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甲胺磷和溴氰菊酯对松墨天牛的生化毒理学研究
目的研究杀虫剂对松墨天牛体内几种主要代酶和蛋白质磷酸化水平的影响.方法使用经典的生化方法测定酶活力.用同位素标记的方法研究杀虫剂对蛋白磷酸化的影响.
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电磁辐射对家兔小脑谷氨酸受体2蛋白质表达和磷酸化的影响
目的 研究电磁辐射对家兔小脑谷氨酸受体2(glutamate receptor 2,CluR2)蛋白质表达和磷酸化水平的影响,探讨电磁辐射对小脑运动性学习记忆的神经信号传导通路的损伤特点.方法 30只二级日本大耳白家兔随机分为对照组和电磁辐射组(包括辐射后0、3、24和72 h等4个时相组).辐射组给予平均功率密度为65 mW/cm2S波段电磁波持续辐射30 min,测定辐射前和辐射后即刻家兔的肛温并计算比吸收率值;采用Westem blot方法检测小脑GluR2蛋白质表达及其磷酸化水平.结果 电磁辐射后0 h家兔肛温升高2.35℃,SAR值为19.00 J/(kg·s);小脑GluR2蛋白质表达水平无显著变化,但GluR2蛋白质磷酸化水平在电磁辐射后0 h显著降低.结论 65 mW/cm2电磁辐射30 min可使家兔机体产生明显热效应,并导致小脑GluR2的磷酸化水平下降,将终影响运动性学习记忆功能.
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磷酸化蛋白质组学技术进展及其在预防医学中的应用
生物体能迅速对体内外环境的变化产生的应答反应依靠复杂的调控机制调节,而其中大多数调控机制是由蛋白质构象变化所介导的.蛋白质本身的构象变化常常通过边蛋白质结构上发生的各种共价修饰来实现,其中蛋白质磷酸化是常见、重要的共价修饰方式[1].在脊椎动物基因组中,有5%基因编码的蛋白质是参与到磷酸化和去磷酸化过程中的激酶(kinase)和磷酸酯酶(phsphatase)[2].
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针灸对效应靶器官细胞跨膜信号转导影响的研究进展
目前有关针刺对效应靶细胞跨膜信号转导通路及机制的研究涉及多个层次和多个靶点,如:(1)针刺对G蛋白耦联的效应器酶-第二信使物质-蛋白激酶的影响;(2)针刺通过激活各种生长因子等启动酪氨酸蛋白激酶和非受体酪氨酸激活的胞内信号转导途径;(3)针灸激活配体作用于核内受体引起靶基因核转录因子转导途径等.本文收集近年来针灸对跨膜信号转导过程影响的研究文献,从针灸的镇痛效应、对脑及脊髓神经细胞损伤修复和重塑的影响、抗炎免疫、抑制肿瘤、对内脏器官调节等过程中相关靶细胞内信号转导蛋白质磷酸化及转录因子活性改变方面进行综述,旨在从多靶点、多途径、多层次揭示针灸对效应靶细胞调节作用的原理.
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艾灸“梁门”“足三里”穴对应激性胃溃疡大鼠胃黏膜细胞相关蛋白质磷酸化水平的影响
目的 研究艾灸梁门、足三里穴促进胃黏膜损伤修复的信号转导机制.方法 将45只大鼠随机分为正常组(10只)、模型组(15只)、胃经穴组(10只)和对照点组(10只),除正常组外其余各组采用束缚冷应激法制作应激性胃溃疡大鼠模型,胃经穴组造模后第2天鼠板束缚艾灸“梁门”“足三里”穴;对照点组选取“梁门”“足三里”穴外侧旁开0.5cm处为对照刺激点,两组均每次20 min,每日1次,持续12天.正常组和模型组仅鼠板束缚.采用Master Antibody Microarray Slides芯片检测各组大鼠胃黏膜细胞信号蛋白质磷酸化水平.结果 与模型组比较,胃经穴组大鼠胃黏膜细胞10种蛋白质磷酸化水平下调,其中TRAF2、Stat1、p53、Mkp-3、NF-KB 5种蛋白磷酸化水平差异有统计学意义(P＜0.01);14种蛋白质磷酸化水平上调,其中MEK、Ras、P38MAPK、PI3K、PAK、B-Raf、ERK2 7种蛋白磷酸化水平差异有统计学意义(P＜0.01). 结论 艾灸梁门、足三里穴可调节多种相关信号蛋白质的磷酸化水平,促进胃黏膜的损伤修复.
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BEZ235体内外抑制人乳腺癌细胞系增殖
目的 探讨BEZ235体内外抑制乳腺癌细胞的作用.方法 选用人三阴乳腺癌细胞系MDA-MB-231及三阳乳腺癌细胞系MCF-7,用MTT检测细胞增殖;用裸鼠荷瘤实验分析乳腺癌细胞系体内增殖;用Western blot法检测PI3 K/Akt相关信号通路蛋白的表达.结果 BEZ235对乳腺癌细胞具有明显的增殖抑制作用(P＜0.01),尤其是对三阴性乳腺MDA-MB-231细胞具有较强的体内外抑制作用(P＜0.01).结论 BEZ235可体内外抑制乳腺癌细胞,其机制可能是通过抑制PI3K/Akt信号通路蛋白的磷酸化修饰而实现的.
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蛋白质酪氨酸硝化和细胞信号转导
蛋白质硝基酪氨酸作为一氧化氮(NO)衍生的蛋白质翻译后修饰产物,被认为是许多生理和病理条件下的生物标志物.本文综述了蛋白质酪氨酸硝化可以作为信号调节元件与已知的信号途径相关,包括NO、蛋白质酪氨酸激酶、丝裂原激活蛋白激酶、T-淋巴细胞、转录因子NF-κB、Ca2+等.同时也论证了蛋白质酪氨酸硝化作为信号转导元件的可能性.
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巨噬细胞应激的铜绿假单胞菌磷酸化蛋白质组分析
目的 鉴定巨噬细胞应激的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)磷酸化蛋白质组,分析磷酸化修饰在该菌应答应激中的作用.方法 采用强阳离子交换层析和固相金属离子亲和层析(SCX-IMAC)富集应激细菌的磷酸化肽段,并利用纳升级液相色谱-质谱联用技术(nano LC-MS/MS)进行鉴定和分析其磷酸化蛋白质组.结果 在应激细菌中鉴定到14个磷酸化肽段,对应于12个磷酸化蛋白质,其中膜蛋白占50％,提示膜蛋白的磷酸化修饰在这一过程中具有关键作用.蛋白质功能分析显示这些磷酸化蛋白质主要涉及应激应答、铁摄取转运、厌氧呼吸、过氧化氢的应激应答、磷酸化介导的信号转导等生物过程.结论 铜绿假单胞菌的蛋白质磷酸化修饰对其转导应激信号及应答巨噬细胞内的缺铁、缺氧和氧化应激等不利生存环境具有关键作用,该结果为深入理解该菌的毒力及致病机制提供新的思路.
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SIRT1:衰老、代谢领域分子学研究新热点
SIRT1是衰老和代谢领域的分子学研究热点.SIRT1起初被认为是长寿基因,其表达能够延长酵母的存活期.但近期发表于 《Sicence》的一篇研究却对SIRT1的这一作用提出质疑[1].其对酵母的长寿作用似乎并不能在一些实验室中获得证实.无论如何,起初的研究的确促进了对于SIRT1代谢作用的探讨,该基因也被发现能够调节脂肪酸代谢.有研究显示,SIRT1的活性是经由蛋白质磷酸化、泛素化和蛋白酶体一介导的降解作用来调节的[2].
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微波辐射对家兔小脑运动性学习记忆和GluR2蛋白质磷酸化的影响
目的 观察微波辐射对家兔小脑运动性学习记忆功能的损伤效应,检测微波辐射对谷氨酸受体2(GluR2)磷酸化的影响.方法 选择建立牢固瞬膜条件反射的家兔,随机分为对照组和微波辐射组(辐射后0、3、24和72 h等4个时相点),辐射组给予平均功率密度90 mW/cm2的微波辐射30 min,测定辐射后家兔的即刻肛温并计算比吸收率(SAR)值;检测辐射后即刻家兔瞬膜条件反射的变化;蛋白质免疫印迹法检测家兔小脑GluR2及其磷酸化蛋白质的表达变化.结果 90mW/cm2微波辐射后即刻家兔肛温显著升高3.02℃,SAR值为8.74 W/kg;瞬膜条件反射在辐射后0 h显著降低,3 h后基本恢复至正常水平;小脑GluR2的蛋白表达水平无显著变化但GluR2的磷酸化水平在微波辐射后即刻显著降低.结论 90 mW/cm2的微波辐射30 min能使家兔产生明显热效应,并影响小脑GluR2的磷酸化,终导致小脑运动性学习记忆功能障碍.
关键词： 微波辐射 小脑 运动性学习 谷氨酸受体2(GluR2) 蛋白质磷酸化 -
电磁辐射对PC12细胞GluR2蛋白质表达及磷酸化的影响
目的 探讨电磁辐射对PC12 细胞GluR2蛋白质表达及蛋白质磷酸化水平的影响.方法 对离体培养的PC12细胞给予平均功率密度为90 mW/cm2的电磁波持续辐照20 min,采用western blot方法检测辐照后0h、3h、12h、24h四个时相点GluR2蛋白质表达及蛋白质磷酸化水平的变化.结果 电磁波辐照后0h和3h GluR2的蛋白质表达水平降低(P＜0.05),其余各时相点无显著变化;辐照后0h GluR2的蛋白质磷酸化水平显著降低(P＜0.01),3h后逐渐恢复至正常水平.结论 平均功率密度为90 mW/cm2的电磁波持续辐照20 min能够降低PC12细胞GluR2的蛋白质表达和蛋白质磷酸化水平.
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视神经损伤后脑衰反应调节蛋白-2表达及其磷酸化修饰的变化及意义
背景 脑衰反应调节蛋白-2(CRMP-2)具有促进中枢神经轴突生长的作用,但中枢神经损伤后在细胞周期素依赖蛋白激酶5(CDK5)诱导下CRMP-2会发生过度磷酸化修饰,从而导致生长锥塌陷,阻碍神经系统的修复.视神经作为一种特殊的中枢神经组织,其损伤后是否发生CRMP-2表达的变化和磷酸化修饰鲜见研究报道. 目的 探讨视神经钳夹伤小鼠模型视神经组织中CRMP-2表达及其磷酸化修饰水平的动态变化及意义.方法 选取8～9周龄健康BALB/c小鼠48只,雌雄不限.采用随机数字表法将小鼠随机分为假手术组和损伤后3、7、14 d组,每组12只.各损伤组小鼠右眼术中暴露视神经,用小号动脉夹于球后2 mm处夹持视神经10s,假手术组小鼠手术操作同各损伤组,但不钳夹视神经.分别于术后3、7、14 d获取小鼠视神经组织,采用实时荧光定量PCR法检测各组小鼠视神经组织中CRMP-2 mRNA的相对表达量;采用Western blot法检测各组小鼠视神经组织中CRMP-2蛋白、磷酸化CRMP-2(p-CRMP-2)及CDK5的表达变化,检测结果进行组间比较.结果 假手术组及损伤后3、7、14d组小鼠视神经组织中CRMP-2 mRNA及蛋白相对表达量的总体比较差异均无统计学意义(CRMP-2 mRNA:F=2.971,P=0.097;CRMP4蛋白:F=1.202,P=0.370).假手术组及损伤后3、7、14 d组小鼠视神经组织中p-CRMP-2蛋白的相对表达量分别为0.001±0.000、0.064±0.003、0.136±0.005和0.346±0.012,CDK5蛋白的相对表达量分别为0.440±0.009、0.723±0.011、0.874±0.015和0.952±0.019,总体比较差异均有统计学意义(p-CRMP-2:F=445.600,P＜0.001;CDK5:F=186.600,P＜0.001),其中损伤后3、7、14 d组小鼠视神经组织中p-CRMP-2和CDK5蛋白的相对表达量均明显高于假手术组,差异均有统计学意义(均P＜0.01).结论 小鼠视神经钳夹伤后视神经组织中CRMP-2的表达无明显变化,但视神经组织中CDK5和p-CRMP-2蛋白表达均明显上调,且随着损伤后时间的延长上调更为明显.
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蛋白激酶C抑制剂GF109203X对豚鼠形觉剥夺性近视的影响
蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)是一类重要的蛋白质磷酸化激酶,哺乳动物视网膜双极细胞~([1-3])、无长突细胞~([3-4])、Müller细胞~([1])均表达多种PKC亚型.目前尚不清楚PKC在近视发生中的作用.本研究将GF109203X注入豚鼠玻璃体,研究其对近视形成的影响,报告如下.
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电磁辐射对大鼠小脑蛋白激酶C活性及谷氨酸受体2蛋白质磷酸化的影响
目的 研究电磁辐射对大鼠小脑蛋白激酶C(PKC)活性和谷氨酸受体2(GluR2)蛋白质磷酸化的影响,探讨电磁辐射对小脑运动性学习记忆的神经信号传导通路的损伤特点.方法 将60只健康成年雄性Wistar大鼠分为对照组10只和辐射组50只,辐射组又根据观察时间点分为辐射后0,3,12,24和72 h等5个亚组,每亚组10只.各辐射组给予90 mW/cm2的电磁辐射20 min.测定电磁辐射后即刻大鼠的肛温,并计算比吸收率(SAR)值;采用改良的TaKai法检测PKC的活性,采用Western blot方法检测小脑GluR2蛋白质及其磷酸化水平.结果 电磁辐射后即刻,大鼠肛温升高2.99℃,SAR值为8.66 W/kg.大鼠小脑PKC的活性在电磁辐射后即刻显著降低;GluR2的表达水平在各观察时间点均无显著变化,但GluR2的磷酸化水平在电磁辐射后即刻显著降低,其他观察时间点无显著变化.结论 电磁辐射能够显著降低大鼠小脑PKC的活性和GluR2的磷酸化水平,从而对运动性学习记忆的神经信号传导通路产生损伤效应.
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使用交联剂DMP消除免疫沉淀非特异性条带
目的 消除免疫沉淀技术中免疫印迹检测到的非特异性条带,排除非特异性条带对研究蛋白质分子相互作用及磷酸化的干扰.方法 检测蛋白交联剂庚二亚氨酸二甲酯(DMP)交联抗体和载体基质的稳定性及交联效果;积极寻找和优化抗原析出条件,分离出免疫沉淀复合物中抗原成分;检测析出抗原特异性条带及磷酸化水平.结果 DMP有效地将抗体共价结合于载体基质,具有较好的稳定性和交联效果,其免疫沉淀中未检测到非特异性蛋白条带;与Laemmli缓冲液相比,甘氨酸可有效地一次性析出免疫沉淀中大部分抗原;经pH值调整后,析出抗原的浓度及磷酸化水平无明显变化.结论 交联剂DMP能有效地消除传统免疫沉淀技术中检测到的非特异性蛋白条带,且能应用于蛋白质磷酸化的检测.
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氧化应激与动脉粥样硬化
活性氧是细胞内多种氧化还原反应的正常代谢产物,但是 ,当活性氧的生成速率大于清除速率时,即造成活性氧的蓄积.过多的活性氧除直接损伤细胞外,还可通过信号转导系统调控某些基因的表达,并引发一系列病理生理过程.在心血管系统中,各种氧化物前体可刺激血管细胞产生活性氧,后者通过介导低密度脂蛋白氧化、促进细胞内多种蛋白质磷酸化及转录因子活化而激活炎症相关基因的表达,进而加速动脉粥样硬化的形成和发展.
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人UREB1基因克隆及其在肿瘤组织中的分布
目的：大鼠 UREB1基因编码的蛋白质能特异性地结合位于强吗啡基因启动子上游的一段 DNA序列 (upstream regulatory element,URE)。早期研究证实 UREB1对强吗啡基因启动子的转录具有促进作用，而对 p53的转录激活作用具有抑制效应。本实验目的就是克隆人 UREB1基因，探索其与肿瘤发生发展的关系。方法：利用人工合成寡核苷酸探针从人脑 cDNA文库中筛选人 UREB1基因，应用大肠杆菌表达的重组蛋白质制备的抗体检测肿瘤组织中 UREB1的表达分布。结果：获得了人 UREB1基因，核苷酸序列在对应区域及氨基酸序列与大鼠 UREB1基因 cDNA序列和氨基酸序列皆有 91％的同源性。在各种肿瘤组织中都有 UREB1的表达，但是表达水平及定位不一样。初步发现有这样一个规律，随着肿瘤的恶性程度增加 UREB1在核内的聚集程度增加。 UREB1的酪氨酸磷酸化分析结果显示，肿瘤恶性程度高， UREB1的酪氨酸磷酸化程度高。结论： UREB1可能参与肿瘤的发生发展，其酪氨酸磷酸化水平可以影响肿瘤的恶性程度。
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双色红外荧光技术在蛋白磷酸化检测中的应用
目的通过与化学发光法比较,了解双色红外荧光技术在目标蛋白磷酸化检测中的优势.方法分别取内毒素休克小鼠不同时间肺组织,制备组织匀浆蛋白样品.用SDS-PAGE电泳分离后转膜,将膜分别与磷酸化的或/和总的p42/44 MAPK抗体孵育,二抗用耦联有Alexa Fluor 680和IRDye 800的荧光抗体或辣根过氧化物酶抗体,通过双色红外荧光系统和化学发光法进行蛋白质磷酸化检测.结果红外荧光检测技术和化学发光检测结果均显示内毒素处理后小鼠肺组织p42/44 MAPK磷酸化水平发生了改变,1 h高,12 h以后逐渐恢复到接近正常水平.两种方法检测结果显示了较好的一致性,相比之下双色红外荧光技术具有更高的灵敏度、操作方便、节省时间及可以同时检测两种蛋白等优点.结论双色红外荧光技术在蛋白磷酸化的检测方面具有较好的应用前景.
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蛋白质磷酸化修饰在多聚谷氨酰胺疾病中的研究进展
多聚谷氨酰胺(polyglutamine,polyQ)疾病是一大组常见的神经退行性疾病,疾病的发生源于致病基因编码区CAG三核苷酸重复扩展突变导致基因的编码蛋白--polyQ蛋白产生多聚谷氨酰胺扩展突变.polyQ疾病的发病机制目前虽然尚未得到完全阐明,但越来越多的研究表明蛋白质的磷酸化修饰在亨廷顿舞蹈病、齿状核红核苍白球路易氏体萎缩症、延髓脊肌萎缩症、遗传性脊髓小脑型共济失调1型、遗传性脊髓小脑型共济失调3型/马查多.约瑟夫病等疾病的发生发展中发挥了重要的作用.
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磷酸化标签方法检测异染色质蛋白1αDNA损伤后蛋白磷酸化状态
目的 通过检测异染色质蛋白1α (HP1α)在DNA损伤后的磷酸化状况,介绍一种用磷酸化标签(phos-tag)试剂检测磷酸化蛋白质的新方法.方法 取雄雌C57小鼠交配后孕13.5 d胚胎,分离并原代培养小鼠胚胎成纤维细胞.对照组及实验组(6个损伤时间点)各取2个100mm培养皿的细胞进行实验,实验组细胞用喜树碱进行DNA损伤；对照组用等量的二甲基亚砜处理.用掺入phos-tag的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白并转印,将膜用抗HP1α的抗体孵育,用偶联辣根过氧化物酶的抗体做二抗,通过成像系统检测蛋白.结果 实验组存在一条与HP1α有明显不同迁移率的磷酸化HP1α条带,与对照组相比DNA损伤后磷酸化HP1α含量一过性增多.结论 HP1α被DNA损伤诱导为磷酸化状态,提示其可能在DNA修复过程中扮演重要角色.Phos-tag蛋白质印迹法可采用普通抗体检测磷酸化的蛋白,是一种简便易行的检测未知磷酸化蛋白质的新方法.
