胞活性的影响
成功的角膜保存方法应能很好地维持角膜内皮细胞的活性.测定角膜内皮细胞的活性是器官培养保存角膜中为重要的环节之一.本文总结了常用的角膜内皮细胞观察方法以及现阶段对其凋亡的研究,分析了保存液中主要成分、不同脱水剂以及保存时间对角膜内皮细胞活性的影响.
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兔角膜器官培养保存与应用的研究
目的 探讨建立角膜器官培养保存的方法、保存后角膜的特性及其用于移植的可行性.方法 选用特定的胎牛血清保存液,密闭保存36只成年新西兰兔角膜于32℃恒温箱中;在保存后1～4周的不同时间点,将角膜从保存液取出转入高渗透压的脱水液中脱水48 h备用;而后对比保存前后角膜内皮细胞密度、角膜厚度变化,并观测角膜内皮组织学特性和保存中污染情况;器官培养保存后的兔角膜做同种异体穿透性角膜移植,观测术后1周内植片情况;使用荧光标记的抗MHC-Ⅱ分子抗体标示保存后的角膜中树突状细胞,观测其分布和保存后变化特点.结果 成功建立了角膜器官培养保存方法,保存中角膜的污染率约8.3%;保存4周内的兔角膜脱水后均透明;保存第3周时,角膜后弹力层周边区有细小皱褶;保存第4周时,全角膜有明显皱褶;器官培养保存的兔角膜内皮细胞密度随保存时间延长而下降,保存4周后兔角膜内皮细胞密度平均下降15.7%;兔角膜厚度随保存时间延长而增加,保存第4周时,角膜中央厚度可达0.7 mm;组织学观察可见角膜内皮细胞与后弹力层贴附紧密;树突状细胞分布于角巩膜缘上皮层,保存至第3周时全部消失;同种异体角膜移植术后7 d内植片透明,无原发失败.结论 本研究建立的角膜器官培养保存方法可使保存的角膜在一定时间内维持活性,角膜的免疫原性下降.
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人脐带血清器官培养液保存猪角膜的实验研究
目的观察胎牛血清器官培养液和人脐带血清器官培养液对猪角膜内皮细胞形态学、组织学、超微结构、酶活性及代谢等的影响.方法器官培养方法:4周以内31℃密闭培养,之后脱水24h.选择猪眼113只,其中100只角膜分为两组进行配对器官培养保存.第1组(50只角膜):应用培养液Ⅰ(含10%胎牛血清);第2组(50只角膜,第1组的对侧角膜):应用培养液Ⅱ(含10%人脐带血清).13只角膜作为正常对照.器官培养每周每组各取出12只角膜进行内皮细胞形态学分析、HE染色、酶组织化学染色.保存2周、4周时行扫描电镜检查.检测保存前后培养液的pH值和葡萄糖、乳酸浓度.器官培养过程中行微生物学检测.结果器官培养期间角膜内皮细胞单层保持完整,多形性增加,两组之间角膜内皮细胞密度、细胞面积的变异系数和六边形细胞比例在保存4周内差异无显著意义.保存4周的猪角膜与正常猪角膜相比,平均内皮细胞丢失率第1组为10.98%,第2组为10.85%.两组角膜器官培养后的组织学、超微结构、酶活性无明显区别.扫描电镜显示内皮细胞层完整,细胞形态改变.酶组织化学染色显示上皮、内皮细胞酶活性旺盛,基质细胞的酶活性随保存时间的延长而降低.角膜代谢状态良好.器官培养液污染率为6%.结论两种器官培养液均可以保持角膜内皮活性达4周,推测人脐带血清能够替代胎牛血清作为角膜器官培养液的成分.(中华眼科杂志,2004,40:533-538)
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眼科细胞培养的基本条件和技术
细胞培养是将从机体取出的细胞在体外进行培养,使之继续生存、生长的一种方法,是目前医学生物学研究领域普遍采用的基本技术.根据培养材料体外培养可分为器官培养、组织培养及细胞培养3种.细胞培养是发展快、应用多的一种,也是本文涉及的主要内容.
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改良支撑材料小鼠颅颌面器官体外培养系统的建立
目的 探讨改良支撑材料小鼠颅颌面器官体外培养的可行性及适宜条件.方法 分离出生后0.5天(PN0.5)的C57BL小鼠颅颌面部分器官(下颌磨牙、下颌下腺、舌),在由有机树脂片作为支撑物的6孔板中体外培养3天,组织学切片HE染色,观察所培养器官的生长发育情况和形态学变化,并且与PN0.5和PN3.5小鼠白相应器官进行组织学比较.结果 相对于PN0.5的颅颌面器官结构,器官培养3天后下颌磨牙、下颌下腺和舌等器官体积增大,并有不同程度的发育,细胞有不同程度的增殖和分化.体外3天培养器官的发育要落后于PN3.5的实际生长.结论 本研究初步探索并建立了小鼠颅颌面器官树脂支撑物体外培养系统.
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外源性TGFβ3细胞因子对培养腭突IRF6基因沉默的拮抗作用
目的 研究外源性TGFβ3对IRF6基因表达下调后腭突发育融合的影响,并探讨其分子机制.方法 取GD13.5天的胚胎腭突,进行腭突器官培养后进行IRF6基因沉默,并随机分为对照组和实验组.实验组在培养24h后分别添加10 ng/ml、50 ng/ml、80 ng/ml和100ng/ml TGFβ3细胞因子,对照组未添加TGFβ3细胞因子.应用HE染色观察腭突融合,荧光Real-Time PCR检测IRF6 RNA表达的变化,Western blot检测IRF6蛋白的表达变化.结果 RT-PCR和Western blot显示对照组及10ng/mlTGFβ3实验组对IRF6基因表达几乎没有影响,腭突中嵴上皮持续存在,腭突未融合.50ng/ml、80ng/ml及100ng/ml TGFβ3组的IRF6 mRNA及蛋白表达随TGFβ3剂量增加而增加.50、80和100ng/ml TGFβ3实验组腭突中嵴上皮完全消失,两侧腭突融合.结论 TGFβ3与IRF6存在正向调控作用,TGFβ3可逆转IRF6沉默导致的腭裂.
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乙酰基亚硝基脲对体外培养小鼠牙胚的作用研究
目的:观察化学致畸、致癌物乙酰基亚硝基脲(ethylnitrosourea,ENU)对体外培养牙胚发育、分化的影响.方法:通过体外牙胚器官培养模型观察培养液中不同浓度的ENU对17天胎龄的小鼠下颌第一磨牙牙胚形态发育的影响.结果:牙胚培养6天后,在含10%小牛血清的BGJb培养液中,牙胚的内釉上皮细胞分化为成釉细胞并分泌牙釉质基质,而其下方的牙乳头细胞分化为成牙本质细胞并分泌前期牙本质.当BGJb培养液中含0.025%ENU时,牙胚成釉器的星网层发生液化、囊性变.当BGJb培养液中含0.05%ENU时,牙胚发育受到抑制,其完整性被破坏,部分细胞溶解坏死.结论:一定量的ENU可使发育中的牙胚发生囊肿样变,过量的ENU对发育中的牙胚产生毒性作用.
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他克莫司对小鼠触须毛囊体外培养生物学特性的研究
目的观察不同浓度他克莫司(FK506)对小鼠触须游离毛囊器官培养的生物学特性影响.方法用离体器官培养的方法在倒置显微镜底下每日测量不同浓度FK506作用下毛囊生长长度、观察毛囊的形态学、记录生长天数,以及液相闪烁仪测量同位素3H-TdR的掺入率.结果0.003～0.3 mg·L-1浓度的FK506能促进毛囊的生长和DNA的合成,推迟生长期毛囊向退行期转变,延长毛囊的生长时间.当FK506浓度大于1 mg·L-1时即明显抑制毛囊在体外的生长.结论FK506在体外能直接促进毛囊的生长,延长毛囊的生长时间.
关键词： 他克莫司(FK506) 毛囊 器官培养 -
运动神经元病体外器官模型的建立
目的:利用微孔膜器官型脊髓组织片培养的方法,加入适当剂量的线粒体功能抑制剂丙二酸钠,造成选择性运动神经元数目减少从而建立肌萎缩侧索硬化症(ALS)的体外器官模型.方法:取出生后6天的SD乳鼠的腰段脊髓冠状切片后将脊髓片置于微孔膜上进行培养,首先经丙二酸钠量效检测确定佳丙二酸钠剂量.在培养第3天时加入适量的丙二酸钠,维持此浓度继续培养至第15天时结束培养,并利用免疫组化方法行运动神经元及中间神经元计数.结果:经丙二酸钠量效检测后确定2 mmol/L为佳加入剂量(存活率为75%,P<0.01).造模实验结果显示,对照组的脊髓片内的运动神经元数目为每半侧(15.29±1.70)个,丙二酸钠组为每半侧(11.00±2.45)个, 两组比较差异有统计学意义(P<0.01);两组中间神经元的数目略有减少,但两组间差异无统计学意义.结论:利用微孔膜进行器官型脊髓片培养并加入2 mmol/L丙二酸钠造成的此病理模型符合运动神经元病患者的特点,可重复性强,适用于ALS的发病机制、治疗等方面的研究.
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大鼠脑片的器官型培养及其中神经元的发育规律
目的:建立器官型脑片培养的方法,证明体外培养到一定时间神经元发育成熟,可在此基础上制作神经系统变性疾病模型.方法:取出生24 h内SD大鼠的额叶皮质作器官型培养.取培养7～14 d内每天的及培养第3周、4周和8周时的脑片,固定、脱水、切片后行Nissl和抗神经丝重链(NFH)免疫组化染色.同时用正常生长大鼠的脑片作对照,观察与培养脑片染色结果的异同.结果:Nissl染色结果显示,培养脑片中的锥体细胞体积逐渐增大、染色变浅,1～4周内皮质分层清晰.抗NFH免疫组化染色显示,培养至第10天时,位于第V层的锥体细胞着色,第12天以后Ⅲ层和V层均着色.对照组第5天时V层着色,3周以后Ⅲ层和V层都着色.对位于Ml区的第V层锥体细胞进行计数,从培养第12天开始至2个月时,神经元数目保持恒定.结论:器官型脑片培养适用于出生后神经元发育的研究,并可用于制作神经系统变性疾病的体外模型.
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30味中药对人头皮游离毛囊体外培养的影响
目的：探讨中草药对人头皮游离毛囊器官体外培养的影响，为医治脱发的新药开发提供新的思路。方法采用体外器官培养法对人头皮游离毛囊进行培养，观察体外培养生长毛囊的形态变化及30味中药对人头皮游离毛囊生长的影响。结果体外培养的人头皮游离毛囊在1～4天生长速度快，毛囊的形态结构在10天内无明显改变，制首乌、牛膝、熟地、女贞子、旱莲草、骨碎补、桑寄生、柏子仁等中药对体外培养的人头皮游离毛囊有明显的促生长作用，其中以中药制首乌、牛膝、熟地作用为明显（P <0.05），而中药黄芪、茯苓、桑白皮、桑椹、百部、菟丝子、蔓荆子对人头皮游离毛囊的生长有抑制作用（P <0.05）。结论人头皮游离毛囊器官体外培养可作为研究毛囊生长的可行方法和筛选生发药物模式；中药熟地、牛膝、制首乌对体外培养人头皮游离毛囊具有明显的促生长作用；植物生发药具有广阔的开发研究前景。
